一株用于生產(chǎn)固定化堿性果膠酶納米微球的工程菌及其構(gòu)建方法與應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于固定化酶技術(shù)領(lǐng)域，設及一種一步法生產(chǎn)固定化堿性果膠酶的新方 法，特別設及一株用于一步法生產(chǎn)堿性果膠酶固定化納米微球的工程菌及其構(gòu)建方法與應 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 堿性果膠酶一般指聚半乳糖醒酸裂解酶巧.C. 4. 2. 2. 2,polygalac化ronate lyase,P化)，其最適抑值在8~10,可W在高抑條件下斷開果膠聚合物主鏈，產(chǎn)生不飽和 的寡聚半乳糖醒酸。該酶在工業(yè)領(lǐng)域是一種重要的新興酶類，廣泛應用于誘導植物抗病、果 膠廢水處理和咖啡茶的發(fā)酵等方面。近幾年研究發(fā)現(xiàn)堿性果膠裂解酶是一種重要的清潔生 產(chǎn)用酶，主要運用于紙漿漂白和紡織品的生物精煉等行業(yè)，通過酶解精煉替代傳統(tǒng)的紡織 精煉來解決環(huán)境和能源等問題，在質(zhì)量與環(huán)保方面都具有傳統(tǒng)工藝無法相比的優(yōu)點。隨著 堿性果膠裂解酶新用途的不斷出現(xiàn)，市場對該酶的需求量越來越大，因此，堿性果膠醋裂解 酶是近年國外研究的熱點課題。
[0003]為了提高堿性果膠酶的穩(wěn)定性，促進其重復使用，便于連續(xù)的工業(yè)化生產(chǎn)，堿性果 膠酶的固定化一直是人們關(guān)注的熱點。傳統(tǒng)的堿性果膠酶固定化方法主要包括：吸附法、包 埋法、共價鍵結(jié)合法、交聯(lián)法等。但傳統(tǒng)的固定化方法各有利弊：①吸附法雖制作條件溫和、 簡便、成本低，但酶與載體結(jié)合不牢，易脫落。②共價鍵結(jié)合法和交聯(lián)法雖然酶與載體結(jié)合 牢固，酶不易脫落，但反應條件較激烈，酶易失活，同時，制作手續(xù)亦較繁瑣。③包埋法雖未 受到化學反應影響，可W制得較高活力的固定化酶，酶也不易脫落，但將酶限制在一定的載 體內(nèi)，使酶與底物結(jié)合的范圍變小，影響了酶活性的發(fā)揮。同時，傳統(tǒng)的固定化工藝大致可 W分為=步：酶的分離提純，載體制備W及酶與載體的結(jié)合；工藝復雜，成本高，酶活力回 收率低。運些都限制了堿性果膠酶的工業(yè)化生產(chǎn)與應用。因此，探索廉價、高效、應用性強 的固定化堿性果膠酶生產(chǎn)的新方法，是打破目前固定化酶的技術(shù)瓶頸，解決固定化堿性果 膠酶工業(yè)化生產(chǎn)及應用的關(guān)鍵。
[0004] 聚徑基脂肪酸醋（polyhy化oxygdkanoates，PHA)是很多細菌在營養(yǎng)失衡的情況 下合成的一種細胞內(nèi)聚醋，球形，直徑約50~300皿，該球形的細胞內(nèi)聚醋由一個疏水的 PHA核屯、和由憐脂界膜及膜上嵌入或附著蛋白構(gòu)成。PHA合成酶地aC是PHA生物合成和納 米微球形成的關(guān)鍵酶，通過共價鍵與PHA分子主鏈合成末端相連，從而定位于PHA納米微球 的表面。
[00化]近年來，隨著分子生物學的發(fā)展，將外源功能蛋白與PHA聚合酶進行融合表達，在 重組微生物體內(nèi)就能合成表面帶有功能蛋白的納米微球復合體，運樣功能蛋白就高效地結(jié) 合到了納米微球表面，形成功能性微球。由于納米微球在微生物細胞內(nèi)是W單獨的包涵體 形式存在，因此通過細胞破碎和離屯、的方法就能簡便、有效地使其從細胞中分離并得到純 化。目前，通過將抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、生物活性多膚分子、抗原片段等與PHA聚合酶化aC的融 合表達，已成功制備了用于生物分離、蛋白純化、藥物傳遞、疾病診斷和酶的固定化的生物 活性微球，使其成為一種廉價、高效的蛋白固定化呈遞新技術(shù)。
[0006] 目前，利用該技術(shù)進行固定化堿性果膠酶的一步法生產(chǎn)還未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了克服現(xiàn)有固定化酶技術(shù)存在的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一株用于一步法 生產(chǎn)堿性果膠酶固定化納米微球的工程菌及其構(gòu)建方法與應用。
