一株橡膠樹根際促生菌株hbrm-86及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種產(chǎn)氣腸桿菌HBRM-86及其作為橡 膠樹根際促生菌株的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 天然橡膠是一種以聚異戊二烯為主要成分的天然高分子化合物，分子式是（C5H 8) n，其成分中91-94%是橡膠烴（聚異戊二烯），其余為蛋白質(zhì)、脂肪酸、灰分、糖類等非橡膠 物質(zhì)。通常我們所說的天然橡膠，是指從巴西橡膠樹上采集的天然膠乳，經(jīng)過凝固、干燥等 加工工序而制成的彈性固狀物。天然橡膠是應(yīng)用最廣的通用橡膠，目前，天然橡膠是和鋼 鐵、石油、煤炭并列的我國四大工業(yè)原料之一，工業(yè)需求量十分龐大。
[0003] 當(dāng)前，世界上99%的天然橡膠來自巴西橡膠樹，研究表明，制約天然橡膠產(chǎn)量的主 要因素之一即是橡膠樹死皮現(xiàn)象。當(dāng)前對橡膠樹死皮的研究一直在進行當(dāng)中，生理學(xué)家和 病理學(xué)家為尋求割膠樹的死皮原因及其防治方法，做了大量的工作，但至今仍沒有切實有 效的防控措施能夠遏制割膠樹死皮日趨嚴(yán)重的態(tài)勢。于是，進一步提升橡膠樹的生產(chǎn)能力 成為了提高天然橡膠產(chǎn)量的主要有效趨勢。
[0004] Lorenz Hiltner首先于1904年提出了植物根際（也稱根圈）促生菌（Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)的概念，他指出植物根際促生菌是指緊密環(huán)繞 植物根的區(qū)域，對于植物有促生作用的微生物。在豆科植物中最先表述了細菌與根系的這 種特殊關(guān)系，此區(qū)域是植物生物、化學(xué)和物理特性最容易受到影響的區(qū)域。目前對于PGPR 的研究主要集中在農(nóng)作物病害防治與促生增產(chǎn)方面。吉云秀等人從鹽生植物根際土中分 離得到 4 株含 ACC(l-aminocyclopropane-1-carboxylic acid，ACC)脫氨酶的 PGPR，考察 其對燕麥初生苗鹽分脅迫下的促生效應(yīng)，結(jié)果表明隨鹽分的升高，促生作用增大；張越己等 從麻風(fēng)樹根際分離具有ACC脫氨酶活性的菌株，芽孢桿菌屬菌株KLBMP4802、KLBMP4809、 KLBMP4804，窄食單胞菌屬的KLBMP482、糞產(chǎn)堿桿菌屬的菌株KLBMP4806、KLBMP4816和節(jié) 桿菌屬的KLBMP4810、KLBMP4814都具有較強的促生長潛在性，這也擴大了已知的具有潛在 促生長作用的細菌種屬范圍；張英以西藏阿里地區(qū)高寒草原四種牧草為研究對象，發(fā)現(xiàn)優(yōu) 良PGPR菌株以假單胞屬和桿菌屬為主且可以植物根際成功定殖，對植物促生效果顯著；李 鳳汀等從植物根際土壤中分離到的硅酸鹽細菌HM8841，能夠使可利用鉀含量達到原硅酸 鹽中含量數(shù)倍，并對不同土壤上生長的不同農(nóng)作物的生長均表現(xiàn)出較好的促進作用；安永 輝以紫花苜蓿幼苗為研究對象，發(fā)現(xiàn)根際細菌CS1、CS2、CS3、CS4、CS5、CS6處理后，幼苗 的生理指標(biāo)（生物量、葉綠素、丙^酸、超氧化物岐化酶等）均有所提尚；Zahir等從婉?、 小麥和玉米的根際土壤中篩選出3株含ACC脫氨酶的假單胞菌，并檢測它們對植物抗旱性 的影響，結(jié)果表明這3株菌能增強植株的抗旱能力；Ma等從Alyssum serpyllifolium和 Phleumphleoides的根際土壤中分離出5株具有Ni抗性PGPR，其中，相比較不加菌的對照 處理，SRA2菌株可使生長在含鎳450mg/kg的污染土壤中印度芥菜的鮮重和干重分別增加 351 %、285 % ;DorotaKrzyzanowska 等對馬鈴薯的根際菌株 Bacillus subtilisMB73/2， Pseudomonas sp. P482和Ochrobactrum sp. A44的定殖情況進行研究，發(fā)現(xiàn)它們可以有效的 定殖并促進馬鈴薯的生長;Abbasi等用細菌產(chǎn)IAA為指標(biāo)，從小麥根際篩選根際促生菌，并 在土壤種植的條件下發(fā)現(xiàn)篩選的菌株對小麥的生長具有促進作用；Khalid等篩選小麥的 根際促生菌，以期待通過促生菌來提高小麥作物的產(chǎn)量和生物防病能力。
