來自糖化生物質(zhì)分離的纖維素酶再循環(huán)的制作方法
【專利說明】來自糖化生物質(zhì)分離的纖維素酶再循環(huán)
[0001] 相關(guān)專利申請的交叉引用
[0002] 本申請要求于2013年3月15日提交的美國臨時專利申請No. 61/798, 070的優(yōu)先 權(quán)，W引用的方式將其整體并入本文。
【背景技術(shù)】
[0003] 酶水解是基于生物質(zhì)生產(chǎn)生物燃料的重要步驟。酶水解省去了對大量酸和中和此 酸的需求，但目前商業(yè)化纖維素酶的成本較高，并且酶對纖維素和半纖維素聚合物的作用 可能較慢。另一方面，雖然水解機制W及各種纖維素酶的結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)系已被廣泛 研究，酶活性的許多細節(jié)仍然知之甚少。
[0004] 木質(zhì)纖維素底物的酶水解強烈受到終產(chǎn)物抑制和酶特性的影響。因此，生物質(zhì)水 解與W下因素直接或間接相關(guān)：底物可用性、終產(chǎn)物積累和/或在生物質(zhì)預(yù)處理期間或之 后產(chǎn)生的酶抑制劑（運阻礙纖維素酶對其各自底物的特異性活性）。對底物的低特異性催 化劑活性限制了水解效力。

【發(fā)明內(nèi)容】
陽〇化]本方法設(shè)及改進纖維素生物質(zhì)的糖化來生產(chǎn)可轉(zhuǎn)化為有用的下游產(chǎn)物（如生物 燃料）的糖。在該方法中，在適于將生物質(zhì)組分水解成糖的條件下，使生物質(zhì)與催化劑接 觸。在一些實施方式中，所述條件包括在高剪切攬拌化i曲-shearagitation)條件下，使 生物質(zhì)與催化劑接觸。在一些實施方式中，在使生物質(zhì)與催化劑接觸W將生物質(zhì)組分水解 成糖之前，使用高剪切磨碎設(shè)備（hi曲shearmillingdevice)對生物質(zhì)進行處理，W產(chǎn) 生相對均一的粒徑。將得到的水解生物質(zhì)混合物分離成包含糖的液體流和包含固體的固體 流，其中，兩相都構(gòu)成殘留酶Cresi化曰1enzymes),在本文的實施方式中對其進行說明。在 一些實施方式中，在生物質(zhì)部分水解之后進行分離步驟。在適于將固體組分水解成糖的條 件下，將固體進一步解育，從而生產(chǎn)額外的糖。在一些實施方式中，在約6小時至約24小時 內(nèi)，該方法將生物質(zhì)中至少80 %的葡聚糖轉(zhuǎn)化成葡萄糖。
[0006] 因此，在一方面，描述了用于從生物質(zhì)生產(chǎn)糖的方法，所述方法包含：
[0007] (a)在適于將生物質(zhì)組分水解成糖的高剪切攬拌條件下，使所述生物質(zhì)與催化劑 接觸，從而產(chǎn)生包含糖的固液混合物；
[0008] 化）將所述混合物分離成包含糖的液體流和包含固體的固體流；
[0009] (C)在適于將固體組分水解成糖的條件下解育所述固體，從而生產(chǎn)額外的糖。
[0010] 在另一方面，描述了用于從生物質(zhì)生產(chǎn)糖的方法，所述方法包含：
[0011] (a)使用包含轉(zhuǎn)子和定子的高剪切/磨碎混合設(shè)備對所述生物質(zhì)進行預(yù)處理，其 中，所述高剪切/磨碎混合設(shè)備在所述轉(zhuǎn)子和所述定子之間具有約0.1毫米至2.2毫米的 間隙設(shè)置（gapsetting),從而減小所述生物質(zhì)中生物質(zhì)顆粒的粒徑；
[0012] 化）使所述生物質(zhì)與催化劑接觸W將生物質(zhì)組分水解成糖，從而產(chǎn)生包含糖的固 液混合物；
[0013] (C)將所述混合物分離成包含糖的液體流和包含固體的固體流；
[0014] (d)在適于將固體組分水解成糖的條件下解育所述固體流，從而生產(chǎn)額外的糖。