[0008] 本發(fā)明通過W下技術(shù)方案來實現(xiàn)： W09] 本發(fā)明公開了一株重組大腸桿菌菌株，該大腸桿菌菌株命名為E.COli化21A值E3)pABC-P化，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通生物中屯、，菌種保藏號 為CGMCCNO. 10911。
[0010] 本發(fā)明還公開了上述重組大腸桿菌菌株的構(gòu)建方法，包括W下步驟： W11] (1)將PHA前體合成酶基因地aAB、堿性果膠酶基因Pgl和連接膚linker的融合 基因Pg^linkerW及PHA合成酶基因地aC依次插入載體質(zhì)粒pCD抑uet-1中，構(gòu)建得到重 組質(zhì)粒pABC-P化；
[0012] (2)將重組質(zhì)粒pABC-P化轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.COli化21A值E3)，得到基因工程大腸 桿菌菌株E.COli化21A值E3)pABC-P化。
[0013] 堿性果膠酶基因Pgl選自枯草芽抱桿菌Bacillussubtilis。
[0014] PHA合成酶基因地aC來源于Ralstoniaeutro地a。
[0015] 步驟（1)構(gòu)建重組質(zhì)粒pABC-P化的具體操作包括如下步驟：
[0016] 1)利用PCR擴增得到PHA前體合成酶基因地aAB，然后采用限制性內(nèi)切酶切割載 體質(zhì)粒pCD抑uet-1和PHA前體合成酶基因地aAB，將PHA前體合成酶基因地aAB插入載體 質(zhì)粒pCD抑uet-1中，得到載體質(zhì)粒pAB;
[0017] 2)采用限制性內(nèi)切酶切割載體質(zhì)粒pAB和基因Pgl-Iinker，然后將基因 pg；L-linke;r插入質(zhì)粒pAB中，得到載體質(zhì)粒pAB-P化；
[0018] 3)利用PCR擴增得到地aC基因，然后采用限制性內(nèi)切酶切割載體質(zhì)粒pAB-P化和 基因地aC，將基因地aC插入載體質(zhì)粒pAB-P化中，得到重組質(zhì)粒pABC-P化。 陽019] 所述堿性果膠酶基因Pgl和連接膚linker的融合基因Pg^linker的核巧酸序列 如SEQ.ID.NO. 1所示；PHA合成酶基因地aC的核巧酸序列如SEQ.ID.NO. 2所示。
[0020] 本發(fā)明還公開了基于上述公開的重組大腸桿菌菌株一步法生產(chǎn)固定化生產(chǎn)堿性 果膠酶納米微球的方法，將重組大腸桿菌E.COli化21A值E3)pABC-P化菌株在礦物質(zhì)培養(yǎng) 基中進行誘導表達培養(yǎng)后，再經(jīng)分離提純，獲得堿性果膠酶納米微球。
[0021] 所述將重組大腸桿菌E.COli化21A值E3)pABC-P化菌株在礦物質(zhì)培養(yǎng)基中進行 誘導表達，具體操作為： 陽02引首先，將重組大腸桿菌E.COli化21A0E3)pABC-P化菌株在LB培養(yǎng)基中過夜培 養(yǎng)作為種子液，再按2 %的接種量將種子液接入裝有IOOmLMM培養(yǎng)基的SOOmLS角瓶中， 其中MM培養(yǎng)基另加入Ig/L的葡萄糖、lOOmg/L的Str巧tomycin和0. 2g/L的IPTG，30°C、 200rpm/min的條件下培養(yǎng)48小時；
[0023] 其中0. 5g/L的葡萄糖、Str巧tomycin及IPTG在培養(yǎng)開始時加入，另0. 5g/L的葡 萄糖在培養(yǎng)24小時后加入。
[0024] 所述分離提純，具體操作為：
[0025] 收集發(fā)酵液，離屯、，棄上清；用IOmM憐酸緩沖液對菌泥進行充分洗涂，再將菌泥重 懸于IOmM憐酸緩沖液中；然后，超聲破壁處理20分鐘；通過甘油密度梯度離屯、的方法從菌 體細胞裂解液中純化微球，并用50mM憐酸緩沖液對純化的微球進行充分洗涂，去除甘油殘 留；最后經(jīng)冷凍干燥得到堿性果膠酶固定化納米微球固體粉末。
[00%]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有W下有益的技術(shù)效果：
[0027] 本發(fā)明通過基因重組的方法構(gòu)建了一株重組大腸桿菌E.coli化21A值E3) pABC-P化，該重組大腸桿菌將目前工業(yè)上廣泛應用的堿性果膠酶基因融合到PHA合成酶基 因地aC的C末端上，并將此重組基因片段轉(zhuǎn)化至宿主菌中進行誘導表達，宿主菌體內(nèi)就能 合成表面帶有堿性果膠酶的納米微球復合體，運樣堿性果膠酶就有效地結(jié)合到了納米微球 表面，形成固定化堿性果膠酶，一步實現(xiàn)堿性果膠酶的固定化生產(chǎn)。該方法具有W下優(yōu)勢：
