一種基于家蠶-桿狀病毒系統(tǒng)制備人髓過(guò)氧化物酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程和生物技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，特指一種基于家蠶-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)、應(yīng)用家蠶作為生物反應(yīng)器來(lái)廉價(jià)、高效地制備具催化活性的人髓過(guò)氧化物酶(Myeloperoxidase, ΜΡ0)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]人MPO是一種存在于正常人多形核中性白細(xì)胞(Polymorphonuclearneutrophils, PMN)嗜苯胺藍(lán)顆粒(Azurophilic granules)中被糖基化的血紅素包含形可溶酶，它通過(guò)催化形成強(qiáng)氧化物和次氯酸在自身免疫有氧殺滅微生物系統(tǒng)中扮演著重要角色。
[0003]針對(duì)自身免疫系統(tǒng)性血管炎和炎癥性等疾病，利用抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體(P-ANCA)進(jìn)行診斷已成為既定工具。臨床上常見(jiàn)的自身抗原是人MPO及蛋白酶3 (PR3)，通過(guò)抗原特異性診斷設(shè)備檢測(cè)與這些抗原相對(duì)應(yīng)的來(lái)自于中性粒細(xì)胞嗜天青顆粒的自身抗體，能夠很容易的診斷出與抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體相關(guān)的疾病。作為P-ANCA免疫熒光圖譜的主要標(biāo)靶，人MPO自身抗體指出了某些疾病的程度，如:特發(fā)性新月體性腎小球腎炎，Churg-Strauss綜合征以及經(jīng)典型結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎等相關(guān)疾病。
[0004]人MPO的基因編碼全長(zhǎng)為11千堿基(kilobase, kb)，最初的翻譯產(chǎn)物是一個(gè)80千道爾頓(kilodalton，kDa)的蛋白，該蛋白N-端由41個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽段被酶解切除后，繼而糖基化加入富含甘露糖的側(cè)鏈后重新生成一個(gè)約90 kDa酶性不活躍的apoproMPO，當(dāng)結(jié)合一個(gè)血紅素基團(tuán)后，apoproMPO變成了酶性活躍的前體蛋白ΜΡ0。N-端125個(gè)氨基酸前區(qū)通過(guò)酶解產(chǎn)生了一個(gè)約75 kDa的蛋白，經(jīng)過(guò)第二次酶解生成由約57 kDa重鏈和約12 kDa輕鏈組成的重輕原體人ΜΡ0，最終包裝成的一個(gè)成熟的人ΜΡ0，其分子量大約為150 kDa，由一對(duì)重鏈和一對(duì)輕鏈組成，兩個(gè)重鏈沿著長(zhǎng)軸由一個(gè)二硫鍵相連，富含甘露糖的糖基和兩個(gè)鐵素基團(tuán)通過(guò)共價(jià)鍵與重鏈相連。
[0005]早期的研究表明，用人MPO的cDNA轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞，觀察到一個(gè)被糖基化了的85 kDa的precursor ΜΡ0，它從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)被緩慢釋放，但沒(méi)有進(jìn)行進(jìn)一步的蛋白水解過(guò)程(Cully, J., et al, 1989, Exp.Cell Res., 180: 440-450)。Moguilevsky 等也觀察到了一個(gè)從CHO細(xì)胞釋放的具有酶活性的84 kDa的precursor ΜΡ0,盡管這個(gè)84 kDa的MPO與從 HL-60 細(xì)胞釋放的 89 kDa 的 MPO 非常相似(Hur，S.-J., et al, 1989，J.B1l.Chem., 264: 8542-8548)，但也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)其具有蛋白水解過(guò)程(Moguilevsky，N., et al,1991，Eur.J.B1chem., 197: 605-614)。應(yīng)用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在Sf_9昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)重組人MPO的實(shí)驗(yàn)表明，有兩種形式的MPO被觀察到，一種是84 kDa的釋放形MPO (釋放到培養(yǎng)基上清中)，另一種是在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的74 kDa的ΜΡ0，這兩種形式的MPO均顯示被糖基化修飾，而只有胞內(nèi)表達(dá)的74 kDa的MPO進(jìn)行了翻譯后的蛋白水解過(guò)程(Taylor，K.L.et al, 1992, B1chem.B1phys.Res.Commun., 187: 1572-1578)，但這兩種形式的MPO均不具過(guò)氧化酶的活性。也有研究表明，在感染了含人MPO重組病毒的r.細(xì)胞培養(yǎng)基中添加血紅素前體，其表達(dá)的釋放形MPO具有相應(yīng)的酶催化活性(Shin，K.et al,2000, B1chem.B1phys.Res.Commun., 271: 831-836)。
