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一種胎兒游離dna文庫(kù)定量的標(biāo)準(zhǔn)品及其制備方法

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一種胎兒游離dna文庫(kù)定量的標(biāo)準(zhǔn)品及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物制品技術(shù)領(lǐng)域,屬于胎兒染色體非整倍體的無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)范疇, 涉及半導(dǎo)體測(cè)序法檢測(cè)胎兒染色非整倍體21三體、18三體、13三體的文庫(kù)DNA濃度的qPCR 定量標(biāo)準(zhǔn)品及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 染色體非整倍體是指相對(duì)于人的正常的46條染色體而言,細(xì)胞中的某一條或幾 條染色體數(shù)目增加或減少,與嬰幼兒期顯著的發(fā)病率和死亡率有著密切關(guān)系。該類疾病的 發(fā)病率隨著孕婦年齡的增高而增高。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道我國(guó)每年出生染色體異常的新生兒約10 萬(wàn)人,在活嬰兒中染色體異常者占0. 3%,而其中21三體、18三體、13三體綜合征是臨床最 常見(jiàn)和最易出現(xiàn)的染色體異常疾病。目前21三體、18三體、13三體綜合征的治療缺乏有效 方法,因此普及染色體疾病的產(chǎn)前篩查和產(chǎn)前診斷,對(duì)降低出生缺陷的發(fā)生有著非常重要 的意義,這有利于提尚人口質(zhì)量,實(shí)現(xiàn)優(yōu)生優(yōu)育。
[0003] 利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)胎兒染色體非整倍體進(jìn)行檢測(cè)的方法相比傳統(tǒng)方法具有 明顯優(yōu)勢(shì)。該方法只需抽取母體外周血進(jìn)行檢測(cè),可以避免傳統(tǒng)的侵入性方法可能給孕婦 和胎兒帶來(lái)的危害;另外直接檢測(cè)母親和胎兒的DNA序列,相比于檢測(cè)血清蛋白標(biāo)志物和 超聲波檢測(cè),準(zhǔn)確性和靈敏度以及可靠性都大大提高。因此,通過(guò)深度測(cè)序,能夠?qū)υ袐D血 漿微量胎兒游離DNA進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè),可以克服傳統(tǒng)檢測(cè)方法因胎兒游離DNA含量過(guò)低而導(dǎo) 致檢測(cè)結(jié)果假陰性過(guò)高的缺點(diǎn)。胎兒染色體非整倍體21三體、18三體和13三體檢測(cè)試劑 盒(半導(dǎo)體測(cè)序法)基于高通量測(cè)序原理,對(duì)這些胎兒游離DNA進(jìn)行檢測(cè),利用生物信息學(xué) 分析系統(tǒng)對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析,獲得胎兒染色體數(shù)目的詳細(xì)信息,實(shí)現(xiàn)對(duì)21三體綜合征、 18三體綜合征和13三體綜合征進(jìn)行快速的產(chǎn)前輔助診斷。通過(guò)半導(dǎo)體測(cè)序?qū)嶒?yàn)得到的DNA 數(shù)據(jù)量(UniqueReads數(shù))需達(dá)到3· 5MReads(原始Reads需5M左右)才能對(duì)胎兒染色 體非整倍體的癥狀進(jìn)行明確判斷。
[0004] 目前半導(dǎo)體測(cè)序系統(tǒng)上對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè),每次實(shí)驗(yàn)可產(chǎn)出80M左右的Reads,理論 每次實(shí)驗(yàn)可檢測(cè)16個(gè)樣品。但由于測(cè)序芯片中含有165M個(gè)微孔,需要的文庫(kù)DNA分子量 僅為10s個(gè)DNA拷貝數(shù),即10 15mol,如此低的濃度必定會(huì)造成16個(gè)樣本很難等量均勻地混 合,這將導(dǎo)致某些樣本測(cè)序得到的數(shù)據(jù)量達(dá)不到要求而需要重新檢測(cè),這既浪費(fèi)了成本,也 拖延了檢測(cè)時(shí)間。目前胎兒染色體非整倍體21三體、18三體和13三體檢測(cè)試劑盒(半導(dǎo) 體測(cè)序法)每次建議檢測(cè)12個(gè)樣品,因此在保證每個(gè)樣本DNA都能達(dá)到足夠Reads數(shù)的前 提下,增加單次實(shí)驗(yàn)的樣品數(shù)量成為了必要。
[0005] 現(xiàn)有胎兒染色體非整倍體21三體、18三體和13三體檢測(cè)試劑盒(半導(dǎo)體測(cè)序 法)文庫(kù)濃度是用Qubit熒光法檢測(cè)的,只有當(dāng)DNA與熒光的MolecularProbes?染料結(jié)合 后,才能發(fā)出熒光信號(hào),因此該方法只檢測(cè)靶分子(而不是污染物)的濃度,相對(duì)于傳統(tǒng)的 Nanodrop?分光光度更準(zhǔn)確,更精密。但Qubit檢測(cè)方法在高通量基因測(cè)序過(guò)程同樣有一 定的缺陷,即檢測(cè)范圍為〇.lng/μL-10ng/μL,對(duì)于加入的10s個(gè)DNA分子難以精確定量。 因此最低可以檢測(cè)到100個(gè)DNA分子拷貝的qPCR技術(shù)應(yīng)用在高通量測(cè)序上無(wú)疑是非常必 要的。利用DNA標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到文庫(kù)DNA的拷貝數(shù),再進(jìn)行等量混合后上機(jī)測(cè)序。
