釘合eIF4E相互作用肽的制作方法
【專利說明】巧合elF化相互作用化
[0001] 相關(guān)申請的交叉參考
[0002] 本申請要求2013年3月21日提交的新加坡申請?zhí)?01302065-6和2014年1月 15日提交的新加坡申請?zhí)?01400336-2的優(yōu)先權(quán)的權(quán)益，運(yùn)兩個新加坡申請的內(nèi)容出于所 有目的在此W引用方式整體并入。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域并且設(shè)及交聯(lián)膚和其藥學(xué)用途。
【背景技術(shù)】
[0004] 人真核翻譯起始因子4E(eIF4巧通過結(jié)合見于mRNA的5'端處的帽結(jié)構(gòu)（m^GT巧 來起始帽依賴性翻譯。eIF4F常常在大量的癌癥中過表達(dá)并且通過失調(diào)的帽依賴性翻譯導(dǎo) 致致癌蛋白質(zhì)的翻譯增加。eIF4E:eIF4G相互作用的抑制劑代表了一種將使癌細(xì)胞中的帽 依賴性翻譯正?；目尚蟹椒ā?br>[0005]mRNA被假定彼此競爭與eIF4F(真核翻譯起始因子4巧蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)合，用于遞 送到核糖體和后續(xù)翻譯。eIF4F與40S核糖體亞單位和eIF3形成復(fù)合物。該復(fù)合物沿著 mRNA的5'-非翻譯區(qū)（5' -UTR)穿梭直到它到達(dá)AUG起始密碼子。多數(shù)細(xì)胞mRNA的非結(jié) 構(gòu)化的短5' -UTR使得含eIF4E的復(fù)合物能夠針對翻譯起始密碼子（AUG)進(jìn)行有效地掃 描。相比之下，原癌mRNA(例如細(xì)胞周期蛋白DLVEG巧的典型的富含G+C的高度結(jié)構(gòu)化的 長5' -UTR妨礙起始復(fù)合物識別AUG起始密碼子并且導(dǎo)致mRNA被差翻譯。當(dāng)被過表達(dá)時 或當(dāng)eIF4F復(fù)合物未被正確調(diào)節(jié)時，eIF4E通過使具有高度結(jié)構(gòu)化的5'UTR的mRNA的翻譯 能夠增加而促成惡性。
[0006] 最近的報道已經(jīng)表明小分子利己韋林（ribavirin)可干擾eIF4E:帽相互作用，因 此可作為eIF4E-祀向療法呈現(xiàn)一種臨床機(jī)會。如所預(yù)期的，利己韋林治療選擇性地降低關(guān) 鍵的eIF4E依賴性蛋白質(zhì)如細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)并且抑制腫瘤生長。然而，利己韋林實(shí) 際上是否結(jié)合eIF4E是有爭議的。因此，用于研發(fā)eIF4E:7-甲基鳥巧帽相互作用的小分子 抑制劑的更定向的方法可能是用于研發(fā)eIF4E-特異性小分子療法的富有成效的方法。迄 今為止，eIF4E-帽相互作用的此類藥物樣抑制劑還沒有被報道。
[0007] 因此，需要提供對eIF4E具有親和力的新膚，其克服或至少改善一個或多個上述 缺點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 下文描述了與人eIF4E的一部分有關(guān)的交聯(lián)膚。運(yùn)些交聯(lián)膚含有至少兩個一起 形成內(nèi)部交聯(lián)（還被稱作釘合體（staple))的經(jīng)修飾的氨基酸，該內(nèi)部交聯(lián)可幫助穩(wěn)定 eIF4Gl的一部分的α-螺旋二級結(jié)構(gòu)，該α-螺旋二級結(jié)構(gòu)被認(rèn)為對于eIF4E與eIF4G的 結(jié)合是重要的。