全自動核酸提取與pcr擴增微流控芯片及其應用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及核酸檢測領(lǐng)域。更具體地說，本發(fā)明涉及一種全自動核酸提取與PCR擴增微流控芯片及核酸提取與PCR擴增方法。
【背景技術(shù)】
[0002]流控芯片在核酸提取與PCR擴增中已經(jīng)有了很多應用，但大多數(shù)的應用還停留在實驗室階段。原因是為了實現(xiàn)血樣或組織的裂解、核酸綁定、清洗、洗脫等過程，這些核酸提取與PCR擴增微流控芯片上都集成有很多的微栗和微閥，增加了微流控芯片的復雜性、制造難度、成本，降低了可靠性。同時，外部驅(qū)動這些栗、閥所需要的設(shè)備和裝置也比較復雜，限制了這些芯片向臨床的應用。
[0003]由此，本發(fā)明摒棄現(xiàn)有核酸檢測PCR芯片上集成的栗和閥，提出利用旋轉(zhuǎn)器械的離心力作為驅(qū)動，并輔助以毛細力和虹吸現(xiàn)象來實現(xiàn)全部流體的功能操控。整個核酸提取、純化和PCR反應過程中的流體操控只需要一臺旋轉(zhuǎn)離心設(shè)備即可完成。整個微流控芯片上無任何集成的栗、閥設(shè)備，大大降低了芯片的制造難度和成本，并提高了芯片的可靠性，對于核酸提取與PCR擴增的臨床應用具有積極意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提出了一種利用離心力、毛細力以及虹吸現(xiàn)象來實現(xiàn)全自動核酸提取與PCR反應的微流控芯片，該微流控芯片上無任何集成的栗、閥設(shè)備，大大降低了芯片的制造難度和成本，并提高了芯片的可靠性。
[0005]為了實現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的這些目的和其它優(yōu)點，提供了一種全自動核酸提取與PCR擴增微流控芯片，包括至少一個主體，沿芯片圓周等距分布，所述主體包括:
[0006]核酸提取單元，其位于所述主體上，用于在離心力和毛細力的驅(qū)動下順序進行核酸的萃取、清洗、洗脫；
[0007]PCR擴增單元，其位于所述主體上，其與所述核酸提取單元通過三叉流道相連，用于PCR反應擴增；
[0008]廢液單元，其包括廢液腔體，與所述核酸提取單元通過三叉流道相連，用于存儲廢液；
[0009]以及排氣單元，其包括排氣孔和多條排氣流道，所述多條排氣流道與核酸提取單元、PCR擴增單元、廢液腔體連通，用于排放氣體。
[0010]優(yōu)選的是，所述核酸提取單元包括:
[0011]加樣裝置，其位于主體的左上端，所述加樣裝置包括加樣腔體及設(shè)置在加樣腔體上的加樣孔，所述加樣裝置用于加入和存放樣品與裂解液、綁定液的混合物；
[0012]清洗裝置，其位于主體的中上端，所述清洗裝置包括清洗液加樣孔和清洗液腔體，所述清洗裝置用于加入和存放清洗液；
[0013]洗脫裝置，其位于主體的右上端，所述洗脫裝置包括洗脫液加樣孔和洗脫液腔體，所述洗脫裝置用于加入和存放洗脫液；
[0014]以及核酸固相萃取裝置，其包括核酸固相萃取腔體，所述核酸固相萃取腔體內(nèi)設(shè)置有核酸固相萃取材料；
[0015]其中所述加樣腔體通過第一流道與所述核酸固相萃取腔體連通，所述清洗液腔體通過第二流道與所述核酸固相萃取腔體連通，所述洗脫液腔體通過第三流道與核酸固相萃取腔體所述連通。
[0016]優(yōu)選的是，所述PCR擴增單元包括:
[0017]核酸定量流道，其與核酸固相萃取單元通過三叉流道連通；
[0018]核酸定量腔體，其與核酸定量流道連通，用于定量核酸；
[0019]PCR反應腔體，其與核酸定量腔體通過第六流道連通，所述PCR腔體為封閉腔體，內(nèi)部放置有PCR反應所需引物及試劑；
[0020]以及多余核酸腔體，其與核酸定量流道連通，用于存儲多余的核酸。