[0006] 目前,市場(chǎng)上該檢測(cè)方法涉及的文庫(kù)DNA濃度的qPCR定量標(biāo)準(zhǔn)品幾乎沒(méi)有,這嚴(yán) 重影響染色體疾病的產(chǎn)前篩查和診斷過(guò)程的效率,增加了成本。為增加檢驗(yàn)試劑盒在檢測(cè) 過(guò)程中的有效性,本發(fā)明以高通量測(cè)序技術(shù)用于孕婦血漿游離胎兒DNA的染色體非整倍體 (T2UT18和T13)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品為溯源,然后將人類基因組DNA打斷成長(zhǎng)度為160~200bp的 DNA片段,利用該試劑盒進(jìn)行文庫(kù)制備,經(jīng)Qubit2. 0檢測(cè)后稀釋至一定濃度作為胎兒染色 體非整倍體21三體、18三體和13三體檢測(cè)試劑盒(半導(dǎo)體測(cè)序法)文庫(kù)DNA濃度檢測(cè)的 qPCR定量標(biāo)準(zhǔn)品。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種胎兒染色體非整倍體21三體、18三體和13三體檢測(cè)試 劑盒(半導(dǎo)體測(cè)序法)文庫(kù)DNA濃度的qPCR定量標(biāo)準(zhǔn)品及其制備方法。
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的,發(fā)明了一種胎兒染色體非整倍體21三體、18三體和13三體 檢測(cè)試劑盒(半導(dǎo)體測(cè)序法)文庫(kù)DNA濃度的qPCR定量標(biāo)準(zhǔn)品。
[0009] 本發(fā)明的qPCR定量標(biāo)準(zhǔn)品為含有一段長(zhǎng)度為260bp左右DNA片段的無(wú)核酸酶溶 液。
[0010] 本發(fā)明的qPCR定量標(biāo)準(zhǔn)品的DNA片段兩端含有測(cè)序的接頭序列,與文庫(kù)DNA特征 相同。
[0011] 本發(fā)明的qPCR定量標(biāo)準(zhǔn)品涉及文庫(kù)DNA定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。
[0012] 本發(fā)明qPCR定量標(biāo)準(zhǔn)品制備方法:
[0013] (1)接頭序列與引物合成:合成接頭序列雙鏈AdapterS1和AdapterS2,并在接 頭序列上設(shè)計(jì)qPCR擴(kuò)增的引物對(duì)NIPT-LibraryF與NIPT-LibraryR,如下:
[0014] AdapterS1 :
[0015] 5r -CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG-3r (+)
[0016] 3, -C*C*C*GGTAGAGTAGGGACGCACAGAGGCTGAGTC-5,(-)
[0017] AdapterS2 :
[0018] 5'-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3r (+)
[0019] 3 ' -OOOGGTGATGCGGAGGCGAAAGGAGAGATACCCGTCAGCCACTA-5,(-)
[0020] NIPT-LibraryF:5,-CCATCTCATCCCTGCGTGTC-3'
[0021] NIPT-LibraryR:5'-CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3'
[0022] (2)模擬胎兒游離DNA的文庫(kù)制備:提取人類基因組DNA,將其物理超聲(條件:頻 率0. 5min超聲/0. 5min冷卻停止,15min/循環(huán),3個(gè)循環(huán))打斷為160bp~200bp的DNA 片段;利用T4DNA連接酶將AdapterS1和AdapterS2序列與160bp~200bp的DNA片段 進(jìn)行連接后,E-Gel膠回收260bp片段;
[0023] (3)文庫(kù)擴(kuò)增與純化:利用NIPT-LibraryF、NIPT-LibraryR引物與高保真 DNA聚合酶擴(kuò)增步驟(2)中回收的DNA片段,反應(yīng)程序?yàn)椋?8°C2min,98°C15s,62°C15s, 70°Clmin,共10個(gè)循環(huán),70°C延長(zhǎng)5min;繼而利用磁珠純化得到的DNA片段并溶解于無(wú)核 酸酶水中;
[0024] (4)制作文庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)曲線:利用Qubit 2.0定量構(gòu)建好的文庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)品在測(cè)序儀上檢 測(cè),得到Reads數(shù)大于80M后再進(jìn)行10倍梯度的稀釋,進(jìn)行qPCR檢測(cè),得到Ct值并建立標(biāo) 準(zhǔn)曲線;
