一種熒光恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，特別涉及一種不依賴于高能能量分子的熒光恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002]1983年，Mullis等發(fā)明了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)，30多年間，PCR技術(shù)得到長(zhǎng)足發(fā)展，由于其在靈敏度和特異性方面的優(yōu)勢(shì)，PCR技術(shù)被迅速運(yùn)用到科學(xué)研究和臨床研究的各個(gè)方面。這種類似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程的PCR技術(shù)，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。主要包括三個(gè)基本反應(yīng)步驟:(I)模板DNA的變性:通過(guò)加熱一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，成為單鏈；(2)模板DNA與引物的退火(復(fù)性):溫度降至55°C左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；(3)引物的延伸:DNA模板一引物結(jié)合物在72°C、DNA聚合酶(如TaqDNA聚合酶)的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基互補(bǔ)配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈，重復(fù)循環(huán)變性一退火一延伸三過(guò)程就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。這一技術(shù)的開發(fā)極大地促進(jìn)了生物研究的進(jìn)展。
[0003]PCR在技術(shù)應(yīng)用上也有幾點(diǎn)限制:第一，PCR技術(shù)需要昂貴的實(shí)驗(yàn)室儀器，同時(shí)儀器要具備精細(xì)的溫度控制程序和加熱模板，從而實(shí)現(xiàn)很高的溫度下的DNA模板鏈的變性，較低的溫度下引物探針退火延伸模板，這樣重復(fù)溫度變化幾十個(gè)循環(huán)之后實(shí)現(xiàn)模板量的放大。由于每一個(gè)循環(huán)時(shí)間都較短，儀器必須能快速準(zhǔn)確升降溫度，這就需要銀制或金制的加熱模塊，加大儀器研制的成本。第二，PCR擴(kuò)增體系中有用的聚合酶必須具有耐受高溫的能力，否則則必須在每一個(gè)循環(huán)中重新加入新酶，以實(shí)現(xiàn)下一循環(huán)的擴(kuò)增，這樣極容易造成污染也加大了成本。第三，在PCR循環(huán)中，每一個(gè)循環(huán)引物退火的時(shí)間都很短(幾秒到十幾秒)這就要求引物必須快速找到模板上同源匹配的區(qū)段，以實(shí)現(xiàn)延伸。這就要求PCR體系必須有過(guò)量的PCR引物。過(guò)量的引物會(huì)與模板錯(cuò)配，錯(cuò)誤引發(fā)擴(kuò)增，引物二聚體等等，進(jìn)而抑制PCR擴(kuò)增，特別是在模板量低的情況，會(huì)使這種情況加劇。
[0004]與傳統(tǒng)的PCR技術(shù)相比，恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)主要利用重組酶的活性，不進(jìn)行核酸解鏈和退火即可在恒溫條件下(如37°C)進(jìn)行核酸的擴(kuò)增，因此不需要昂貴的儀器，也避免了高溫對(duì)酶的損耗。同時(shí)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在體系中不需要加入過(guò)量的引物，降低了引物與模板錯(cuò)配或生成引物二聚體的可能性。恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)日益受到重視。
[0005]熒光PCR可以更為方便用于定量分析，越來(lái)越受到人們的重視，熒光恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)也得到了進(jìn)一步的發(fā)展。
[0006]常見的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)有以下幾種:滾環(huán)恒溫?cái)U(kuò)增(RCA)，環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增(LAMP)，依賴解旋酶恒溫?cái)U(kuò)增(HDA)等?，F(xiàn)有的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，其反應(yīng)體系比較復(fù)雜，同時(shí)絕大部分恒溫?cái)U(kuò)增體系要么依賴于ATP，要么依賴于肌酸激酶和磷酸肌酸，或其他高能能量分子，所需的試劑種類繁多，擴(kuò)增速度受限于能量的供給，這導(dǎo)致恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)成本比較高，限制了其應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種不依賴于高能能量分子的核酸熒光恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑及方法。