[0021]本發(fā)明的另一個目的是提供全自動核酸提取與PCR擴增微流控芯片的應用方法，包括如下步驟；
[0022]步驟1):將全自動核酸提取與PCR擴增微流控芯片安裝在離心機上，再經(jīng)加樣孔向加樣腔體中加入樣品與裂解液、綁定液的混合物，向清洗液腔體中加入清洗液，向洗脫液腔體中加入洗脫液。
[0023]步驟2):順時針旋轉(zhuǎn)離心，轉(zhuǎn)速1200?1600rpm，時間3?5分鐘。樣品與裂解液、綁定液混合物將經(jīng)第一流道后進入固相萃取腔體，清洗液將經(jīng)第四流道、清洗液二級腔體、第三流道后既進入固相萃取腔體；而洗脫液將在離心力作用下進入洗脫液二級腔體中，溶液達到第二流道的虹吸管后，由于強大的離心力大于毛細力，洗脫液無法經(jīng)第二流道進入固相萃取腔體；
[0024]同時，由于第一流道相對于第三流道具有更低的流體阻力，可以使得在樣品與裂解液、綁定液的混合物完全流出固相萃取腔體時，清洗液依然沒有到達固相萃取腔體，進而實現(xiàn)萃取與清洗的順序執(zhí)行；
[0025]由于為順時針高速離心，在科里奧利力的作用下，使得樣品與裂解液、綁定液的混合物以及清洗液都將經(jīng)三叉流道流向廢液腔體，而不會流向核酸定量流道。
[0026]步驟3):速至0后逆時針低俗旋轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)速20?80rpm，時間20?60s，此時由于離心較小，使得洗脫液可以由毛細力充滿整個第二流道。
[0027]步驟4):逆時針高速離心，轉(zhuǎn)速1200?1600rpm，時間60?120s，在離心力的作用下，利用虹吸現(xiàn)象將洗脫液經(jīng)第二流道后流向固相萃取腔體，并在科里奧利力的作用下將洗脫完的核酸經(jīng)三叉流道后流向定量流道，并依次充滿核酸定量腔體，多余的核酸流入廢液腔體，完成核酸的洗脫；此時由于第六流道具有較小的橫截面尺寸，且PCR反應腔體為封閉腔體，使得離心力不足以克服第六流道的毛細力與樣品腔體的內(nèi)壓力，而核酸無法進入PCR反應腔體。
[0028]步驟5):進一步提高轉(zhuǎn)速，1800?2500rpm，時間20?40s，在更為強大的離心力作用下，洗脫完的核酸經(jīng)定量腔體后進入PCR反應腔體，并與PCRmix、引物的結(jié)合，在外部溫控的控制下完成PCR擴增，所述轉(zhuǎn)速優(yōu)選2500rpm。
[0029]優(yōu)選的是，所述PCR反應所需的試劑或引物包含PCRmix、PCR引物，所述試劑或者引物以凍干或風干形式存放于PCR反應腔體內(nèi)。
[0030]優(yōu)選的是，所述固相萃取腔體具有細長結(jié)構(gòu)，且長度方向指向芯片中心，以保證在離心力作用下，流體能有較少殘留；所述固相萃取腔體具有長方形橫截面，其等效直徑1mm?2mm，長度5mm?15mm ;所述固相萃取材料選自娃膠膜、娃膠柱中的一種。
[0031]優(yōu)選的是，所述清洗液腔體包括清洗液一級腔體和清洗液二級腔體，清洗液一級腔體和清洗液二級腔體通過第四流道連通，所述洗脫液液腔體包括洗液不會進入清洗液二級腔體，更不會進入第三流道，進而提前進入固相萃取腔體；所述方案增加了一個洗脫液二級腔體，此設(shè)計的優(yōu)點在于，由于第五流道的存在，在毛細力和表面張力的存在，洗脫液不會進入洗脫液二級腔體，更不會第二流道，進而提前進入固相萃取腔體。
