烷烴的重組合成的制作方法
【專利說明】燒炫的重組合成
[0001] 巧關申請的香叉引用
[0002] 本申請設及2013年1月25日提交的美國臨時專利申請61/756, 973號和2013年 5月23日提交的美國臨時專利申請61/826, 637號；其均出于全部目的而通過引用在此全 文并入。
[0003] 序列表
[0004] 本發(fā)明包含經由EFS-Web提交的序列表，且其通過引用在此全文并入。所述ASCII 拷貝創(chuàng)建于20XX年XX月，命名為XXXXXUS_sequencelisting.txt，大小為X，XXX，XXX字節(jié)。
【背景技術】
[0005] 許多現(xiàn)有的光能自養(yǎng)生物（即，植物、藻類和光合細菌）不適合工業(yè)化生物處理， 且因此沒有顯現(xiàn)出商業(yè)上的可行性。已經對重組光合微生物進行工程化來W超過該生物體 天然產生的水平的量生產控類和醇類。

【發(fā)明內容】

[0006] 本文描述了工程化微生物，其中所述工程化微生物包含編碼一種或多種酶的 一種或多種重組基因，所述一種或多種酶具有催化燒控產生的酶活性，其中所述酶活性 包括：燒控脫甲酯單加氧酶活性、硫醋酶活性、簇酸還原酶活性和憐酸泛酷琉基乙胺基 (地OS地opanthetheinyl)轉移酶活性；燒控脫甲酯單加氧酶活性、硫醋酶活性、長鏈脂肪 酸CoA-連接酶活性和長鏈酷基-CoA還原酶活性；和/或燒控脫甲酯單加氧酶活性、丙酬酸 脫簇酶活性和2-酬酸脫簇酶活性。
[0007] 在一些方面，酶包括燒控脫甲酯單加氧酶、硫醋酶、簇酸還原酶和憐酸泛酷琉基乙 胺基轉移酶。在一些方面，燒控脫甲酯單加氧酶具有EC編號4. 1. 99. 5,硫醋酶具有EC編 號3. 1. 2. 14,簇酸還原酶具有EC編號1. 2. 99. 6,和憐酸泛酷琉基乙胺基轉移酶具有EC編 號2. 7. 8. 7。在一些方面，燒控脫甲酯單加氧酶由a血編碼，硫醋酶由化巧或化tB2編碼， 簇酸還原酶由Ca巧編碼，和憐酸泛酷琉基乙胺基轉移酶由entD編碼。
[0008] 在一些方面，具有燒控脫甲酯單加氧酶活性的酶具有EC編號4. 1. 99. 5。在一些方 面，具有硫醋酶活性的酶具有EC編號3. 1. 2. 14。在一些方面，具有簇酸還原酶活性的酶具 有EC編號1. 2. 99. 6。在一些方面，具有憐酸泛酷琉基乙胺基轉移酶活性的酶具有EC編號 2. 7. 8. 7〇
[0009] 在一些方面，酶包括燒控脫甲酯單加氧酶、硫醋酶、長鏈脂肪酸CoA-連接酶和長 鏈酷基-CoA還原酶。在一些方面，燒控脫甲酯單加氧酶具有EC編號4. 1. 99. 5、硫醋酶具 有EC編號3. 1. 2. 14、長鏈脂肪酸CoA-連接酶具有EC編號6. 2. 1. 3和長鏈酷基-CoA還原 酶具有EC編號1. 2. 1. 50。在一些方面，燒控脫甲酯單加氧酶由a血編碼，硫醋酶由化巧或 fatB2編碼，長鏈脂肪酸CoA-連接酶由化曲編碼，和長鏈酷基-CoA還原酶由acrM編碼。
[0010] 在一些方面，具有燒控脫甲酯單加氧酶活性的酶具有EC編號4. 1. 99. 5。在一些方 面，具有硫醋酶活性的酶具有EC編號3. 1.2. 14。在一些方面，具有長鏈脂肪酸CoA-連接酶 活性的酶具有EC編號6. 2.I. 3。在一些方面，具有長鏈酷基-CoA還原酶活性的酶具有EC編號 1. 2. 1. 50。