[0015]在上述方面的一些實施方式中，生物質(zhì)包含葡聚糖，且生物質(zhì)中至少80%的葡聚 糖在約6小時至約24小時內(nèi)被水解成葡萄糖。在一些實施方式中，生物質(zhì)是木質(zhì)纖維素生 物質(zhì)。在使生物質(zhì)與催化劑接觸之前，生物質(zhì)可包含至少約lOw/w%的固體。在使生物質(zhì)與 催化劑接觸之前，也可對生物質(zhì)進行預(yù)處理。催化劑可包括酶（如水解酶），或可為非酶催 化劑。
[0016]在一些實施方式中，高剪切攬拌條件產(chǎn)生如下生物質(zhì)粒徑：其中，至少約80%的 顆粒具有約1微米至約800微米、約2微米至約600微米、約2微米至約400微米或約2微 米至約200微米的粒徑。
[0017]在一些實施方式中，使用機械設(shè)備、過濾器、膜或切向流過濾設(shè)備將混合物分離。 機械設(shè)備可為離屯、機、壓力機（press)或篩（screen)。
[0018]在一些實施方式中，在將混合物分離成液體流和固體流之前，使生物質(zhì)混合物部 分水解不同時間長度。例如，在一些實施方式中，在使生物質(zhì)與催化劑接觸約2小時至約4 小時、或約4小時至約6小時后，進行分離步驟。在一個實施方式中，當(dāng)存在于生物質(zhì)中的 約30%至約60%的葡聚糖轉(zhuǎn)化成葡萄糖時，將生物質(zhì)混合物分離成液體流和固體流。相較 于不包含將混合物分離成液體流和固體流、并在適于將固體組分水解成糖的條件下解育固 體流的步驟的方法，本文所述的方法提高了葡聚糖向葡萄糖的轉(zhuǎn)化量。在一些實施方式中， 相較于不包含額外的分離和解育步驟的方法的葡聚糖轉(zhuǎn)化量，該方法的葡聚糖轉(zhuǎn)化量至少 提局10%。
[0019]在一些實施方式中，使固體流在適于將固體組分水解成糖的條件下解育約8小時 至約20小時。還可在高剪切攬拌條件下對固體流進行解育。
[0020] 在一些實施方式中，在間歇化atch)、半間歇（semi-batch)或連續(xù)（continuous) 工藝中使固體流與額外的生物質(zhì)接觸。額外的生物質(zhì)也可包含將生物質(zhì)組分水解成糖的催 化劑。
[0021] 在一些實施方式中，該方法生產(chǎn)的糖被加工成乙醇、生物燃料、生化制品或其它化 學(xué)產(chǎn)品。在一些實施方式中，相較于未依據(jù)本方法進行處理的生物質(zhì)，從所述生物質(zhì)混合物 中分離出的液體流包含增加量的化合物，例如慷醒、低聚糖和酪類。在一些實施方式中，相 較于未在高剪切條件下處理的生物質(zhì)，所述生物質(zhì)的水解組分包含降低濃度的污染物。
[0022] 在一些實施方式中，在使用高剪切設(shè)備對生物質(zhì)進行處理之后，使生物質(zhì)與適于 將生物質(zhì)組分水解成糖的催化劑接觸。
[0023]在一些實施方式中，高剪切攬拌條件包含使用高剪切/磨碎混合設(shè)備對生物質(zhì)進 行處理，所述高剪切/磨碎混合設(shè)備包含轉(zhuǎn)子和定子。依據(jù)所用的生物質(zhì)類型，所述轉(zhuǎn)子和 所述定子之間的間隙設(shè)置可在約0.1毫米至約2.2毫米之間。
[0024]在一個實施方式中，所述方法進一步包含將液體流分離成包含糖的第二液體流和 包含固體的第二固體流；W及在適于將固體組分水解成糖的條件下解育第二固體，從而生 產(chǎn)額外的糖。
[00巧]在一些實施方式中，在預(yù)處理步驟之前或在使生物質(zhì)與高剪切磨碎設(shè)備接觸之 前，將生物質(zhì)與水混合W提供生物質(zhì)/水混合物。
[00%] 在此對本發(fā)明進一步的實施方式進行說明。 W27] 定義
[0028]除非另有定義，本文所使用的所有技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的 技術(shù)人員通常理解的含義相同的含義。盡管基本上與本文所述的方法和材料類似的任何方 法和材料都可W用于本發(fā)明的實踐或測試中，但是僅對示例性方法和材料進行了描述。為 了本發(fā)明的目的，下面對W下術(shù)語進行定義。