[0032]優(yōu)選的是，所述第二流道為虹吸流道，所述洗脫液二級腔體經(jīng)虹吸流道連接到固相萃取腔體，此設(shè)計的優(yōu)點在于，由于虹吸流道的存在，使得在第一次順時針離心下，洗脫液不會經(jīng)虹吸流道提前進入固相萃取腔體；只有在第二次反向離心時，洗脫液才會經(jīng)虹吸流道進入固相萃取腔體；所述虹吸流道的等效直徑為0.8_?1.5mm,以保證其具有較小的流體阻力；所述虹吸流道距離芯片中心的最小距離小于洗脫液二級腔體距離芯片中心最小處的距離；所述第三流道具有局部增加流體阻力流道結(jié)構(gòu)，所述流道結(jié)構(gòu)具有較小的等效直徑，且為” S”型；所述第四流道和所述第五流道具有等效直徑0.4mm?0.8mm ;以保證其具有合適的毛細力和流體阻力，在靜止時溶液不會流出，在離心時溶液可以快速流出。
[0033]優(yōu)選的是，所述第六流道具有等效直徑0.1mm?0.2mm ;所述的加樣腔體具有體積500?800 μ 1 ;所述的清洗液腔體、清洗液二級腔體具有體積500?800 μ 1 ;所述的洗脫液腔體、洗脫液二級腔體具有體積150?200 μ 1 ;所述核酸定量腔體具有體積40 μ 1 ;所述PCR反應腔體具有體積35 μ 1。
[0034]優(yōu)選的是，本方案所述主體還可以具有多個清洗液一級腔體和清洗液二級腔體，以滿足可以用多種不同的清洗液進行清洗，或者更多量的同一種清洗液清洗；可以包含多個核酸定量腔體與PCR反應腔體，各個PCR腔體中放置有不同的核酸反應試劑，以便于檢測多個不同的靶標；本方案芯片可以包含多個這樣的核酸提取與PCR反應的結(jié)構(gòu)，以便于同時檢測幾個不同的樣本，其沿芯片圓周等距分布。
[0035]本發(fā)明所述芯片適用于可實現(xiàn)旋轉(zhuǎn)離心的設(shè)備上，利用旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的離心力與毛細力、虹吸現(xiàn)象，將加入樣品腔體的樣品與裂解液、綁定液混合物、加入清洗液腔體的清洗液、加入洗脫液腔體的洗脫液依次流經(jīng)固相萃取腔體，達到核酸裂解、吸附、洗脫的目的。洗脫完的核酸經(jīng)定量腔體定量后流入PCR反應腔體，并在這里與PCR試劑、引物、探測等進行結(jié)合完成PCR反應。
[0036]本發(fā)明至少包括以下有益效果:
[0037](1)本發(fā)明的微流控芯片利用離心力、毛細力以及虹吸現(xiàn)象來實現(xiàn)全自動核酸提取與PCR反應的，沒有集成微栗和微閥，使得其制造難度與成本相對于現(xiàn)有技術(shù)具有顯著降低，同時又提高了芯片的可靠性，對于提高芯片的產(chǎn)率和可靠性及檢測精度、降低制作成本具有重要意義；同時，本發(fā)明對核酸檢測進入臨床是一個推力，對于擴大核酸的臨床應用、改善現(xiàn)有的病毒、腫瘤檢測能力與效率，進而對于改善人們的醫(yī)療檢測條件、提高人民身體素質(zhì)具有非常積極的意義；
[0038](2)本發(fā)明的微流控芯片集核酸提取、PCR擴增為一體，方便了實驗操作，縮短了實驗時間。
[0039]本發(fā)明的其它優(yōu)點、目標和特征將部分通過下面的說明體現(xiàn)，部分還將通過對本閥門的研究和實踐而為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解。
【附圖說明】
[0040]圖1為本發(fā)明核酸檢測芯片結(jié)構(gòu)圖；
[0041]圖2為本發(fā)明核酸檢測芯片順時針與逆時針旋轉(zhuǎn)方向示意圖。
【具體實施方式】
[0042]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做進一步的詳細說明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說明書文字能夠據(jù)以實施。
[0043]應當理解，本文所使用的諸如“具有”、“包含”以及“包括”術(shù)語并不配出一個或多個其它元件或其組合的存在或添加。
[0044]結(jié)合圖1和圖2說明本實施方式，全自動核酸提取與PCR擴增微流控芯片，包括安裝孔2、定位槽3和4個主體1，主體1沿芯片