[0008]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:
一種熒光恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑，溶劑為水，其組成如下:
Tris-緩沖液OmM—500mM
乙酸鎂3mM—50mM
二硫蘇糖醇OmM-1OmM
甜菜喊0M-5M
Tween200%-10%
DMSO0%-10%
海藻糖0%-10%
PEG1%—20%
BSAOmg/mL—10mg/mL
dNTPs180uM—100uM
熒光染料、聚合酶、單鏈結(jié)合蛋白、重組酶，各適量；
重組酶為不依賴于能量分子的重組酶。
[0009]優(yōu)選的，熒光恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑的組成如下:
Tris-緩沖液1mM-1OOmM
乙酸鎂5mM—20mM
二硫蘇糖醇OmM-1OmM
甜菜喊0M-2M
Tween200%-1%
DMSO0%-10%
海藻糖0%-10%
PEG1%—20%
BSAOmg/mL—lmg/mL
dNTPs200uM—500uM
熒光染料、聚合酶、單鏈結(jié)合蛋白、重組酶，各適量。
[0010]優(yōu)選的，熒光恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑用到的TriS-緩沖液的pH為7?9。
[0011 ] 熒光恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑用到的Tr i S-緩沖液選自Tr i S-乙酸，Tris-H2SO4,
Tris-HCl0
[0012]熒光恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑用到的熒光染料為SYBR green I，SYTO-9，SYT0-12，
SYT0-60，SYTO-62，SYTO-16，SYT0-82 或 P0P0-3，T0T0-3，T0-PR0-3 中的一種。
[0013]優(yōu)選的，熒光恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑用到的重組酶選自E.coli RecT蛋白；λ噬菌體
β蛋白；啤酒酵母S印I/STP β ;啤酒酵母DPA蛋白；啤酒酵母STPa蛋白；粟酒裂殖酵母
P14VExo 蛋白以及 Rrp 1、HPP- 1、v-SEP、ICP8 蛋白。
[0014]優(yōu)選的，熒光恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑中添加有逆轉(zhuǎn)錄酶，用于檢測(cè)RNA。
[0015]一種核酸熒光恒溫?cái)U(kuò)增方法，包括將探針、引物、模板與恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑混合，恒溫?cái)U(kuò)增至預(yù)期量后，將恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系的酶滅活，完成恒溫?cái)U(kuò)增，其中，恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑如上所述。
[0016]優(yōu)選的，恒溫?cái)U(kuò)增的溫度為37?42°C。
[0017]本發(fā)明的有益效果是:
本發(fā)明的熒光恒溫?cái)U(kuò)增體系，不依賴于ATP、磷酸肌酸等高能能量分子，相對(duì)現(xiàn)有的恒溫?cái)U(kuò)增體系，其組成更為簡(jiǎn)單，成本更為低廉，使用更為方便。
[0018]本發(fā)明的恒溫?cái)U(kuò)增體系可以對(duì)DNA和RNA序列實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增，適用于復(fù)雜模板的擴(kuò)增，擴(kuò)增速度快且穩(wěn)定，可以在30 min以內(nèi)完成擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增的靈敏度和準(zhǔn)確性高，不易出現(xiàn)錯(cuò)配，擴(kuò)增效果好。
【附圖說(shuō)明】
[0019]圖1是實(shí)施例1的熒光恒溫?cái)U(kuò)增結(jié)果圖；
圖2是實(shí)施例2的熒光恒溫?cái)U(kuò)增結(jié)果圖；
圖3是實(shí)施例3的熒光恒溫?cái)U(kuò)增結(jié)果圖；
圖4是實(shí)施例4的熒光恒溫?cái)U(kuò)增結(jié)果圖；
圖5是實(shí)施例5的熒光恒溫?cái)U(kuò)增結(jié)果圖；
圖6是實(shí)施例6的熒光恒溫?cái)U(kuò)增結(jié)果圖；
圖7是實(shí)施例7的熒光恒溫?cái)U(kuò)增結(jié)果圖；
圖8是實(shí)施例8的熒光恒溫?cái)U(kuò)增結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0020]一種熒光恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑，溶劑為水，其組成如下:
