一種cyp2c9*3基因擴增的檢測引物組及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種SNP的試劑盒，具體講，涉及一種CYP2C9*3基因擴增的檢測引物 組及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 華法林是臨床常用治療血栓性疾病的一種香豆素類口服抗凝藥，具有抗凝和溶 栓的雙重作用。華法林的抗凝治療指數(shù)范圍狹窄，如果劑量不足則達不到治療效果，劑量 稍過量則會引起出血，重者危及病人生命。然而，華法林血漿藥物濃度和療效存在明顯的 個體差異和種族差異，有研究表明，不同患者使用抗凝血藥物華法林的劑量可以相差20 倍，亞洲人的維持劑量比白種人要低30%~40%。因此，如何在臨床上安全、合理使用華 法林長期以來是許多研究者關(guān)注的重點和難點。
[0003] 近年來，隨著藥物基因組學(xué)的發(fā)展和華法林藥理作用分子機制的闡明，單核苷 酸基因多態(tài)性在華法林用量個體差異中的作用越來越受到人們的重視。目前，已知與華 法林的藥效學(xué)和藥動學(xué)相關(guān)的基因達30余種，其中細(xì)胞色素P4502C9基因（Cytochrome P4502C9，CYP2C9)的基因多態(tài)性是影響華法林用量個體差異最主要的遺傳因素之一。細(xì) 胞色素氧化酶P450可直接將華法林代謝為無活性的產(chǎn)物，而華法林是維生素K的拮抗劑 (VKA)，通過抑制肝臟環(huán)氧化還原酶而產(chǎn)生抗凝作用。因此，CYP2C9基因決定了華法林的抗 凝效果。
[0004] CYP2C9即是華法林最主要的代謝酶。到目前為止，已發(fā)現(xiàn)的CYP2C9的等位基因 有30種，其中以*1(野生型）、*3(11 63591^11，3即^1057910)最為常見。攜帶有變異性 等位基因的患者，其華法林代謝酶的活性明顯低于野生型，并且其出血的危險性增加2~ 3倍。
[0005] 華法林有R和S兩個亞型，其中S型抗維生素K的作用最明顯，R型在體內(nèi)基本不 起作用。細(xì)胞色素氧化酶P450CYP2C9基因可將S型華法林代謝為無活性或低活性的產(chǎn)物， S型華法林直接作用于維生素K環(huán)氧化物還原酶，使維生素K的氧化型和還原型不能相互 轉(zhuǎn)化，從而抑制維生素K的功能，同時也抑制一些凝血因子的激活。大量研究證明，CYP2C9 基因多態(tài)性可影響華法林的起始使用劑量，CYPC9*3AA型用藥劑量最高，AC雜合型次之，CC 型最低。華法林在不同種族、年齡、性別人群中的劑量千差萬別，很大的原因在于CYP2C9基 因的多態(tài)性。而CYP2C9基因中，通過檢測位點的多態(tài)性然后再結(jié)合患者相關(guān)臨床信息運用 藥理遺傳學(xué)的相關(guān)法則基本上可確定華法林的起始使用劑量。
[0006] 美國FDA批準(zhǔn)的基因診斷和檢測項目有2000項左右，其中1290多項已完全批準(zhǔn) 用于臨床，大約1000項正在審批過程中。實踐證明，基因多態(tài)性檢測是有效的。我國應(yīng)該 使用華法林而未使用的人群達90%左右，房顫患者僅有6. 6%正確使用華法林，其原因是 不能確定華法林使用的準(zhǔn)確劑量，不能規(guī)范監(jiān)測INR。這樣，房顫導(dǎo)致卒中患者明顯增加，臨 床統(tǒng)計顯示大約有1/3的腦卒中患者由房顫引起。倘若臨床醫(yī)生通過基因檢測的手段來確 定華法林的起始使用劑量，安全使用華法林，就會減少房顫的致殘率和致死率。
[0007] 以下是現(xiàn)在對CYP2C9*3的分型方法。
[0008] Taqman方法：針對SNP位點變異設(shè)計特異性的探針，探針標(biāo)記成本較高；采用熒光 淬滅及雙末端標(biāo)記技術(shù)，有淬滅難以徹底、本底較高的缺陷；采用酶外切活性，定量時受酶 性能的影響。
[0009] DHPLC技術(shù)和質(zhì)譜分析：分別需要用到高效液相色譜儀與質(zhì)譜儀，設(shè)備昂貴，難以 在臨床診測中推廣。
