一種具有反硝化功能的除烴海桿菌stw2及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，具體設(shè)及一種具有反硝化功能的除控海桿菌STW2及其 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】：
[0002] 由于經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和城市化進(jìn)程的推進(jìn)，人類活動(dòng)在濱海濕地生態(tài)系統(tǒng)區(qū)域日益頻 繁，使得越來(lái)越多的無(wú)機(jī)污染和有機(jī)污染物質(zhì)進(jìn)入到濱海濕地系統(tǒng)中，對(duì)生態(tài)系統(tǒng)造成嚴(yán) 重的破壞，其中比較常見的是無(wú)機(jī)氮污染和多環(huán)芳控、農(nóng)藥、多氯聯(lián)苯、鄰苯二甲酸醋等有 機(jī)污染物等有機(jī)污染物。濱海生態(tài)系統(tǒng)中的氮素富集，常常蘊(yùn)含著過(guò)量的高濃度氨氮和亞 硝酸氮的積累，從而會(huì)對(duì)海洋生物產(chǎn)生直接的毒害作用，降低其免疫力，引發(fā)病原生物入侵 從而造成，而好養(yǎng)反硝化功能菌介導(dǎo)的反硝化作用可W有效地緩解運(yùn)一現(xiàn)象（Camargoand Alonso, 2006)。好氧反硝化菌（AerobicDenitrifier)是一類能夠在有氧條件下，利用好 氧反硝化酶進(jìn)行反硝化作用的反硝化菌，在運(yùn)個(gè)過(guò)程中通過(guò)它能夠使硝酸鹽（N03)逐步轉(zhuǎn) 變?yōu)閬喯跛猁}（N02)、一氧化二氮（成0)和氮?dú)猓ǔ?，從而達(dá)到脫氮的目的。水體脫氮最有 效且環(huán)保的方法即采用硝化反硝化微生物進(jìn)行水體修復(fù)，且具有高效、價(jià)格低廉、安全性較 高等特點(diǎn)。目前已有報(bào)道的好氧反硝化菌主要包括假單胞菌屬（Pseudomonas)、產(chǎn)堿桿菌屬 (Alcaligenes)、副球菌屬（Paracoccus)和芽抱桿菌屬度acillus)等，屬好氧或兼性好氧 異養(yǎng)微生物，而關(guān)于海桿菌的報(bào)道較少化ietal.，2013)。
[0003] 有機(jī)污染物多環(huán)芳控具有致癌、致崎、致突變性、半揮發(fā)性、親脂性、高生物蓄積性 和難降解等特性，其能夠在環(huán)境中長(zhǎng)時(shí)間存在、長(zhǎng)距離遷移并富集于生物體，給人類健康和 生態(tài)系統(tǒng)安全造成長(zhǎng)期而嚴(yán)重的危害，而在海洋濕地環(huán)境中的多環(huán)芳控除較少部分通過(guò)光 化學(xué)分解外，大多數(shù)還是依賴于生物降解的途徑進(jìn)行消除，微生物降解是一條高效途徑。已 有研究表明海桿菌（Marinobacterhy化ocarbonoclasticus)在高達(dá)20%的鹽濃度下仍能 降解控類，具有更為廣泛的應(yīng)用性。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0004] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種同時(shí)具有反硝化和有機(jī)物多環(huán)芳控降解功能 的除巧海桿菌（Marinobacterhy化oca;rbonoclasticus)STW2,該菌于 2014 年 7 月 10 號(hào) 保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中屯、（CCTCC)，中國(guó)武漢武漢大學(xué)，保藏編號(hào)為CCTCCN0:M 2014339。
[0005] 本發(fā)明的除控海桿菌（Marinobacterhy化ocarbonoclasticus)STW2具有反硝化 和有機(jī)物多環(huán)芳控降解功能。
[0006] 因此本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供除控海桿菌（Marinobacter hy化ocarbonoclasticus)STW2在通過(guò)反硝化進(jìn)行脫氮中的應(yīng)用或者在降解多環(huán)芳控有機(jī) 物中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的除控海桿菌（Marinobacterhy化ocarbonoclasticus)STW2具有反硝化 和有機(jī)物多環(huán)芳控降解功能，因此可w將其應(yīng)用于反硝化進(jìn)行脫氮中w及降解多環(huán)芳控有 機(jī)物，從而能夠有效應(yīng)用于海洋濱海濕地生態(tài)系統(tǒng)的修復(fù)和保護(hù)中，具有較好的應(yīng)用前景。
[0008]除控海桿菌（Marinobacterhy化ocarbonoclasticus)STW2 于 2014 年 7 月 10 號(hào)保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中屯、（CCTCC)，中國(guó)武漢武漢大學(xué)，保藏編號(hào)為CCTCCN0:M 2014339。
【附圖說(shuō)明】：
[0009]圖 1 是除控海桿菌（Marinobacterhy化ocarbonoclasticus)STW2 的 16SrDNA的 系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹，圖中的51胖2表示除控海桿菌（祀117化〇〇日計(jì)〇11〇(31日3^(3113化1胖2;
[0010] 圖2是除控海桿菌STW2的nosZ的系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹，圖中的STW2表示除控海桿菌 (M.hydroc曰rbonocl曰sticus)STW2。
[0011] 圖3是好氧條件下除控海桿菌STW2的反硝化效率測(cè)定。
【具體實(shí)施方式】：
[0012] W下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。 陽(yáng)〇1；3]實(shí)施例1 :除控海桿菌（Marinobacterhy化ocarbonoclasticus)STW2的分離和純 化.