因此，本文所述的交聯(lián)膚相對于相應(yīng)的未交聯(lián)的膚可具有改進(jìn)的生物活性。 交聯(lián)的eIF4Gl膚被認(rèn)為干擾eIF4Gl與eIF4G的結(jié)合，由此抑制具有高度結(jié)構(gòu)化的5'UTR 的mRNA的翻譯增加。本文所述的交聯(lián)的eIF4Gl膚可被治療性地用于例如治療或預(yù)防受試 者的各種癌癥。例如，特征在于不期望地高水平或高活性的eIF4E的癌癥或其它病癥和/ 或特征在于不期望地高水平活性的含eIF4E的復(fù)合物的癌癥或其它病癥。
[0009] 因此，在第一方面，提供了一種分離膚，其包含如下氨基酸序列或由如下氨基酸序 列組成：
[0010]K'K"RYXaaiXaa2Xaa3Xaa4L?L'°Xaa5Xaa6Xaa7Xaa8Xaag(SEQIDNO:21)
[0011] 其中：
[0012]Xaai選自由S(絲氨酸）、氨基異下酸和非天然氨基酸組成的組；
[0013]Xaa2選自由R(精氨酸）、氨基異下酸和非天然氨基酸組成的組；
[0014]Xaa3選自由E(谷氨酸）、氨基異下酸和非天然氨基酸組成的組；
[0015]Xaa4選自由F(苯丙氨酸）、Q(谷氨酷胺）、A(丙氨酸）、氨基異下酸和非天然氨基 酸組成的組；
[0016]Xaas選自由G、氨基異下酸和非天然氨基酸組成的組；
[0017]Xaae選自由F(苯丙氨酸）、L(亮氨酸）、氨基異下酸、2-氨基下酸和非天然氨基酸 組成的組；
[0018]Xaa,不存在或選自由Q(谷氨酷胺）、氨基異下酸和非天然氨基酸組成的組；
[0019] Xaas不存在或選自由F(苯丙氨酸）、氨基異下酸和非天然氨基酸組成的組；
[0020] Xaag不存在或選自由氨基異下酸和非天然氨基酸組成的組；
[00引]其中所述膚包含至少一個將Xaai、Xaa2、Xaa3或X曰曰4與X曰曰5、X曰曰6、X曰曰7、X曰曰8或Xaag連接的膚交聯(lián)體。
[0022] 在第二方面，提供了一種分離膚，其包含如下氨基酸序列：
[0023]K'K"RYS?R?XaaiXaa2L?L'°Xaa3Xaa4(SEQIDNO:22)
[0024]其中：
[00巧]Xaai選自由E(谷氨酸）、氨基異下酸和非天然氨基酸組成的組；
[0026]Xaa2選自由F(苯丙氨酸）、Q(谷氨酷胺）、A(丙氨酸）、氨基異下酸和非天然氨基 酸組成的組；
[0027]Xaa3選自由G、氨基異下酸和非天然氨基酸組成的組；
[0028]Xaa4選自由F(苯丙氨酸）、L(亮氨酸）、氨基異下酸、2-氨基下酸和非天然氨基酸 組成的組；
[0029] 其中所述膚包含至少一個將Xaai或Xaa2與Xaa3或Xaa4連接的膚交聯(lián)體。
[0030] 在第Ξ方面，提供了一種分離的核酸分子，其編碼KKRYSRE化LGF(SEQIDNO: 1)且 經(jīng)修飾W獲得任一種本文所述的膚。
[0031] 在第四方面，提供了一種包含如上文所述的核酸分子的載體。
[0032] 在第五方面，提供了一種包含如本文所述的核酸分子或載體的宿主細(xì)胞。
[0033] 在第六方面，提供了一種包含如本文所述的膚或如本文所述的分離的核酸分子或 如本文所述的載體的藥物組合物。
[0034] 在第屯方面，提供了本文所公開的膚在制造用于治療或預(yù)防癌癥的藥劑中的用 途。
[0035] 在第八方面，提供了一種治療或預(yù)防患者的癌癥的方法，其包括施用藥物有效量 的本文所公開的膚或本文所公開的分離的核酸分子或本文所公開的載體。
【附圖說明】
【附圖說明】 [0036] 了所公開的實(shí)施方案并且用于解釋所公開的實(shí)施方案的原理。然而，應(yīng) 當(dāng)理解，附圖僅用于說明的目的，而不是作為本發(fā)明范圍的定義。