[0011] 在一些方面，一種或多種重組基因包含編碼催化酷基-ACP轉化為脂肪酸的硫醋 酶的重組基因。在一些方面，一種或多種重組基因包含編碼使由簇酸還原酶基因編碼的蛋 白質的ACP部分憐酸泛酷琉基乙胺基化（phosphopatetheinylate)的憐酸泛酷琉基乙胺基 轉移酶的重組基因。在一些方面，一種或多種重組基因包含編碼催化脂肪酸轉化為脂肪醒 的簇酸還原酶的重組基因。在一些方面，一種或多種重組基因包含編碼催化脂肪醒轉化為 燒控或締控的燒控脫甲酯單加氧酶的重組基因。在一些方面，一種或多種重組基因包含編 碼催化脂肪酸轉化為酷基-CoA的脂肪酸CoA-連接酶的重組基因。在一些方面，一種或多 種重組基因包含編碼催化酷基-CoA轉化為脂肪醒的酷基-CoA還原酶的重組基因。
[0012] 在一些方面，酶包括燒控脫甲酯單加氧酶、丙酬酸脫簇酶和2-酬酸脫簇酶。
[0013] 在一些方面，所述微生物是細菌。在一些方面，所述微生物是革蘭氏陰性細菌。在 一些方面，所述微生物是大腸桿菌。
[0014] 在一些方面，所述微生物是光合微生物。在一些方面，所述微生物是藍細 菌。在一些方面，所述微生物是耐熱性藍細菌。在一些方面，所述微生物是聚球藻屬 (Synechococcus)的種。
[0015] 在一些方面，包含一種或多種重組核酸序列的操縱子的表達受重組啟動子控制， 其中啟動子是組成型或誘導型的。在一些方面，所述操縱子被整合到所述微生物的基因組 中。在一些方面，所述操縱子在染色體外。
[0016] 在一些方面，所述燒控的長度小于或等于11個碳原子。在一些方面，所述燒控的 長度為7至11個碳原子。在一些方面，所述燒控的長度為7、8、9、10或11個碳原子。在一 些方面，所述燒控的長度小于或等于18個碳原子。在一些方面，所述燒控的長度為7至18 個碳原子。在一些方面，所述燒控的長度為5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18個 碳原子。
[0017] 在一些方面，所述重組基因與表中所示序列至少90%或至少95%相同。
[0018] 本文還描述了包含培養(yǎng)基和本文所述微生物的細胞培養(yǎng)物。
[0019] 本文還描述了生產控的方法，其包括：在培養(yǎng)基中培養(yǎng)本文所述工程化微生物，其 中相對于在相同條件下培養(yǎng)的其他方面相同但缺乏所述重組基因的微生物，所述工程化微 生物產生增加量的燒控。在一些方面，該方法還包括允許燒控在培養(yǎng)基或生物體中積累。在 一些方面，該方法還包括分離燒控的至少一部分。在一些方面，該方法還包括處理分離的燒 控W產生經處理的材料。
[0020] 本文還描述了用于生產控的方法，其包括：（i)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)本文所述工程化 微生物；和（ii)使所述工程化微生物暴露于光和無機碳，其中所述暴露導致所述無機碳被 所述微生物轉化為燒控，其中所述燒控W比由在相同條件下培養(yǎng)的其他方面相同但缺乏所 述重組基因的微生物產生的量更大的量產生。在一些方面，該方法還包括允許燒控在培養(yǎng) 基或生物體中積累。在一些方面，該方法還包括分離燒控的至少一部分。在一些方面，該方 法還包括處理分離的燒控W產生經處理的材料。
[0021] 本文還描述了包含燒控的組合物，其中所述燒控由本文所述方法產生。在一些方 面，組合物包含至少50 %、至少60 %、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少 99 %的燒控。
[0022] 本發(fā)明在某些實施方式中提供了由工程化生物生產短鏈燒控或締控的方法，該方 法包括：在工程化微生物中表達重組燒醒（a化anal)脫甲酯單加氧酶（"ADM");和在有效 地生產短鏈燒控或締控的條件下在含有碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)工程化微生物。