[0005] 可見，盡管PGPR的促生機制還沒有定論，但是它多樣的促生作用以及促生效果已 然是已被廣泛接受的。研究表明，其促生機制主要包括以下四種途徑：（1)細菌和它的分 泌物幫助植物獲得充足的包括氮、鉀、磷、鐵等營養(yǎng)元素，以保證植物的最佳生長；（2)合成 植物生長調(diào)節(jié)劑（包括生長素、赤霉素、細胞分裂素等），促進植物生長；(3)通過抑制病原 微生物的生長，從而提高植物的抗病能力，間接地促進植物生長發(fā)育；(4)抑制植物體內(nèi)乙 烯的合成，利于植物定居成活以及根的伸長。根際促生菌的主要作用機制是在植物根際存 在有能產(chǎn)生ACC脫氨酶的細菌，這類細菌可以吸收、分解植物根系分泌出的ACC(乙烯的前 體），并利用其分解產(chǎn)物α - 丁酮酸和氨分別作為C源和N源，使根際的ACC濃度降低，進而 促使根系不斷的向外分泌ACC，從而降低根系中ACC和應(yīng)激乙烯的水平，減輕逆境下乙烯對 植物的傷害，促進植物的生長發(fā)育，提高作物產(chǎn)量。因此，以ACC脫氨酶為主要指標(biāo)來篩選 根際促生菌用以提高植物的抗逆性是個很有研究和應(yīng)用價值的方向?？梢姡么偕?實現(xiàn)天然橡膠產(chǎn)量的提升的關(guān)鍵在于篩選到合適的具有橡膠樹根際促生作用的菌株，也成 為解決天然橡膠產(chǎn)量問題的首選方式。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為此，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于篩選出能應(yīng)用于橡膠樹死皮防控的具有橡 膠樹根際促生作用的菌株，以解決天然橡膠產(chǎn)量制約的問題。
[0007] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一株產(chǎn)氣腸桿菌株，其分類命名為產(chǎn)氣腸桿 菌HBRM-86,已于2015年11月09號保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)，地址：中國 湖北省武漢市武昌區(qū)珞珈山武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，郵編：430072 ;其保藏編號為CCTCC M2015671。
[0008] 本發(fā)明還公開了一種培養(yǎng)所述產(chǎn)氣腸桿菌株的方法，包括在含有適宜碳源的TSB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述菌株的步驟。
[0009] 所述碳源包括乳糖、蔗糖、D-甘露醇或葡萄糖。
[0010] 所述TSB培養(yǎng)基中的氯化鈉濃度為2-10%。
[0011] 所述培養(yǎng)基的pH值為4-12。
[0012] 所述培養(yǎng)步驟的培養(yǎng)溫度為20-45 °C。
[0013] 本發(fā)明還公開了所述產(chǎn)氣腸桿菌株在促進橡膠樹幼苗生長中的應(yīng)用。
[0014] 本發(fā)明還公開了所述產(chǎn)氣腸桿菌株用于制備促進橡膠樹幼苗生長的微生物菌肥 的應(yīng)用。
[0015] 本發(fā)明還公開了一種促進橡膠樹幼苗生長的方法，包括按照上述培養(yǎng)方法進行培 養(yǎng)權(quán)所述菌株，并制得菌懸液的步驟。
[0016] 所述菌株的施用方式為菌懸液灌根處理。