[0037] 圖1顯示來自W下模擬的代表性瞬態(tài)圖（snapshot) :A)sTIP-01:eIF4E，其顯示 F8由于空間封閉而產(chǎn)生的位移。被空間封閉的F8側(cè)鏈圍繞X-2扭轉(zhuǎn)角旋轉(zhuǎn)并且相對于 eIF4E的表面相當(dāng)有利地將自身隱匿。F8側(cè)鏈現(xiàn)在阻礙Y4維持與P38的主鏈幾基的保守 氨鍵，使Y4'翻出'且變得更加暴露于溶劑，由此降低其對膚：蛋白質(zhì)相互作用的能量貢獻(xiàn)。 B)TIP-01:eIF4E，其強(qiáng)調(diào)運(yùn)里沒有發(fā)生F8的此類構(gòu)象變化，解釋了對膚：蛋白質(zhì)相互作用 的更高能量貢獻(xiàn)和因此更高的Kd。C)sTIP-02:eIF4E，其顯示與用1，i+4釘合體代替F8和 F12相關(guān)的變化。其顯示釘合體與所述蛋白質(zhì)相互作用并且有利地促成了結(jié)合。然而，親 和力改進(jìn)的缺乏表明釘合的膚并未最佳地替代F8和F12的影響。D)TIP-02:eIF4E，其說明 Y4填充入先前被F8占據(jù)的空間中。Y4經(jīng)歷了構(gòu)象變化并且擠入先前被線性膚中的F8和 sTIP-02中的釘合體占據(jù)的空間中。運(yùn)導(dǎo)致Y4氨鍵的損失并且削弱了相互作用能量，雖然 L9:W73h-鍵保持不受運(yùn)些新的相互作用影響
[003引圖2A)描繪了與eIF4E復(fù)合的eIF4Gl°5^太的晶體結(jié)構(gòu)（PDBID:4AZA)。檢查結(jié) 合eIF4E的eIF4G°5s膚的晶體結(jié)構(gòu)W確定釘合體的插入位點(diǎn)。酪氨酸燈4)參與了與eIF4E 的多種范德瓦爾（vanderWaal)接觸W及其側(cè)鏈徑基與eIF4E的P38的幾基主鏈之間的 h-鍵。亮氨酸化9)在eIF4E的表面上產(chǎn)生淺穴并且通過其主鏈與色氨酸的嗎I噪之間的 h-鍵與eIF4E的W73相互作用。保守的疏水殘基（L10)擠壓eIF4E的L131和L135。與 eIF4E復(fù)合的兩種膚的晶體結(jié)構(gòu)是大約50%α-螺旋的；然而，它們在溶液中含有可忽略的 螺旋含量。蛋白質(zhì)W表面顯示并且膚W卡通圖示顯示。來自所述膚的所有殘基均W棒顯示 且被標(biāo)記。呈現(xiàn)了Υ4:Ρ38和L9:W73之間的氨鍵。
[003引圖2B)是來自與eIF4E復(fù)合的eIF4Gl°5s的計(jì)算機(jī)模擬的代表性瞬態(tài)圖，其顯示Υ4:Ρ38之間缺乏穩(wěn)定氨鍵，如即使在沒有通過sTIP-01的構(gòu)象變化對該相互作用施加的破 壞的情況下也在晶體結(jié)構(gòu)中所觀察到的。
[0040] 圖2C)在上圖中分別顯示與eIF4E相互作用的sTIP-01膚、sTIP-02膚和sTIP-03 膚的模型中的所有3種連接。下圖顯示被合并到膚序列中的控連接的結(jié)構(gòu)。釘合體W澄 色顯示。Xr=(時-2-(4'-戊締基）丙氨酸并且Xs= (S)-2-(4'-戊締基）丙氨酸。與 eIF4E相互作用的膚通過7位與11位之間、8位與12位之間、8位與11位之間、7位與14 位之間、6位與13位之間、5位與12位之間或8位與15位之間的I，1+4、1，1+3或I，I巧連 接被釘合。