[0023] 在實施方式中，ADM催化醒轉化為燒控或締控，其中醒選自乙醒、下醒、丙醒、異下 醒、下醒、3-甲基-1-下醒和2-苯基乙醒。在實施方式中，燒控或締控選自甲燒、丙烷、乙 燒、下燒、丙烷、異下燒和甲苯。在實施方式中，由工程化生物產生短鏈燒控或締控的方法包 括在工程化微生物中表達重組丙酬酸脫簇酶（"Pdc")。在某些實施方式中，Pdc與SEQID N0:46至少90%相同。在實施方式中，由工程化生物產生短鏈燒控或締控的方法包括在工 程化微生物中表達2-酬酸脫簇酶。在某些實施方式中，Pdc或2-酬酸脫簇酶在受單一啟 動子控制的操縱子中表達。
[0024] 在實施方式中，操縱子包含ADM。在某些實施方式中，ADM與SEQIDNO: 36至少 90%相同。
[00巧]本文還提供了包含工程化微生物的實施方式，其中工程化微生物包含編碼燒醒脫 甲酯單加氧酶（"ADM")的重組基因，并且其中工程化微生物還包含編碼選自丙酬酸脫簇酶 和2-酬酸脫簇酶的酶的重組基因。
[0026] 在一個實施方式中，ADM催化醒轉化為燒控或締控，其中醒選自乙醒、下醒、丙醒、 異下醒、2-甲基-1-下醒、下醒、3-甲基-1-下醒和2-苯基乙醒。在某些實施方式中，燒控 或締控選自甲燒、丙烷、乙燒、下燒、丙烷、異下燒和甲苯。
[0027] 在一個實施方式中，工程化微生物包含重組丙酬酸脫簇酶（"Pdc")。在某些實施 方式中，Pdc與SEQIDNO:46至少90%相同。在一個實施方式中，工程化微生物包含2-酬 酸脫簇酶。在某些實施方式中，Pdc或2-酬酸脫簇酶在受單一啟動子控制的操縱子中表達。
[0028] 在一個實施方式中，操縱子包含ADM。在一些實施方式中，工程化微生物是工程化 藍細菌。在某些實施方式中，ADM與SEQIDNO: 36至少90%相同。
[0029] 本文還提供了包含細胞培養(yǎng)物的實施方式，所述細胞培養(yǎng)物包含重組微生物和含 有碳源的培養(yǎng)基，其中當重組微生物在有效地表達多膚的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，催化 醒轉化為燒控的多膚在重組微生物中過表達，并且燒控或締控在細胞培養(yǎng)物中產生。在實 施方式中，多膚具有燒醒脫甲酯單加氧酶活性。在實施方式中，多膚包含與SEQIDN0:36 具有至少90 %同一性的氨基酸序列。在一些實施方式中，醒選自乙醒、下醒、丙醒、異下醒、 下醒、3-甲基-1-下醒和2-苯基乙醒。
[0030] 在實施方式中，燒控或締控選自甲燒、丙烷、乙燒、下燒、丙烷、異下燒和甲苯。在實 施方式中，燒控是短鏈燒控。在某些實施方式中，燒控包含C2到C4燒控。在一些實施方式 中，燒控包含Cz到C7燒控。在實施方式中，燒控或締控被分泌到培養(yǎng)基中。
[0031] 在實施方式中，重組微生物還包含包括丙酬酸脫簇酶（"Pdc")活性的重組多膚。 在某些實施方式中，Pdc與沈QIDN0:46至少90%相同。在實施方式中，工程化微生物還 包含重組2-酬酸脫簇酶。在一些實施方式中，Pdc或2-酬酸脫簇酶在受單一啟動子控制 的操縱子中表達。在實施方式中，操縱子包含ADM。
[0032] 在實施方式中，重組微生物選自酵母、真菌、絲狀真菌、藻類和細菌。在一些實施方 式中，微生物是藍細菌。