[0017] 本發(fā)明以ACC脫氨酶為主要指標(biāo)，自橡膠樹根際土壤分離得到菌株HBRM-86,經(jīng)菌 落和形態(tài)的顯微觀察、染色反應(yīng)、常規(guī)生理生化特性試驗以及16s rDNA序列分析，具有以下 特征：①菌株呈直桿狀，革蘭氏染色陰性，周生鞭毛，兼性厭氧；②通過甲基紅實驗、V-P實 驗、苯丙氨酸脫氨酶實驗、過氧化氫酶實驗、氧化酶實驗、檸檬酸鹽生長實驗等生理生化指 標(biāo)，并結(jié)合《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》和《伯杰氏細菌鑒定手冊》，鑒定結(jié)果HBRM-86屬于產(chǎn) 氣腸桿菌屬，結(jié)果與分子鑒定一致。本發(fā)明所述產(chǎn)氣腸桿菌HBRM-86,保存于中國典型培養(yǎng) 物保藏中心，并且實驗證明，本發(fā)明篩選菌株產(chǎn)氣腸桿菌HBRM-86能夠有效的作為根際促 生菌株有助于橡膠樹幼苗的成長，有助于提高天然橡膠的產(chǎn)量。
[0018] 并且實驗顯示，本發(fā)明篩選得到的產(chǎn)氣腸桿菌HBRM-86具有一定的產(chǎn)IAA能力、具 有一定的解磷能力、具有一定的固氮能力，并且對不同抗生素具有適應(yīng)敏感性，為化學(xué)防治 打下基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0019] 為了使本發(fā)明的內(nèi)容更容易被清楚的理解，下面根據(jù)本發(fā)明的具體實施例并結(jié)合 附圖，對本發(fā)明作進一步詳細的說明，其中，
[0020] 圖1為產(chǎn)氣腸桿菌HBRM-86的菌落形態(tài)；
[0021] 圖2為本發(fā)明所述HBRM-86菌株的生長曲線圖；
[0022] 圖3為本發(fā)明所述HBRM-86菌株對橡膠樹幼苗的促生作用測試結(jié)果；其中，大寫字 母代表1 %水平差異極顯著，小寫字母代表5 %水平差異顯著；
[0023] 圖4為本發(fā)明所述HBRM-86菌株產(chǎn)IAA能力的定性測定結(jié)果；
[0024] 圖5為本發(fā)明所述HBRM-86菌株產(chǎn)IAA能力的定量測定結(jié)果；
[0025] 圖6為本發(fā)明所述HBRM-86菌株的嗜鐵能力測定結(jié)果；
[0026] 圖7為本發(fā)明所述HBRM-86菌株的解磷能力測定結(jié)果；
[0027] 圖8為本發(fā)明所述HBRM-86菌株的固氮能力測定結(jié)果。
【具體實施方式】
[0028] 實施例1菌株HBRM-86的分離、純化及其ACC脫氨酶活性測定
[0029] I. 1 采樣
[0030] 樣品為海南省東方市廣壩農(nóng)場的橡膠樹根際土壤，采樣時避開路邊，施肥溝，選取 無明顯環(huán)境影響（包括水源污染、人為影響）的林段根據(jù)對角線法進行布點。將采集的帶 有根際土壤的橡膠樹細根放入塑料袋內(nèi)并做好記錄。
[0031] 1.2菌株分離純化
[0032] L 2. 1樣品處理
[0033] 取5段大小約Icm的根放入50mL無菌水中，浸泡lOmin，輕微震蕩處理5min，制成 懸浮液備用。
[0034] 1. 2. 2菌株分離純化
[0035] 吸取ImL懸浮液加入到50mLPAF培養(yǎng)液中，28°C、200r/min條件下振蕩培養(yǎng)24h， 從其中吸取ImL菌懸液重復(fù)轉(zhuǎn)接1次，第2次菌懸液中轉(zhuǎn)移ImL至50mL DF培養(yǎng)液中，28°C、 200r/min條件下振蕩培養(yǎng)24h，然后從中吸取ImL菌懸液加入到50mL ADF培養(yǎng)液中，28°C、 200r/min條件下振蕩培養(yǎng)24h，用于ACC脫氨酶活性細菌的篩選。梯度稀釋ADF培養(yǎng)液中 的菌懸液，并涂布于ADF固體平板，28°C恒溫箱中培養(yǎng)，待長出單菌落后挑取單菌落分離純 化。將初步篩選出來的菌株繼續(xù)涂布于以ACC為唯一氮源的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)