[0041] 圖3描繪來自W下模擬的代表性瞬態(tài)圖：A)sTIP-03:eIF4E復(fù)合物，其顯示 Υ4:Ρ3她-鍵的形成W及用Y4和F12對冊7的擠壓。受約束的C-末端F12主要擠壓冊7， 冊7還與Υ4形成范德瓦爾斯接觸。Β)TIP-03eIF4E復(fù)合物，其說明類似于sTIP-03與eIF4E 的結(jié)合模式的結(jié)合模式。構(gòu)象更不穩(wěn)定的二AIB類似物膚θ?Ρ-03)與eIF4E的締合的特 征在于F12、冊7與Y4之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)，其類似于sTIP-03中的相互作用網(wǎng)絡(luò)。
[004引圖4顯示來自W下模擬的代表性瞬態(tài)圖：A)sTIP-01?:eIF4E，其描繪了"在內(nèi)"構(gòu) 象狀態(tài)，其中它與Υ4和F12形成堆疊相互作用并且不存在Υ4:P3她-鍵。B)TIP-01?:eIF4E， 其顯示冊7與Υ4有利地相互作用并且它們?nèi)狈εcF12的相互作用。sTIP-01?和 TIP-01?的模擬掲示Y4、冊7和F12之間的相互作用模式影響Υ4:Ρ3她-鍵的穩(wěn)定性。C) sTIP-01"2&:eIF4E復(fù)合物，其掲示通過引入釘合體，改變2ΑΒ的相互作用，使冊7和F8的擠 壓顯著地改變。D)TIP-01"2&:eIF4E，其顯示冊7與Y4有利地相互作用，但F8由于2AB的 相互作用而旋轉(zhuǎn)，從而擠壓eIF4E。Υ4:Ρ3她-鍵在sTIP/TIP-01F12&衍生膚的模擬中保持高 度穩(wěn)定。在TIP-01F12&中，C-末端2AB不與冊7形成相互作用。而是，冊7與Y4形成疏水 相互作用并且不破壞h-鍵。1，i+4釘合體的并入通過約束所述螺旋的C-末端區(qū)域來誘導(dǎo) 通過所述膚形成的相互作用的構(gòu)象變化。運(yùn)使2AB主要與冊7相互作用，冊7進(jìn)而與F8堆 疊，導(dǎo)致與eIF4G°5s中的類似的結(jié)合模式。
[004引圖5A)是sTIP-04:eIF4E的晶體結(jié)構(gòu)的圖示，其顯示為1. 5截止值的所述膚配體 的2FO-FC圖。S5側(cè)鏈與Q8側(cè)鏈和膚螺旋的第一轉(zhuǎn)角上的主鏈酷胺形成相互作用網(wǎng)絡(luò)，由 此使被結(jié)合的復(fù)合物穩(wěn)定。模擬顯示兩種衍生膚（sTIP-04和TIP-04)中的L9:W73氨鍵都 非常穩(wěn)定。
[0044] 圖5B)描繪TIP-04:eIF4E復(fù)合物的代表性瞬態(tài)圖，其說明Q8:S5相互作用網(wǎng)絡(luò)的 維持、Υ4:Ρ3她-鍵的存在W及H37對L12的更佳擠壓。在TIP-04中，H37、L12和Y4的最佳 擠壓不破壞保守的氨鍵。在釘合的衍生物中，由于釘合體固定C-末端，因此H37與L12形 成更有利的范德瓦爾斯接觸，運(yùn)使Y4經(jīng)歷轉(zhuǎn)變而維持有利的擠壓。如可由Y4的能量貢獻(xiàn) 看出的運(yùn)一有利的擠壓重排使Y4:P3她-鍵減弱。
[0045] 圖6顯示TIP和sTIP變體膚的圓二色譜。CD譜掲示釘合體在sTIP-01中比在 TIP-01中或在eIF4G°ss中誘導(dǎo)更大的螺旋度。
[0046] 圖7是顯示sTIP-01計(jì)算機(jī)模擬中的F8側(cè)鏈的化i2(x2)角的圖。sTIP-01中的 共價釘合體施加α-螺旋中的剛性，從而增加了在H37、F8與F12之間形成的相互作用網(wǎng)絡(luò) 上的張力。運(yùn)導(dǎo)致F8的空間封閉，使一系列的構(gòu)象變化沿膚：蛋白質(zhì)界面?zhèn)鞑?。被空間封 閉的F8側(cè)鏈圍繞X2扭轉(zhuǎn)角旋轉(zhuǎn)并且相當(dāng)有利地將自身隱匿。