[0033] 本文還提供了包含用于生產異下燒或異下燒衍生物的方法的實施方式，該方法包 括在體外將ADM與醒接觸。在實施方式中，ADM與SEQIDNO: 36至少90%相同。在某些實 施方式中，ADM是點形念珠藻（Nostocpuncti化;rme)ADM。在實施方式中，醒是3-甲基下 醒。
[0034] 本發(fā)明的運些實施方式和其他實施方式于此在附圖、說明書、實施例和權利要求 中作進一步描述。
【附圖說明】
[003引圖1.示出AcrM蛋白質在大腸桿菌中過表達的SDS-PAGE凝膠。
[0036] 圖2. (A)癸酷基-CoA和做月桂酷基-CoA分析的TIC色譜圖。實線：野生型 化21 0E3);虛線：acrM-表達化21 0E3)。
[0037] 圖3.示出檢測到由表達A血、CarB、TesA和ElntD蛋白質的聚球藻（Synechococ州S SP. )PCC7002株產生的C13和C15燒控的GC/FID色譜圖?；疑E線：對照菌株（不表達 CarB蛋白質）；黑色實線跡線：C13、C14和C15正燒控的標準品；黑色虛線跡線：表達A血、 CarB、TesA和化tD蛋白質的聚球藻P(X7002株。
[0038] 圖4.來自酸喂食（acid-fed)(虛線）或對照（實線）的表達A血和CarB的聚球 藻P(X7002的樣品的TIC色譜圖。A和D:辛酸喂食；B和E:癸酸喂食；C和F:十二燒酸喂 食。
[0039] 圖5.示出檢測到由表達A血、CarB、化tB2和化tD蛋白質的聚球藻P(X7002株在 1化和7化時產生的壬燒的GC/FID色譜圖。實線跡線：對照菌株（野生型）；點狀跡線：表 達A血、CarB、化tB2和化tD蛋白質的聚球藻P(X7002株。
[0040] 圖6.燒控產生途徑的實例。注意，可W通過產生使Ca巧蛋白質的ACP部分憐酸 泛酷琉基乙胺基化的entD(憐酸泛酷琉基乙胺基轉移酶）的產物來促進CarB的使用。例 如，可W使用芽抱桿菌度acillus)entD，其酶產物具有包括CarB在內的廣泛底物譜。
[0041] 圖7.當用癸酸和十二燒酸喂食時，檢測到由表達A血、硫醋酶、CarB、和化tD蛋白 質的聚球藻？(：口002株產生的壬燒（A)和^^一燒度）。圓圈：在細胞團塊中檢測的燒控；S 角形：在十六燒上覆層（overlay)中檢測的燒控。
[0042] 圖8.示出了通過表達A血、硫醋酶、CarB、和化tD蛋白質的聚球藻P(X7002株從 C〇2生物合成壬燒（A)和十一燒度）（其分泌到十六燒上覆層中）的GC/FID色譜圖。實線 跡線：第0天的樣品；點狀跡線：第5天的樣品。
[0043] 圖9.通過表達A血、硫醋酶、CarB、和化tD蛋白質的聚球藻P(X7002株從C〇2生物 合成十一燒角形）和壬燒（圓圈）（其分泌到十六燒上覆層中）的時程。
[0044] 圖10.示出檢測到由表達A血、CarB、TesAm和化tD蛋白質的7002株產生的C13 和C15燒控的GC/FID色譜圖。實線：對照株；虛線：ALK-C13C15 (實驗株）。
[0045] 圖11.ALK-C13C15在10天時間的生長曲線。
[0046] 圖12.ALK-C13C15在10天時間的十S燒和十五燒的產量曲線。
[0047] 圖13.描述了化S廠標記ADM酶的Ni-NTA純化的級分。標示出合并W用于分析 的收集的級分。
[0048] 圖14.通過JCC6036從C02生物合成^^一燒（S角形）的時程。
[004引圖15.當用癸酸喂食時，檢測到由表達A血、CarB和化tD蛋白質的7002株產生的 壬燒。通過表達pAQ3上的化is標記A血，初始活性與pAQ4上的相比明顯提高。
【具體實施方式】