[0010] DNA芯片：由于高通量等優(yōu)點在SNP檢測中得到大量應(yīng)用，但其依靠野生型與突 變型基因雜交動力學(xué)的差異對突變位點進行檢測，由于不同位點之間的雜交動力學(xué)差異不 同，在進行多位點同時檢測時條件難以控制、可重復(fù)性差，易出現(xiàn)假陽性假陰性結(jié)果。
[0011] 微測序：作為一種基于陣列的突變分析，目前還面臨著如何降低假陰性率和靶核 苷酸序列組成的變異等關(guān)鍵問題。
[0012] 高溫連接酶法：高溫連接酶檢測反應(yīng)（ligase detection reaction，LDR)是近幾 年逐漸引起人們注意的一種新型基因多態(tài)性檢測方法，該技術(shù)操作簡單、穩(wěn)定，結(jié)果可靠。 俗稱小測序。
[0013] 限制性酶切方法（RFLP):準(zhǔn)確性較好，費用也較低.但只能對一部分含有現(xiàn)成酶 切位點的多態(tài)位點進行分型。
[0014] SNaPshot法：基于焚光標(biāo)記單堿基延伸原理的分型技術(shù)，通常用于10-30個SNP 位點分析。
[0015] DNA測序法：相對準(zhǔn)確，價格較貴。DNA鏈的二級結(jié)構(gòu)容易造成人工假相，使測序 結(jié)果出現(xiàn)偏差。
[0016] 高分辨率熔解曲線法（HRM):是近幾年興起的SNP研究工具該方法，無需設(shè)計探 針，成本低，但結(jié)果準(zhǔn)確度較低。
[0017] 擴增阻礙突變系統(tǒng)（Amplification refractory mutation system，ARMS)):本技 術(shù)通過涉及特異性的引物，有選擇性的擴增野生或突變模版，通過擴增產(chǎn)物的量來確定是 否為野生型或突變型，利用PCR引物的3'端末位堿基必須與其模板DNA互補才能有效擴增 的原理，設(shè)計等位基因特異性PCR擴增引物，在嚴(yán)格的條件下，只有在引物3'堿基與模板配 對時才能出現(xiàn)PCR擴增帶，從而檢測出突變。在不同的引物上加上3個T對擴增出的片段 進行區(qū)分。
[0018] 毛細(xì)管電泳（capillary electrophoresis，CE)又稱高效毛細(xì)管電泳（high performance capillary electrophoresis，HPCE)，是一類以毛細(xì)管為分離通道、以高壓直 流電場為驅(qū)動力的新型液相分離技術(shù)。毛細(xì)管電泳實際上包含電泳、色譜及其交叉內(nèi)容，它 使分析化學(xué)得以從微升水平進入納升水平，并使單細(xì)胞分析，乃至單分子分析成為可能。 [0019]目前國內(nèi)對CYP2C9*3的研究尚屬空白，更沒有成熟的檢測方法或試劑。
[0020] 有鑒于此，特提出本發(fā)明。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0021] 本發(fā)明提供一種CYP2C9*3基因擴增的檢測引物組；
[0022] 本發(fā)明提供一種CYP2C9*3基因擴增的檢測試劑盒。
[0023] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用技術(shù)方案的基本構(gòu)思是：CYP2C9*3基因擴增的 檢測引物組，所述CYP2C9*3檢測引物組包括：
[0024] CYP2C9*3-PD-F1 :如SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列，或由SEQ ID N0:1所示的核 苷酸序列經(jīng)取代、缺失、添加形成的核苷酸序列；
[0025] 0￥?209*3-?042:如5￡〇10勵:2所示的核苷酸序列，或由5￡〇10勵:2所示的核 苷酸序列經(jīng)取代、缺失、添加形成的核苷酸序列；
[0026] CYP2C9*3-PD-R :如SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列，或由SEQ ID N0:3所示的核 苷酸序列經(jīng)取代、缺失、添加形成的核苷酸序列；