[0047]圖8顯示來自與eIF4E復(fù)合的STIP-01F8A的計(jì)算機(jī)模擬的代表性瞬態(tài)圖，其說明 H37處于'外部'位置，Y4占據(jù)由于Y8A突變而留出的空間并且F12擠壓Y4。H37可見于替代 性的'在內(nèi)'狀態(tài)中并且構(gòu)象變化導(dǎo)致h-鍵的罕見形成。因此，冊7和F12影響Υ4:Ρ3她-鍵 的穩(wěn)定性。
[0048] 圖9顯示來自Α)與eIF4E復(fù)合的sTIP-OlTr和Β)與eIF4E復(fù)合的TIP-OlTr的 計(jì)算機(jī)模擬的代表性瞬態(tài)圖，其顯示當(dāng)去除C-末端F12時，產(chǎn)生F8、Y4和H37的擠壓相互 作用的截然不同的重排，運(yùn)取決于是否存在大環(huán)連接。
[0049] 圖10顯示來自W下模擬的代表性瞬態(tài)圖：從兩種不同構(gòu)象起始的 sTIP-04:eIF4E。A)源自eIF4E°ss(PDBID:4AZA)復(fù)合結(jié)構(gòu)的起始狀態(tài)和B)從 eIF4E:sTIP-04晶體結(jié)構(gòu)（PDBID:4BEA.PDB)開始的模擬。兩種模擬總體上良好的相互一 致，各自在分子內(nèi)/分子間的相互作用方面顯示相同的結(jié)構(gòu)特征，所述相互作用設(shè)及Q8-S5 相互作用網(wǎng)絡(luò)、L12的最佳擠壓和Υ4:Ρ38氨鍵的喪失。
[0050]圖11是匯總模擬系統(tǒng)內(nèi)的膚殘基的總自由能分解的表（表3)。
[0051] 圖12Α是表示MDA-MB-468和MDA-MB-231細(xì)胞中的歸一化發(fā)光相對于釘合膚的增 加濃度的點(diǎn)圖。將MDA-MB-468和MDA-MB-231細(xì)胞溶解并且將巧光素酶蛋白質(zhì)添加到溶解 細(xì)胞中。隨后，將所述細(xì)胞與所示濃度的S-TIP03和對照釘合膚解育，顯示S-TIP03W劑量 依賴方式降低細(xì)胞活力。
[005引圖12B顯示蛋白質(zhì)印跡的代表性圖像，其表示eIF4e、存活素、Bcl-XL和肌動蛋白 在來自MDA-MB-231細(xì)胞的細(xì)胞提取物中的蛋白質(zhì)水平，所述細(xì)胞在存在或不存在10%胎 牛血清的情況下生長，所述細(xì)胞用預(yù)先在100%二甲亞諷（DMSO)中稀釋W(xué)實(shí)現(xiàn)DMSO的1% 最終濃度的所示濃度的釘合膚處理。sTIP-03W劑量依賴方式下調(diào)MDA-MB-231細(xì)胞中的存 活素和Bcl-XL蛋白質(zhì)水平。肌動蛋白蛋白質(zhì)是表明相同量的蛋白質(zhì)被加載到每個孔中的 載荷對照。
【具體實(shí)施方式】
[0053] 在描述本發(fā)明膚和其用途之前，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明并不限于所述的特定的膚、方法、 用途和實(shí)驗(yàn)條件，因?yàn)榇祟惸w、方法、用途和條件可W改變。還應(yīng)當(dāng)理解，本文所用的術(shù)語僅 用于描述具體的實(shí)施方案，而不意在進(jìn)行限制，因?yàn)楸景l(fā)明的范圍將僅受所附權(quán)利要求限 制。
[0054] 除非另有定義，否則本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語都與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人 員通常所理解的含義相同。類似或等同于本文所述的方法和材料的任何方法和材料均可用 于本發(fā)明的實(shí)施或測試，因?yàn)閼?yīng)當(dāng)理解，修改和改變涵蓋于本公開的精神和范圍內(nèi)。