[0050] 除非本文中另有限定，關于本發(fā)明使用的科學和技術術語應具有本領域普通技術 人員通常理解的含義。此外，除非上下文需要，單數術語應該包含復數而復數術語應當包含 單數。通常，與本文中描述的生物化學、酶學、分子和細胞生物學、微生物學、遺傳學及蛋白 質和核酸化學作用及與雜交相關使用的術語及其技術是本領域眾所周知和常用的。
[0051] 除非另有注明，本發(fā)明的方法和技術通常依據本領域公知的常規(guī)方法和按本說明 書中引用和討論的各種一般的和更具體的參考文獻中描述的進行。參見，例如，Sambrook 等，MolecularCloning:ALaboratoryManual，第二片反，ColdSpringHarborLaboratory Press，ColdSpringHarbor，N.Y. (1989);Ausubel等，CurrentProtocolsinMolecular Biology,GreenePublishingAssociates(1992,和 2002 增刊）；Ha;rlow和Lane, Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpring Harbor，N.Y. (1990) ;Taylor和Drickamer，IntroductiontoGlycobiology，OxfordUniv. Press(2003)；WorthingtonEnzymeManual,WorthingtonBiochemicalCorp.，F(xiàn)reehold， N.J.；HandbookofBiochemistry:SectionAProteins，VolI，CRCPress(1976)； HandbookofBiochemistry:SectionAProteins，VolII，CRCPress(1976)；Essentials ofGlycobiology，ColdSpringHarborLaboratoryPress(1999)。
[0052] 本文中設及的所有公開出版物、專利和其他參考文獻通過引用在此全文并入。
[0053] W下術語，除非另有說明，應當被理解為具有W下含義：
[0054] 術語"多核巧酸"或"核酸分子"是指至少10個堿基長度的核巧酸聚合形式。該術 語包括DNA分子（如cDNA或者基因組DNA或合成DNA)和RNA分子（如mRNA或合成RNA)， W及包含非天然核巧酸類似物、非原始核巧間鍵（intemucleosidebond)或兩者的DNA或 RNA類似物。核酸可W是任何拓撲構象。例如，核酸可W是單鏈的、雙鏈的、=鏈的、四重體 的、部分雙鏈的、分枝的、發(fā)夾的、環(huán)形的或是扣鎖構象的。
[005引除非另有說明，并作為在本文中妒'SEQIDNO:"的一般形式描述的所有序列的例 子，"包含SEQIDNO: 1的核酸"是指其至少一部分具有（i)SEQIDNO: 1的序列，或（ii)與 SEQIDNO: 1互補的序列的核酸。運兩者間的選擇由上下文決定。例如，如果該核酸被用作 探針，運兩者間的選擇由探針與所希望的祀互補的需要決定。
[0056]"分離"的RNA、DNA或混合聚合物是在其天然宿主細胞中與天然多核巧酸自然伴隨 的其他細胞成分（如與其自然相關的核糖體、聚合酶W及基因組序列）基本上分離的RNA、 DNA或混合聚合物。
[0057] 如本文所用，"分離的"有機分子（如燒控）是與其所來源的宿主細胞的細胞成分 (膜脂質、染色體、蛋白質），或與宿主細胞在其中培養(yǎng)的培養(yǎng)基基本上分離的有機分子。盡 管特定的分離的生物分子可W被純化至接近均質，但該術語不要求生物分子與所有其他化 學物質分離。