[0029] 除非上下文清楚地另外指明，術(shù)語"一種/ 一個"和"該/所述"包括復(fù)數(shù)所指物。
[0030] 術(shù)語"催化劑"指的是提高化學(xué)反應(yīng)（如纖維素水解）的速率、或允許反應(yīng)在較低 溫度下W基本相同的速率進行的化合物或物質(zhì)。該術(shù)語包括將木質(zhì)纖維素生物質(zhì)轉(zhuǎn)化成 多糖、低聚糖和/或簡單的可發(fā)酵糖的水解和糖化酶。該術(shù)語還包括由基因工程化植物或 轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)的糖化酶，例如，如Ra化等人在美國專利公開2012/0258503中所描述的， W引用的方式將其整體并入本文。該術(shù)語還包括聚合物酸催化劑，例如，如在美國專利公開 2012/0220740、2012/0252957和2013/0042859中所描述的，W引用的方式將它們各自整體 并入本文。
[0031] 術(shù)語"生物質(zhì)"指的是包含木質(zhì)纖維素材料的任意材料。木質(zhì)纖維素材料由=種 主要組分組成：纖維素、半纖維素和木質(zhì)素。纖維素和半纖維素包含包括多糖和低聚糖在內(nèi) 的碳水化合物，并且可W與諸如蛋白質(zhì)和/或脂質(zhì)等其它組分組合。生物質(zhì)的實例包括農(nóng) 產(chǎn)品，例如谷物，如玉米、小麥和大麥；甘薦；玉米賴桿、玉米棒、甘薦渣、高梁和食用植物的 其它不可食用的廢物部分；食物廢物；草類，如柳枝稷；W及林業(yè)生物質(zhì)，如木材、紙、木板 (board)和廢木材產(chǎn)品。
[0032] 術(shù)語"木質(zhì)纖維素"指的是同時包含木質(zhì)素和纖維素的材料，并且也可W包含半纖 維素。
[0033] 關(guān)于材料或組合物的術(shù)語"纖維素"指的是包含纖維素的材料。
[0034] 術(shù)語"葡聚糖"指的是所有的a -連接和0 -連接的1，4葡萄糖單元均聚物。
[0035] 術(shù)語"適于將生物質(zhì)組分水解成糖的條件"指的是使固相生物質(zhì)與一種或多種催 化劑（包括但不限于纖維素酶、半纖維素酶和輔助酶或蛋白質(zhì)）接觸，W由生物質(zhì)中的多糖 生產(chǎn)可發(fā)酵糖和鏈較短的低聚糖。該條件可進一步包括最適合糖化酶活性的抑，例如，約 4. 0至約7. 0的抑范圍。該條件可進一步包括最適合催化劑（包括糖化酶）活性的溫度， 例如，約20°C~100°C、約35°C~75°C或約40°C~60°C的溫度范圍。
[0036] 術(shù)語"高剪切攬拌"、"高剪切混合"和"高剪切磨碎"或"高剪切磨碎/糖化"指的 是將生物質(zhì)置于高剪切條件下，W降低生物質(zhì)粒徑和/或增強包含催化劑的生物質(zhì)混合物 的混合。在一些實施方式中，所述條件產(chǎn)生約1微米至約800微米的生物質(zhì)粒徑分布。在 一些實施方式中，生物質(zhì)粒徑分布如下：至少約70 %、75 %、80 %、85 %、90 %或95 %的顆粒 具有約1微米至約800微米、約2微米至約600微米、約2微米至約400微米或約2微米至 約200微米的粒徑?？蒞由本領(lǐng)域熟知的設(shè)備提供高剪切條件，例如，由ICS型孔口反應(yīng)器 (orificereactor)度uchen-IndustrialCatalystService)、旋轉(zhuǎn)膠體型磨機、Silverson 混合器、氣蝕磨碎（cavitationmilling)設(shè)備、螺旋鉆（auger)、磨碎螺旋鉆或蒸汽輔助水 力噴射式化y化o-jet)磨機提供。在一些實施方式中，高剪切設(shè)備包括具有靜止定子和旋 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)子定位的任何設(shè)備，W在運行期間保持轉(zhuǎn)子和定子之間的物理間隙，使得在該間隙內(nèi) 或沿著該間隙產(chǎn)生高剪切區(qū)。