[00巧]在本發(fā)明內(nèi)，分離的交聯(lián)膚已被合理地設(shè)計(jì)成干擾eIF4E-eIF4G界面。生物物理 數(shù)據(jù)和晶體結(jié)構(gòu)用于支持一組分離膚的分子動態(tài)模擬。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)本文所述的膚W單數(shù) 位納摩爾范圍的表觀Kd結(jié)合，所述范圍對應(yīng)于相對于用來設(shè)計(jì)本發(fā)明膚的線性模板的大約 17到大約25倍的Kd改進(jìn)。另外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)可發(fā)生在膚：蛋白質(zhì)界面處的結(jié)構(gòu)效應(yīng)，當(dāng) 通過在所述膚中引入共價釘合體連接來降低構(gòu)象自由度時，其彼此相互調(diào)節(jié)。換句話說，本 發(fā)明人發(fā)現(xiàn)替代性螺旋穩(wěn)定化策略引起用于結(jié)合的多種多樣的分子機(jī)制并且親和力的改 進(jìn)源于補(bǔ)償性相互作用。
[0056] 膚交聯(lián)體主要增加所述膚在結(jié)合之前在溶液中的螺旋度，但運(yùn)可被膚：蛋白質(zhì)界 面處的非最佳相互作用削弱。在本發(fā)明的合理設(shè)計(jì)的膚中，已通過優(yōu)化界面處的擠壓效應(yīng)、 使被結(jié)合的復(fù)合物穩(wěn)定和在溶液中的更高螺旋穩(wěn)定化克服或至少改善此類限制。例如在本 發(fā)明的示例性膚中，交聯(lián)體僅誘導(dǎo)45 %螺旋度，但運(yùn)利用在兩個氨基酸之間形成（氨）h-鍵 并且通過所述膚的另一氨基酸的最佳擠壓相互作用被補(bǔ)償。相比之下，另一示例性膚在結(jié) 合時可喪失兩個氨基酸之間的氨鍵，但通過在溶液中的更高螺旋度（63%)和通過另一氨 基酸對螺旋結(jié)合形式的穩(wěn)定化發(fā)生補(bǔ)償。運(yùn)反映在針對運(yùn)兩種膚得到的結(jié)合的洽值和賭值 上，其中第一示例性膚具有更有利的洽分量（enthalpiccomponent)且第二示例性膚具有 更有利的賭分量（entropiccomponent)。
[0057] 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的分離膚相比于本領(lǐng)域內(nèi)已知的其它抑制劑是eIF4E的強(qiáng) 效結(jié)合劑。本發(fā)明人進(jìn)行的和本文所公開的觀察可用于設(shè)計(jì)用于治療性應(yīng)用（例如，在癌 癥的治療中）的新eIF4E抑制劑。
[0058] 祀向eIF4E-帽相互作用的替代方法是選擇性地破壞eIF4E與eIF4G的相互作用， 由此使得不能形成eIF4F復(fù)合物。祀向eIF4E的替代方法將是使用反義寡核巧酸（AS0)降 低eIF4E蛋白質(zhì)表達(dá)。eIF4EASO已被顯示有效地降低一系列廣泛的受轉(zhuǎn)染的人和鼠類細(xì) 胞中的eIF4ERNA和蛋白質(zhì)二者，隨后降低惡性相關(guān)蛋白質(zhì)-具體來說細(xì)胞周期蛋白D1、 VEGF、c-myc、存活素和B化-2的表達(dá)。重要地，AS0介導(dǎo)的eIF4E的降低不影響β-肌動蛋 白（一種由"強(qiáng)"mRNA編碼的蛋白質(zhì)）的表達(dá)，它也不顯著減少總體蛋白質(zhì)的合成。
