Myosin9b蛋白特異性抗體的制備及Myosin9b基因家族變化在腫瘤診斷及預(yù)后中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中Myosin%蛋白特異性抗體的制備及Myosin%基因家 族變化在腫瘤診斷及預(yù)后中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 各種腫瘤在全世界各國仍然是首要的疾病致死原因，嚴重威脅人類健康（Cooke etal.，2014)。世界衛(wèi)生組織（WHO)公布的數(shù)據(jù)表明：在世界范圍內(nèi)，現(xiàn)在發(fā)病率最高的 癌癥是肺癌，2012年新增肺癌病例180萬，死亡人數(shù)159萬（化enetal.，2014)。肺癌 的死亡率W每年1~5 %的速度逐年增長，而且在發(fā)展中國家運一趨勢尤為明顯。根據(jù)美 國沈ER(Su;rveillance,EpidemiologyandE；ndResults)的資料顯不：美國肺癌患者確 診后的5年生存率為12%~15% ;歐洲為8~12% ;發(fā)展中國家為5~12%(Chenet al.，2014)。隨著吸煙人數(shù)的不斷上升和環(huán)境的持續(xù)惡化，肺癌發(fā)病率呈現(xiàn)出逐漸增高的趨 勢。目前，肺癌已成為我國首位惡性腫瘤死亡原因，占全部惡性腫瘤死亡的22. 7%(Sheet al.，2013)。且發(fā)病率和死亡率仍在繼續(xù)迅速上升。根據(jù)衛(wèi)生部全國腫瘤防治辦公室提供 的資料顯示：目前我國肺癌發(fā)病率每年增長26. 9%。如不及時采取有效控制措施，預(yù)計到 2025年我國肺癌患者將達到100萬，成為世界第一肺癌大國（Sheetal.，2013)。肺癌的 病因至今尚不完全明確。
[0003] 肺癌是一種發(fā)病率高，致死性強的惡性腫瘤（化sarreetal. , 2010 ;Spi;roand Silvestri，2005)。由于傳統(tǒng)的肺癌檢測方法特異性和靈敏性有限，因此并沒有降低肺癌的 病死率。近年來，腫瘤標志物由于其特異性和靈敏度高等特點，對腫瘤的診斷，治療及預(yù)后 判斷提供了指導(dǎo)意義（QiafferandWeinberg, 2011iRriedlandAlexander, 2011 ;Spi;ro andSilvestri，2005)。由于腫瘤發(fā)生發(fā)展過程的復(fù)雜性，腫瘤診斷及預(yù)后的檢測還有待發(fā) 展和完善。特別是高特異性的腫瘤標志物及其抗體介導(dǎo)的腫瘤診斷急需發(fā)展。
[0004] Myosin9 是非常規(guī)肌球蛋白家族（non-conventionalmyosinfamily)的一個成 員。在無脊椎動物中只含有單個Myosin9基因；而在脊椎動物中Myosin9含有兩個剪切體 形式：Myosin9a(Myo9a)和Myosin9b(Myo9b)。Myosin9蛋白含有頭，頸和尾Ξ部分（附圖 3中A)。頭部是一個單頭的motor結(jié)構(gòu)域，含有extension和insedion模序。Motor結(jié) 構(gòu)域具有ATP酶活性，與ATP結(jié)合后，使ATP轉(zhuǎn)化成ADP，釋放能量的同時促使Myosin9沿 著F-actin向前運動（Xiaoetal.,2010;vandenBoomet曰1.,2007)。頸部含有IQ結(jié) 構(gòu)域，是Myosin輕鏈的結(jié)合位點，在Myosin9運動中起著杠桿作用。Myosin9尾部有一個脯 氨酸富集區(qū)，一個鋒指模序和一個MioGAP(GTPaseactivationdomain)結(jié)構(gòu)域（Postet al.,1998)。Myosin9通過化oGAP區(qū)域下調(diào)化o依賴的信號通路。Myo9a主要在腦和睪丸 組織中表達，在上皮細胞分化中起重要作用化easmanandRidley, 2008)。而Myo9b在更廣 泛的組織中表達。有文獻報道，在巨隧細胞中，Myo9b調(diào)節(jié)巨隧細胞的形態(tài)和運動（Hanley etal. , 2010；Parsonsetal. , 2010；Wirthetal. , 1996)〇

【發(fā)明內(nèi)容】
陽0化]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何應(yīng)用申請人新發(fā)現(xiàn)的Myo9b基因及其有關(guān)技 術(shù)及產(chǎn)品對與Myo9b基因有變化腫瘤患者進行診斷檢測及預(yù)后分析，包括如何預(yù)測腫瘤患 者預(yù)后及相應(yīng)祀向治療。