[0025] (5)樣本檢測(cè):待檢樣本的文庫(kù)DNA通過(guò)文庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行濃度確定后用測(cè)序儀 檢測(cè),增加樣本之間數(shù)據(jù)量的均勻性。
[0026] 本發(fā)明的qPCR標(biāo)準(zhǔn)品為白色透明的DNA溶液,具有穩(wěn)定、易保存和不危害操作者 健康的優(yōu)點(diǎn),同時(shí)qPCR標(biāo)準(zhǔn)品制備瓶間差變異系數(shù)較小,這說(shuō)明本發(fā)明的使用,可以用于 胎兒染色體疾病的產(chǎn)前無(wú)創(chuàng)篩查和診斷。
[0027] 本發(fā)明能夠有效的避免同一批次文庫(kù)DNA濃度的檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)偏差,為增加21三 體、18三體和13三體無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)樣本之間的均一性和檢測(cè)效率提供了保證。
【附圖說(shuō)明】
[0028] 圖1顯示建立的qPCR定量標(biāo)準(zhǔn)品的Agilent 2100 Bioanalyzer分析長(zhǎng)度分布圖 譜。
[0029] 圖2顯示qPCR定量標(biāo)準(zhǔn)品利用胎兒染色體非整倍體21三體、18三體和13三體檢 測(cè)試劑盒(半導(dǎo)體測(cè)序法)上機(jī)的圖譜。
[0030] 圖3顯示qPCR定量標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線圖譜。
[0031 ] 圖4顯示qPCR定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0032] 圖5顯示qPCR定量溶解曲線。
[0033] 圖6顯示同批文庫(kù)的qPCR定量濃度與Qubit定量濃度的比較。
[0034] 圖7顯示同批文庫(kù)通過(guò)qPCR定量與Qubit定量后上機(jī)測(cè)序得到的DNAReads數(shù) 比較。
【具體實(shí)施方式】
[0035] 以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明,但不用于限制本發(fā)明。實(shí)施例中所用的技術(shù)手段若 為特殊指明,均為常規(guī)方法。實(shí)施例中涉及到的試劑與耗材若無(wú)特殊說(shuō)明均可從商業(yè)途徑 獲取。以下實(shí)施例中的qPCR定量實(shí)驗(yàn),均設(shè)置三次重復(fù)試驗(yàn),結(jié)果取平均值。
[0036] 實(shí)施例1 :標(biāo)準(zhǔn)品的制備
[0037] -、接頭序列及引物設(shè)計(jì)合成
[0038] 設(shè)計(jì)與人類基因組盡量不一致的序列,按照GC含量與引物設(shè)計(jì)原則,得到以下接 頭序列。為防止接頭序列反方向與目的片段連接,3'端設(shè)置粘性末端,為防止粘性末端降解 對(duì)突出的C進(jìn)行修飾,*代表接頭的負(fù)鏈3'端堿基C通過(guò)硫代磷酸化修飾;另5'兩端經(jīng)過(guò) 去磷酸化修飾,為防止接頭序列本身平末端出發(fā)生連接現(xiàn)象,綜合以上因素合成以下接頭 序列雙鏈AdapterS1 和AdapterS2 :
[0039] AdapterS1 :
[0040] 5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG-3r
[0041] 3'-OOOGGTAGAGTAGGGACGCACAGAGGCTGAGTC-5'
[0042] AdapterS2 :
[0043] 5,-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3,
[0044] 3,-C*C*C*GGT GATGCG GAG GCG AAA GGA GAGATA CCC GTC AGC CAC TA-5'
[0045] 設(shè)計(jì)引物,在接頭序列上設(shè)計(jì)QPCR擴(kuò)增的引物序列,引物的Tm值為60°C。
[0046] NIPT-Library F :5, -CCA TCT CAT CCC TGC GTG TC-3,
[0047] NIPT-Library R :5' -CCT CTC TAT GGG CAG TCG GTG AT-3'
[0048] 由引物NIPT-LibraryF與引物NIPT-LibraryR組成的引物對(duì),可以擴(kuò)增的靶序 列為連接上接頭的DNA文庫(kù),用于血漿游離DNA文庫(kù)的擴(kuò)增與定量,靶序列長(zhǎng)度為260bp左 右。
[0049] 二、標(biāo)準(zhǔn)品的制備
[0050] 1.提取人類基因組DNA,利用BioruptorCD-200TSSonicationSystem將DNA 進(jìn)行3個(gè)循環(huán),每個(gè)循環(huán)15min物理超聲打斷,打斷頻率為0. 5min超聲/0. 5min冷卻停止, 打斷的主要長(zhǎng)度為160bp~200bp模擬胎兒游離DNA的長(zhǎng)度。
[0051] 2.利用T4DNA連接酶將Adapter S1和Adapter S2序列與回收后的180bp片段進(jìn) 行連接,由于Adapter S1
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