[005引術語"重組的"是指（1)已從其所天然存在的環(huán)境中移除的，似不與在其中天然 發(fā)現(xiàn)該基因的多核巧酸的全部或部分相關聯(lián)的，（3)與并非與之天然相連的多核巧酸可操 作地相連的，或（4)自然界中不存在的生物分子，如基因或蛋白質。術語"重組的"可用于 指克隆的DNA分離物、化學合成的多核巧酸類似物、或通過異源系統(tǒng)生物合成的多核巧酸 類似物，W及由運樣的核酸編碼的蛋白質和/或mRNA。
[0059] 如本文所用，如果異源序列被置于與內源核酸序列相鄰使得該內源核酸序列的表 達被改變，則生物體的基因組中的該內源核酸序列（或該序列的編碼蛋白質產物）在本文 中被認為是"重組的"。在運種情況下，異源序列是與內源核酸序列非天然相鄰的序列，無論 該異源序列是其自身內源的（源自相同的宿主細胞或其后代）還是外源的（源自不同的宿 主細胞或其后代）。舉例來說，啟動子序列可W替換（例如通過同源重組）宿主細胞基因組 中的基因的天然啟動子W使得該基因表達模式改變。因為該基因至少與一些天然位于其側 翼的序列分離，該基因現(xiàn)變?yōu)槭?重組的"。
[0060] 如果核酸含有任何對于基因組中的相應核酸并非天然存在的改變，則該核酸也被 認為是"重組的"。例如，如果內源編碼序列含有人為導入（如通過人為干預）的插入、缺失 或點突變，則該內源編碼序列被認為是"重組的"。"重組的核酸"也包括在異源位點整合到 宿主細胞染色體中的核酸W及作為附加體存在的核酸構建體。
[0061] 如本文所用，短語參考核酸序列的"簡并變體"包括可W依據標準遺傳密碼翻譯W 提供與從參考核酸序列翻譯的氨基酸序列相同的氨基酸序列的核酸序列。術語"簡并寡核 巧酸"或"簡并引物"用于表示能夠與序列上不是必須相同而是在一個或多個特定區(qū)段內彼 此同源的祀核酸序列雜交的寡核巧酸。
[0062] 設及核酸序列的術語"百分序列同一性"或"相同"是指當W最大對應性比對時 相同的兩個序列中的殘基。序列同一性比較的長度可W覆蓋至少約9個核巧酸的延伸，通 常至少約20個核巧酸，更經常至少約24個核巧酸，通常至少約28個核巧酸，更通常至少 約32個核巧酸，且優(yōu)選至少36個或更多的核巧酸。本領域中有多種已知的不同算法可用 于測定核巧酸序列同一性。例如，可W使用作為WisconsinPackage版本10. 0，Genetics ComputerGroup(GCG)，Madison,Wis中的程序的FASTA、Gap或Beatfit來比較多核巧酸 序列。FASTA提供查詢和檢索序列間最佳重疊區(qū)域的比對和百分序列同一性?；痑rson, MethodsEnzymol. 183:63-98(1990)(通過引用全文并入本文）。例如，核酸序列間的百分序 列同一性可W利用FASTAW其默認參數化的字長和用于得分矩陣的NOPAM因子），或使用 GCG版本6.1 (通過應用并入全文）中提供的GapW其默認參數來確定?？蛇x擇地，可W使 用計算機程序BLAST來比較序列（Altschul等，J.Mol.Biol. 215:403-410 (1990);Gish和 States,化 1:ureGenet. 3:266-272(1993);Madden等，Meth.Enzymol. 266:131-141 (1996); Altschul等，NucleicAcidsRes. 25:3389-3402(1997);Zhang和Madden,Genome Res. 7:649-656(1997))，特別是blas1:p或憂lastn(Altschul等，NucleicAcids Res.25:3389-3402(1997))。
[0063] 術語"基本