[0006] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了檢測Myo9b基因是否改變或表達水平是 否變化或Myo9b基因表達水平的系統(tǒng)在制備診斷或輔助診斷腫瘤和/或預(yù)后或輔助預(yù)后產(chǎn) 品中的應(yīng)用； 陽007] 所述Myo9b的序列如序列表中序列1所示；
[0008] 所述Myo9b基因的核巧酸序列如序列2所示。
[0009] 上述應(yīng)用中，所述檢測Myo9b基因是否改變或表達水平是否變化可包括檢測外周 血，體液，疲液，糞便，尿液或組織分泌物或腫瘤組織中Myo9b基因的是否改變或表達水平 是否變化，檢測Myo9b基因是否改變或表達水平是否變化可采用W下技術(shù)：DNA測序、RNA測 序、基因忍片（microarray)分析或PCR-偶聯(lián)的核酸測序。
[0010] 上述應(yīng)用中，所述檢測Myo9b表達水平的系統(tǒng)可包括檢測Myo9b表達水平的試劑 和/或儀器，如通過免疫組織化學(xué)染色或酶聯(lián)免疫反應(yīng)檢測Myo9b表達水平所需的試劑和 儀器。具體來說，檢測Myo9b表達水平的系統(tǒng)可包括抗Myo9b的抗體和進行免疫組織化學(xué) 染色所需要的其它試劑和儀器，上述檢測Myo9b表達水平的系統(tǒng)可只由所述抗Myo9b的抗 體組成，所述抗Myo9b的抗體和進行免疫組織化學(xué)染色所需要的其它試劑均可獨立包裝； 檢測Myo9b表達水平的系統(tǒng)可包括所述Myo9b、所述抗Myo9b的抗體和進行酶聯(lián)免疫反應(yīng)所 需要的其它試劑和儀器，上述檢測Myo9b表達水平的系統(tǒng)可只由所述Myo9b和所述抗Myo9b 的抗體組成，也可只由所述Myo9b組成，也可只由所述抗Myo9b的抗體組成，所述Myo9b、所 述抗Myo9b的抗體和進行酶聯(lián)免疫反應(yīng)所需要的其它試劑均可獨立包裝。 W11] 上述應(yīng)用中，所述抗Myo9b的抗體可為Myo9b單克隆抗體和/或Myo9b多克隆抗 體。所述抗Myo9b的抗體可識別序列表中SEQIDNo. 1的蛋白質(zhì)。所述抗Myo9b的抗體可 為W序列1的第1691-1916位氨基酸所示的蛋白質(zhì)為抗原得到的抗體。所述抗Myo9b的抗 體可利用所述抗原免疫動物得到。所述動物可為兔（如新西蘭白兔）或鼠（如大鼠或小 鼠），豚鼠或其他大動物如驢，馬，豬，羊等。所述抗Myo9b的抗體也可通過人源或人源化抗 體表達系統(tǒng)得到。
[0012] 上述應(yīng)用中，所述抗Myo9b的抗體可為生物素或其他標記物標記[包括生物 影像標記物（可為生物巧光標記物），放射性物質(zhì)標記，納米產(chǎn)物標記，生物毒素等（如 lymphotoxin等）]的抗Myo9b的抗體。所述Myo9b的抗體也可為沒有生物素或其他標記物 標記的抗Myo9b的抗體。所述抗Myo9b的抗體可為標記物標記的抗Myo9b的抗體。
[0013] 上述應(yīng)用中，所述檢測Myo9b表達水平可為檢測所述Myo9b絕對表達水平或所述 Myo9b相對表達水平；所述Myo9b絕對表達水平為腫瘤組織中所述Myo9b的表達水平；所 述Myo9b相對表達水平為所述腫瘤組織中所述Myo9b的絕對表達水平與非腫瘤組織中所述 Myo9b的絕對表達水平的比值。
[0014] 上述應(yīng)用中，所述檢測Myo9b基因表達水平的系統(tǒng)可包括檢測Myo9b基因是否改 變或表達水平是否變化的試劑和/或儀器，如通過定量PCR檢測Myo9b基因表達水平所需 的試劑和/或儀器。具體來說，檢測Myo9b基因表達水平的系統(tǒng)可包括擴增所述Myo9b基 因全長或片段的引物對和定量PCR所需要的其它試劑和儀器，上述檢測Myo9b基因表達水 平的系統(tǒng)可只由所述引物對組成，所述引物對和進行定量PCR所需要的其它試劑均可獨立 包裝。
[0015] 所述引物對可為由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的引物對。
[0016] 定量PCR所需要的其它試劑可包括化izol、DNA酶I、寡聚引物（dT)和/或逆轉(zhuǎn) 錄酶（M-MLVRT)。所述Trizol具體可為Invitrogen產(chǎn)品，貨號為15596018。所述DNA酶 I具體可為肥