[0059] 膚模擬物（Peptidomimetics)代表了一種祀向eIF4E:eIF4G相互作用的替代方 法。呈其自然狀態(tài)的蛋白質(zhì)折疊成二級結(jié)構(gòu)區(qū)域，如螺旋、折疊和轉(zhuǎn)角。α-螺旋是發(fā)現(xiàn)于 蛋白質(zhì)中的最常見的結(jié)構(gòu)基序之一，且許多生物學(xué)重要的蛋白質(zhì)相互作用通過一種蛋白質(zhì) 的α-螺旋區(qū)域與另一蛋白質(zhì)的相互作用介導(dǎo)。然而，α-螺旋具有解開并形成無規(guī)卷曲 的傾向，所述無規(guī)卷曲在多數(shù)情況下具有較低生物活性或甚至是非活性的，對其祀具有較 低的親和力，具有降低的細(xì)胞攝取并且極易于發(fā)生蛋白水解降解。
[0060] 因此，本發(fā)明設(shè)及一種分離膚，其可包含沈QIDN0:21(KiK2R3Y4XaaiXaa2Xaa3Xaa4L 9Li°Xaa日XaaeXaa^XaasXaag)所示的氨基酸序列或由沈QIDN0:2UKiK2R3Y4XaaiXaa2Xaa3Xaa4 化1姑曰5乂曰曰6乂曰曰而曰祐曰9)所示的氨基酸序列組成。所述膚可在兩個非天然（即非自然的 或合成的）氨基酸之間包含至少一個顯著增強(qiáng)所述膚的α螺旋結(jié)構(gòu)的膚交聯(lián)體（還被稱 為釘合體（staple)或系鏈（tether))。通常，交聯(lián)體延伸跨過一個或兩個螺旋轉(zhuǎn)角的長度 (即約3.4個或約7個氨基酸）。因此，位于1和1+3(間隔3個氨基酸）；^及1和1+4;或 i和i巧處的氨基酸是用于化學(xué)改性和交聯(lián)的理想候選。
[00川 因此，例如，如果膚具有序列：[…]XaaiXaajXaakXaaiXaamXaanXaa"XaapXaaqXaar[…] (其中""表示額外氨基酸的任選存在），則Xaai與Xaa1之間或Xaa1與Xaam之間或Xaa1 與Xaa。之間的交聯(lián)體與Xaa.j與Xaam之間或Xaa.j與Xaa。之間或Xaa.j與Xaaq之間等的交聯(lián) 體一樣有用。所述膚可包含超過一個交聯(lián)體W進(jìn)一步使所述序列穩(wěn)定或促進(jìn)更長膚伸展的 穩(wěn)定。
[0062] 因此，在一個方面，本發(fā)明設(shè)及上述分離膚，其中所述膚包含Xaai、Xaa2、Xaa3或 Xaa4與Xaa5、Xaae、Xaa^、Xaag或Xaag的至少一個交聯(lián)體，并且其中Xaa1包括但不限于絲氨 酸（S)、氨基異下酸和非天然氨基酸；Xaa2包括但不限于精氨酸（時、氨基異下酸和非天然 氨基酸；Xaa3包括但不限于谷氨酸巧）、氨基異下酸和非天然氨基酸；Xaa4包括但不限于苯 丙氨酸（巧、谷氨酷胺怕)、丙氨酸（A)、氨基異下酸和非天然氨基酸；Xaas包括但不限于甘 氨酸佑)、氨基異下酸和非天然氨基酸；Xaae包括但不限于苯丙氨酸（巧、亮氨酸巧)、氨基 異下酸、2-氨基下酸和非天然氨基酸，或不存在；Xaa,包括但不限于谷氨酷胺怕)、氨基異 下酸和非天然氨基酸，或不存在；Xaas包括但不限于苯丙氨酸（巧、氨基異下酸和非天然氨 基酸，或不存在；并且Xaag包括但不限于氨基異下酸和非天然氨基酸，或不存在。
[0063] 如本文所用的術(shù)語"交聯(lián)體"或其語法變型是指兩個膚結(jié)構(gòu)域（例如螺旋膚的兩 個環(huán)）的分子內(nèi)連接體（還被稱作釘合體）。當(dāng)所述膚具有螺旋二級結(jié)構(gòu)時，交聯(lián)體是大 環(huán)，它是外源（非其一部分）的核屯、或固有（非交聯(lián)）的螺旋膚結(jié)構(gòu)。大環(huán)可包含全控連 接環(huán)并且包含連接到所述膚的至少兩個氨基