[0028] 1、避免了傳統(tǒng)方法的繁瑣工序，使生產(chǎn)成本大大減低；
[0029] 2、酶通過共價鍵與載體PHA相連，結(jié)合牢固，不易脫落；
[0030] 3、酶在生產(chǎn)的同時實現(xiàn)固定化，酶的空間結(jié)構(gòu)未受其他物理或化學因素破壞，制 得的固定化酶活力較高；
[0031] 4、酶連接在載體外部，酶與底物結(jié)合不受限，不影響酶活性的發(fā)揮；
[0032] 5、由于納米微球W單獨的包涵體形式存在于細胞內(nèi)，通過細胞破碎和離屯、的方 法就能使其從細胞中分離，分離提取步驟簡單、高效。 陽〇3引保藏說明
[0034] 本發(fā)明對所述的重組大腸桿菌E.COli化21A值E3)pABC-P化進行了下述保藏：
[0035] 保藏時間：2015年5月25日，保藏地點：中國，北京。北京市朝陽區(qū)北辰西路1 號院3號，中國科學院微生物研究所，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、 (CGMCC);保藏號為CGMCCNo. 10911。
[0036] 分類命名為：大腸埃希氏菌，Escherichiacoli。
【附圖說明】
[0037] 圖1為重組菌體內(nèi)一步合成堿性果膠酶固定化納米微球的模型圖；
[0038] 圖2為重組質(zhì)粒pABC-P化構(gòu)建的技術(shù)路線圖。
【具體實施方式】
[0039] 下面結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明做進一步的詳細說明，所述是對本發(fā)明的解釋而 不是限定。
[0040] 本發(fā)明提供的一步法生產(chǎn)堿性果膠酶生物固定化納米微球的方法。參見圖1，首 先堿性果膠酶基因P化通過一段連接膚融合到PHA合成酶基因地aC的N末端上，然后將此 重組基因片段轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中進行誘導表達，當PHA合成酶地aC在重組微生物體內(nèi)合成 PHA微球時，堿性果膠酶P化也跟著一起負載到了PHA微球表面，成為固定化的堿性果膠酶 納米微球一步實現(xiàn)堿性果膠酶的固定化生產(chǎn)。
[0041] 1、重組大腸桿菌菌株的構(gòu)建
[0042] I.IPCR擴增地aAB基因和地aC基因
[0043] 根據(jù)地HR68質(zhì)粒（含有來源于Ralstoniaeutropha菌株的地aABC基因簇，由 清華大學陳國強教授惠贈）中地aAB基因和地aC基因的DNA序列設計引物地aABEcoRI/ 地aABHind^I、phaCnosta;rt)(hoI/phaCstopAv;rII，分別擴增編碼PHA前體合成酶基 因地aAB和編碼PHA合成酶基因地aC。
[0044] 引物序列如下：
[0049] PCR反應體系（50iU) :5XSFBuffeHwithIOmMMgS〇4) :IOy1，dNTP MixQOmMeach):Ijil，地aABEcoRI/地aABHindIII:各Iyl或地aCnostartMiol/ phaCstopAvrII:各In1，PhantaSuperFidelityDNAPolymerase:0. 5yI， pBHR68:0. 3yI,DMSO:I. 5yI,孤Wupto50yI。
[0050] ?0?反應條件為：95°(：預變性5111111;95°(：變性3〇3,60°(：退火3〇3,72°(：延伸2111血 32個循環(huán)；72°C延伸5min。
[0051] I. 2人工合成堿性果膠酶基因pgl-linker。
[0052] 合成的Pgl基因序列參考NCBI中B.subtilispelgene(GenBank:X74880)，去掉 5'端的信號膚序列及3'端的終止密碼子序列，并在3'端末尾加上一段由36個堿基編碼的 12個氨基酸的柔性linker(GGGSGGGSGGGGS)，使Pgl基因和地aC基因用該linker連接在 一起。
[0053] 1. 3表達質(zhì)粒pABC-P化的構(gòu)建
[0054] 將擴增得到的地aAB基因片段用凝膠分離純化后，經(jīng)EcoRI、化ndIII酶雙酶切，同 時用EcoRI、化ndIII雙酶切表達載體pCD抑uet-1。雙酶切后的PCR產(chǎn)物和載體經(jīng)PCR產(chǎn)物 純化試劑盒（generay，GK2051)回收。將回收到的PCR產(chǎn)物和表達載體22°C連接化，構(gòu)建 表達載體pAB，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌D冊a感受態(tài)細胞，挑取陽性轉(zhuǎn)化子，并對陽