[0014] 樣品采集：2012年4月于中國(guó)海南省新村灣海草生態(tài)系統(tǒng)海富蒲巧nhalus acodoides)根際沉積物，取Ig沉積物樣品于裝有100血無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基并含有一定量 PAHs(糞、巧和巧各含量為lOOmg/L)的S角瓶中，W多環(huán)芳控（奈、巧和巧）為唯一碳源，采 用定向富集法、逐級(jí)馴化獲得菌株，用錫錐紙包裹遮光置于搖床中30°C，200rpm震蕩培養(yǎng)， 然后進(jìn)一步通過(guò)反硝化培養(yǎng)基培養(yǎng)進(jìn)行篩選、分離和純化，最終篩選出一株具有兼具有好 氧反硝化和多環(huán)芳控降解能力的菌株，命名為：菌株STW2。
[0015]反硝化培養(yǎng)基：pH:7. 0，含KN032.Og，M拆〇4. 7&0 0.誠(chéng)，K2HPO4.抓2〇 0.5邑， 〔4〇班2謂曰20.0g，去離子水1L。滅菌消毒備用。
[0016] 無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基（MSM)的組分為：(NH4)2S04,l，000mg/L、Na2HP〇4,800mg/ L、KH2PO4, 200mg/L、M拆O4? 7&0, 200mg/L、Ca(N〇3)2? 4&0, 50mg/L;其中微量元素： FeCls? 3電0, 5mg/L、（NH4)gM〇7〇24 ? 4電0,Img/L、MnClz, 0. 2mg/L、CuS〇4, 0. 02mg/L、 CoCl2,〇. 02mg/L。滅菌消毒備用
[0017]實(shí)施例 2 :除控海桿菌（Marinobacterhy化ocarbonoclasticus)STW2 的鑒定 陽(yáng)〇1引1、形態(tài)學(xué)特征：
[0019] 菌株STW2,為革蘭氏陰性，桿狀，在LB或2216E培養(yǎng)基上，菌落均呈灰白色，不透 明，表面光滑濕潤(rùn)，邊緣比較規(guī)則，中央微凸起，菌落形態(tài)大小l-3mm，化C1的生長(zhǎng)范圍為 0-22%，最適濃度為5%，能夠進(jìn)行硝酸鹽還原，利用屯葉巧、葡萄糖、麥芽糖和木糖。
[0020] 2、16SrDNA和功能基因序列鑒定：
[0021] 選擇實(shí)施例1分離純化得到的菌株STW2進(jìn)行基因組DNA提取和純化，其操作方法 參考東秀珠《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》?4。9。采用細(xì)菌的通用引物16SF/16SR(Weisenburget 曰1., 1991，16Sribosom曰1DNAamplificationforphylogeneticstudy.Journalofb曰c teriology, 1991, 173(2):697_703)和nosZ的引物巧ichJ,etal.Communitycomposition andfunctioningofdenitrifyingbacteriafromadjacentmeadowandforestsoils. AppliedandElnvironmentalMicrobiology, 2003, 69 (10): 5974-5982.)作為引物，W菌株STW2基因組DM作為模板，進(jìn)行16SrDNA的PCR擴(kuò)增，具體的PCR反應(yīng)體系如下：16SrDNA PCR擴(kuò)增程序如下：94°C預(yù)變性5min;94°C變性60sec，退火溫度55°C復(fù)性90sec，72°C延伸 60sec，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)后；72°C延伸lOmin;nosZ的PCR程序?yàn)?5°C預(yù)變性5min;95°C變性 30sec，退火溫度55°C復(fù)性40sec，72°C延伸40sec，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)后；72°C延伸lOmin。取 5yL的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，電壓為100V，瓊脂糖凝膠為1 %，邸泡膠，用凝膠成像系統(tǒng)觀察 泳結(jié)果并拍照，若有目的條帶的出現(xiàn)，則將剩余的PCR產(chǎn)物直接交與Invitrogen生物技術(shù) 有限公司用ABIPrism3730化DNA分析系統(tǒng)測(cè)序，并將測(cè)序分析得到的16SrDNA(其核巧 酸序列如SEQIDNO. 1所示）和一氧化氮還原酶nosZ(其核巧酸序列如SEQIDNO. 2所 不）通過(guò)ExtaxonCloud或者GenBank中的BLAST與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì)， 對(duì)其種屬鑒定進(jìn)行初步的確定。建立系統(tǒng)發(fā)育樹，系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1，從圖1的系統(tǒng)發(fā)育樹 可W看出與菌株STW2的16SrDNA序列具有較近親緣關(guān)系的序列均來(lái)自Marinobacter屬， 其與Marinobacterhy化ocarbonoclasticusATCC49840 的相似度為 97. 