在一些實施方式中，高剪切設(shè)備包含螺旋鉆磨碎設(shè)備，所述螺 旋鉆磨碎設(shè)備的磨碎桿或磨碎棒插在螺旋鉆葉片之間并包含在螺旋鉆葉片插槽內(nèi)，運允許 磨碎桿在螺旋鉆直徑的中屯、和壁區(qū)域之間行進。當(dāng)螺旋鉆旋轉(zhuǎn)時，磨碎桿行進至螺旋鉆組 件中屯、（處于被定義為零度位置的旋轉(zhuǎn)頂部）。隨著旋轉(zhuǎn)進展超過90度并向180度旋轉(zhuǎn)位 置行進，磨碎桿落向螺旋鉆組件的外徑或壁，從而，由于螺旋鉆葉片的旋轉(zhuǎn)，當(dāng)磨碎桿沿螺 旋鉆的較低區(qū)域行進時，上述運動產(chǎn)生由磨碎桿質(zhì)量擊打生物質(zhì)而導(dǎo)致的磨碎作用。螺旋 鉆桿可W配備有多種表面特征，W支持生物質(zhì)的有效磨碎，并且可W配置在沿著螺旋鉆葉 片的各種位置，W保持旋轉(zhuǎn)中的平衡和生物質(zhì)轉(zhuǎn)化的最佳條件?？蒞在預(yù)處理和糖化工藝 步驟之前和/或期間，W任意組合使用運些高剪切磨碎設(shè)備，W提高生物質(zhì)向糖的轉(zhuǎn)化。
[0037] 術(shù)語"糖化"也稱為"水解"，指的是從生物質(zhì)或生物質(zhì)原料或包含非纖維素類生物 質(zhì)的原料生產(chǎn)糖和短鏈低聚糖。糖化可由催化劑實現(xiàn)，所述催化劑包括水解酶、纖維素酶、 a-淀粉酶、葡萄糖-淀粉酶、0-葡糖巧酶和/或輔助蛋白質(zhì)，所述輔助蛋白質(zhì)包括但不限 于過氧化物酶、蟲漆酶、擴張素（expansins)和膨脹素（swollenins)。"水解"指的是打破 多糖中的糖巧鍵并引入水W產(chǎn)生簡單的單體糖和/或低聚糖。例如，纖維素的水解產(chǎn)生6 碳（C6)糖（例如葡萄糖）和低聚葡萄糖，而半纖維素的水解產(chǎn)生5碳（C5)糖（例如木糖 和阿拉伯糖）和6碳（C6)糖（例如半乳糖和甘露糖）和各種低聚糖?？赏ㄟ^各種技術(shù)、工 藝和/或方法來實現(xiàn)從聚合的纖維素纖維和生物質(zhì)生產(chǎn)短鏈纖維素類的糖。例如，可W用 水來水解纖維素W產(chǎn)生纖維素類的糖?？赏ㄟ^使用水解酶、化學(xué)品、機械剪切、熱和壓力環(huán) 境或上述技術(shù)的任意組合來輔助和/或加速水解。水解酶的實例包括P-葡糖巧酶、木聚 糖酶、纖維素酶和半纖維素酶。纖維素酶是多種酶的混合物（包括外切纖維二糖水解酶、內(nèi) 切葡聚糖酶和P-葡糖巧酶）的通用術(shù)語，運些酶聯(lián)合作用W將纖維素水解成纖維二糖和 葡萄糖?；瘜W(xué)品的實例包括強酸、弱酸、弱堿、強堿、氨或其它化學(xué)品。機械剪切包括高剪切 孔口（hi曲shearorifice)、氣蝕、膠體磨機和螺旋鉆磨機。
[0038] 術(shù)語"可發(fā)酵糖"指的是在發(fā)酵過程中（例如，在由酵母進行的發(fā)酵過程中）可W 轉(zhuǎn)化成乙醇或其它產(chǎn)物（例如但不限于甲醇、下醇、丙醇、班巧酸和異戊二締）的糖。例如， 葡萄糖是從纖維素的水解衍生而來的可發(fā)酵糖，而木糖、阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖是從半 纖維素的水解衍生而來的可發(fā)酵糖。
[0039] 術(shù)語"同步糖化和發(fā)酵（SS巧"指的是如下工藝：通過生物質(zhì)的酶水解生成可發(fā)酵 糖，運些糖幾乎馬上就在發(fā)酵過程中被消耗，從而產(chǎn)生有價值的產(chǎn)物（如生物燃料）。運與 術(shù)語"分步水解和發(fā)酵（SH巧"相反，在SHF中，生物質(zhì)的酶水解在糖的發(fā)酵轉(zhuǎn)化之前發(fā)生。
[0040] 術(shù)語"預(yù)處理"指的是使用物理、熱、化學(xué)或生物手段或上述手段的任意組合對生 物質(zhì)進行處理，從而使生物質(zhì)更