Tris-緩沖液OmM—500mM
乙酸鎂3mM—50mM
二硫蘇糖醇OmM-1OmM
甜菜喊0M-5M
Tween200%-10%
DMSO0%-10%
海藻糖0%-10%
PEG1%—20%
BSAOmg/mL—1mg/mL
dNTPs180uM—100uM
熒光染料、聚合酶、單鏈結(jié)合蛋白、重組酶，各適量；
重組酶為不依賴于能量分子的重組酶。
[0021]優(yōu)選的，其組成如下:
Tris-緩沖液1mM-1OOmM
乙酸鎂5mM—20mM 二硫蘇糖醇OmM-1OmM
甜菜喊0M-2M
Tween200%-1%
DMSO0%-10%
海藻糖0%-10%
PEG1%—20%
BSAOmg/mL—lmg/mL
dNTPs200uM—500uM
熒光染料、聚合酶、單鏈結(jié)合蛋白、重組酶，各適量。
[0022]Tris-緩沖液的作用在于維持一定的pH，以便酶在最適pH或較優(yōu)的pH下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。其濃度可以根據(jù)需要進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。作為上述反應(yīng)試劑的進(jìn)一步改進(jìn)，所使用的 Tris-緩沖液的 pH 為 7 ?9，包括 Tris-乙酸，Tris-H2SO4, Tris-HCl。
[0023]乙酸鎂在于提供一定的離子強(qiáng)度，其用量可以根據(jù)核酸擴(kuò)增情況進(jìn)行一定的調(diào)整。
[0024]作為上述反應(yīng)試劑的進(jìn)一步改進(jìn)，恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑中還添加有熒光染料。熒光染料為 SYBR green I，SYT0-9，SYT0-12, SYT0-60，SYTO-62, SYTO-16, SYT0-82 或 P0P0-3，T0T0-3，T0-PR0-3 中的一種。
[0025]聚合酶、單鏈結(jié)合蛋白、重組酶的用量可以根據(jù)需要調(diào)整其添加量，或通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定其用量。聚合酶為恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)中常用的聚合酶，優(yōu)選為Bsu或klenow。
[0026]作為上述反應(yīng)試劑的進(jìn)一步改進(jìn)，重組酶選自E.coli RecT蛋白；λ ■菌體β蛋白；啤酒酵母S印I /STP β ；啤酒酵母DPA蛋白；啤酒酵母STP α蛋白；粟酒裂殖酵母ρ14°/Exo 蛋白以及 Rrp 1、HPP- 1、v-SEP、ICP8 蛋白。
[0027]作為上述反應(yīng)試劑的進(jìn)一步改進(jìn)，恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑中添加有逆轉(zhuǎn)錄酶，用于檢測(cè) RNA0
[0028]一種核酸熒光恒溫?cái)U(kuò)增方法，包括將引物、模板與熒光恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑混合，恒溫?cái)U(kuò)增至預(yù)期量后，將恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系的酶滅活，完成恒溫?cái)U(kuò)增
作為上述方法的進(jìn)一步改進(jìn)，恒溫?cái)U(kuò)增的溫度為37?42°C。
[0029]下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0030]實(shí)施例1:
依賴重組酶恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑的具體成分如下:
Tris-H2SO4 (pH7.4)1mM
硫酸銨10mM
乙酸鎂14mM
二硫蘇糖醇5mM
甜菜堿0.8M
DMSO5%
海藻糖3%
PEG5%
BSA0.lmg/mL dNTPs200uM
聚合酶Bsu5U
單鏈結(jié)合蛋白250ng/ul 重組酶(λ噬菌體β蛋白)120ng/ul。
[0031]實(shí)施例2:
依賴重組酶恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑的具體成分如下:
Tris-乙酸(ρΗ8.0)50mM
乙酸鎂14mM
甜菜堿0.5M
Tween200.34%
DMSO5%
二硫蘇糖醇4mM
PEG8%
BSA0.lmg/mL
dNTPs200uM
聚合酶 klenow50ng/ul
單鏈結(jié)合蛋白350ng/ul
重組酶(STPa)100ng/ul。
[0032]實(shí)施例3:
依賴重組酶恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑的具體成分如下:
Tris-HCl (pH8.3)50mM
KCl60mM
乙酸鎂1mM
二硫蘇糖醇2mM
甜菜堿IM
海藻糖5.5%
PEG5.5%
BSA0.lmg/mL
dNTPs200uM
聚合酶Bsu50U
單鏈結(jié)合蛋白262