70%;圖 2 中菌株 STW2的nosZ基因與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的海桿菌M.pelagiusR42的相似度為85%。由此表明菌 株STW2的為一株潛在新種，命名為：除控海桿菌（Marinobacterhy化ocarbonoclasticus) STW2,于2014年7月10號(hào)保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中屯、（CCTCC)，中國(guó)武漢武漢大學(xué)，保 藏編號(hào)為CCTCCNO:M2014339。 陽(yáng)02引實(shí)施例3 :菌株STW2的反硝化功能效率測(cè)定
[0023]將待測(cè)菌株-除控海桿菌（Marinobacterhy化ocarbonoclasticus)STW2 接種 到反硝化液體培養(yǎng)基中，于30°C，18化pm過(guò)夜培養(yǎng)，待菌液渾濁后取適量分別接種到24 個(gè)含有60mL反硝化液體培養(yǎng)基的lOOmL錐形瓶中，并保證每個(gè)瓶中的初始接種量是相同 的。分別在Oh、化、1化、24h、3化、4化、6化和72h(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3個(gè)重復(fù)），取出上清液，測(cè) 定其N03-N和N02-N的含量（N03-N采用GB7480-87酪二橫酸紫外分光光度法（Gi虹inget al.，2010) ;N02-N采用GB7493-87N-(1-糞基）-乙二胺分光光度法（Fanetal.，2006)，功 能菌株的反硝化速率的計(jì)算公式如下：
[0024]反硝化液體培養(yǎng)基：pH:7. 0,含KN032.Og，M拆〇4. 7&0 0. 2g，K2HPO4. 3&0 0.5邑， C^eHsKNa20.Og，去離子水1L。滅菌消毒備用。
[002引反硝化速率（mg?L1 ?h1)=(陽(yáng)03-閑initial-陽(yáng)03-閑final-陽(yáng)02-閑final)/t.
[0026]其中：[NO3-閑initial:反應(yīng)前硝態(tài)氮濃度； 陽(yáng)027] 陽(yáng)〇3_閑final;反應(yīng)后硝態(tài)氮濃度；
[0028] 陽(yáng)〇2-閑final:反應(yīng)后硝態(tài)氮濃度.
[0029] 結(jié)果如圖3所示，從圖3中可W看出，在前24h內(nèi)，硝酸鹽濃度由145mg/L降至 58mg/l，脫氮效率高達(dá)為60 %，而4化內(nèi)，脫氮效率高達(dá)74 %，整個(gè)反應(yīng)過(guò)程中，脫氮效率約 為86%，而且在整個(gè)反應(yīng)過(guò)程中沒有亞硝酸鹽的積累，因而沒有氮素富集效應(yīng)，對(duì)于環(huán)境中 的其他生物不會(huì)產(chǎn)生毒害效應(yīng)，具有生態(tài)修復(fù)的巨大潛力。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.除徑海桿菌（Marinobacter hydrocarbonoclasticus)STW2,其保藏編號(hào)為CCTCC NO :M 2014339。2.權(quán)利要求1所述的除徑海桿菌（Marinobacter hydrocarbonoclasticus)STW2在通 過(guò)反硝化進(jìn)行脫氮中的應(yīng)用或者在降解多環(huán)芳烴有機(jī)物中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種具有反硝化功能的除烴海桿菌STW2及其應(yīng)用。除烴海桿菌(Marinobacter？hydrocarbonoclasticus)STW2，其保藏編號(hào)為CCTCC？NO：M？2014339。本發(fā)明的除烴海桿菌(Marinobacter？hydrocarbonoclasticus)STW2具有反硝化和有機(jī)物多環(huán)芳烴降解功能，因此可以將其應(yīng)用于反硝化進(jìn)行脫氮中以及降解多環(huán)芳烴有機(jī)物，從而能夠有效應(yīng)用于海洋濱海濕地生態(tài)系統(tǒng)的修復(fù)和保護(hù)中，具有較好的應(yīng)用前景。CCTCC NO：M 201433920140710
【IPC分類】C12N1/20, C02F3/34, C02F101/32, C12R1/01
【公開號(hào)】CN105199994
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510703056
【發(fā)明人】凌娟, 董俊德, 張燕英, 楊清松, 林麗云, 曾思泉, 周衛(wèi)國(guó)
【申請(qǐng)人】中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所
【公開日】2015年12月30日
【申請(qǐng)日】2015年10月23日