[0027] 所述CYP2C9*3-PD_R為熒光引物，其5'端標(biāo)記有熒光基團；
[0028] 作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，所述熒光基團選自由6-羧基熒光素、六氯-6-甲基 熒光素、VC熒光染料、四氯-6-羧基熒光素、羧基-X-羅丹明、6-羧基四甲基羅丹明、磺酰羅 丹明、6-羧基-4'，5' -二氯-2'，7' -二甲氧基熒光素琥珀酰亞胺酯、花菁3、花菁5或花 菁5. 5中的至少一種。
[0029] 作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，所述CYP2C9*3-PD_R的熒光基團為6-羧基熒光素。
[0030] CYP2C9*3基因擴增檢測試劑盒，包括以上所述的CYP2C9*3基因擴增的檢測引物 組。
[0031] 作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，還包括含Mg2+、Taq酶及dNTPs的PCR反應(yīng)液。
[0032] 作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，還包括陰性質(zhì)控品、陽性質(zhì)控品；
[0033] 所述陰性質(zhì)控品為純化水；所述陽性質(zhì)控品為滅活全血。
[0034] 作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，所述試劑盒分為陰性質(zhì)控品、陽性質(zhì)控品、CYP2C9*3 反應(yīng)體系；
[0035] 所述CYP2C9*3反應(yīng)體系包括CYP2C9*3PCR反應(yīng)液12. 5 y L，CYP2C9*3引物混合液 6. 5 y L，待測樣本DNA2 y L，純化水4 y L，共配成25 y L反應(yīng)體系；
[0036] 其中所述CYP2C9*3引物混合液的組成為：1. 5 y L的CYP2C9*3-PD-F1，1. 5 y L的 CYP2C9*3-PD-F2,1. 5 y L 的 CYP2C9*3-PD-R。
[0037] CYP2C9*3陽性質(zhì)控品的構(gòu)建方法包括以下步驟：
[0038] (1)用無菌注射器在受檢者手臂彎曲處或手背處抽取靜脈血3~5mL，置于EDTA 抗凝管（紫蓋）內(nèi)，輕輕顛倒混勻；
[0039] (2)用天根全血試劑盒進行基因組提?。?br>[0040] (3)提純的基因利用紫外分析法測定吸光度，計算濃度，最佳濃度為50ng/ml。
[0041] CYP2C9*3基因擴增檢測試劑盒的使用方法，具體過程如下：
[0042] (1)樣本處理和核酸提取；
[0043] (2)進行PCR反應(yīng)；
[0044] (3)通過基因分析儀檢測，得到片段分析結(jié)果。
[0045] 所述的待測樣本的處理方法包括：磁珠提取法、柱提法、煮沸裂解法和十六烷基三 甲基溴化銨法，優(yōu)選柱提法。
[0046] 作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，步驟（1)中所述的樣本為人類基因組DNA，0D260/ 0D280 在 1. 8-2. 0, DNA 總量在 3-15yg,稀釋 DNA 的終濃度至 50-125ng/yL。
[0047] 作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，稀釋DNA的終濃度至50ng/yL。
[0048]作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，步驟（2)中PCR反應(yīng)的反應(yīng)條件為：37°C保溫2分鐘 后；95°C預(yù)變性3分鐘，92~95°C，10~15秒，55~65°C，10~35秒，共35~45個循環(huán)； 優(yōu)選為：37°C保溫2分鐘后；95°C預(yù)變性3分鐘；94°C，15秒；60°C，35秒；7