[0006]臨床上用于自身免疫系統(tǒng)相關(guān)疾病體外診斷的MPO以人天然蛋白為最佳，但天然蛋白的資源有限，來(lái)源各異，導(dǎo)致純化的天然抗原純度低、批次之間不一致，且成本昂貴，以德國(guó)Diarect公司產(chǎn)品為例，每毫克天然(非重組)人MPO高達(dá)一萬(wàn)元人民幣以上(http://www.eb1trade.com/custom/b1sun/ 100224/DIARECT.htm)。由于表達(dá)和蛋白折疊技術(shù)的瓶頸限制，利用體外表達(dá)系統(tǒng)所獲得的重組人MPO成本高昂，如以色列ProSpec-Tany公司從大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中制備的重組人MPO每毫克更高達(dá)八萬(wàn)元人民幣以上(http://www.amyjet.com/products/ENZ-334.shtml)。嚴(yán)重制約了自身免疫系統(tǒng)相關(guān)疾病體外診斷技術(shù)的發(fā)展。
[0007]家蠶-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)憑借其高表達(dá)水平及強(qiáng)大的翻譯后修飾功能而被普遍應(yīng)用于大規(guī)模表達(dá)外源蛋白，通過(guò)家蠶-桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)的人重組蛋白具有很高的生物活性，其抗原性、免疫原性與人的天然蛋白相似，且家蠶飼養(yǎng)簡(jiǎn)單方便，成本低，目前已經(jīng)成為世界上最具商業(yè)開(kāi)發(fā)價(jià)值的真核表達(dá)系統(tǒng)之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]針對(duì)制約在體外表達(dá)系統(tǒng)中制備重組人MPO的技術(shù)瓶頸，本發(fā)明首次提出一種高效、廉價(jià)、大規(guī)模制備重組人MPO的方法。本發(fā)明提出一種基于家蠶-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，利用家蠶作為生物反應(yīng)器，大規(guī)模、低成本、高效率地制備重組人MPO的方法。
[0009]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:將完整的人MPO的cDNA (在C-端設(shè)計(jì)帶有6個(gè)組氨酸)克隆到自身含6個(gè)組氨酸的供體質(zhì)粒(pFastBacHTb)上，獲得含人MPO基因的重組供體質(zhì)粒；在大腸桿菌(菌株為BmDHlOBac)中和家蠶桿狀病毒基因組桿粒(Bacmid)于轉(zhuǎn)座子(Tn7)上發(fā)生轉(zhuǎn)座，通過(guò)藍(lán)白斑篩選出帶有目的基因的克隆，隨后在家蠶細(xì)胞中(細(xì)胞株為BmN)制備含人MPO基因的重組病毒；感染宿主昆蟲(chóng)家蠶，同時(shí)給家蠶添加一定量的血紅素前體；收集含表達(dá)了人MPO的家蠶幼蟲(chóng)的體液，在裂解緩沖液存在下經(jīng)超聲波裂解，4°C下進(jìn)行高速離心，收集的上清應(yīng)用鎳-柱親和層析結(jié)合離子交換層析的方法進(jìn)行分離純化，最終獲得目的產(chǎn)物。
[0010]本技術(shù)方案所述的人MPO的cDNA來(lái)源于已公開(kāi)的DNA序列(GenBank:BC130476.1);所述的桿狀病毒是家蠶桿狀病毒(BmNPV);所述的宿主昆蟲(chóng)為家蠶(Bombyxmori)，品種為“306”;所述的宿主昆蟲(chóng)感染時(shí)間是五齡期幼蟲(chóng)；所述的感染方法是經(jīng)昆蟲(chóng)皮下注射接種感染；所述的血紅素前體的添加是經(jīng)口喂食；所述的桿狀病毒供體質(zhì)粒是是商品化的質(zhì)粒(型號(hào)為pFastBacHTb)。
[0011]本技術(shù)方案所述的分離純化具體操作是:收集的經(jīng)超聲波裂解、高速離心后含表達(dá)了人MPO的上清，經(jīng)過(guò)鎳-親和層析柱和離子交換層析柱分離純化出高純度的目的產(chǎn)物。所述的鎳-親和層析柱為帶組氨酸標(biāo)簽蛋白純化試劑盒，離子交換層析柱是指FPLC MonoS。
[0012]本發(fā)明的突出優(yōu)點(diǎn)表現(xiàn)為:
表達(dá)量高:通過(guò)制備含人MPO家蠶重組桿狀病毒感染五齡起蠶第二天的家蠶幼蟲(chóng)，在感染4-5天后收集高表達(dá)了人MPO的蠶血淋巴，經(jīng)分離純化后，每條蠶可制備高達(dá)1.7微克左右目的蛋白。
[0013]成本低:家蠶是目前唯一可以大規(guī)模商業(yè)化無(wú)菌飼養(yǎng)的昆蟲(chóng)物種，由于避免了苜蓿銀紋夜蛾多核型多角體病毒(AcMNPV)-昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)所需昂貴的培養(yǎng)基和胎牛血清，使得用家蠶作為生物反應(yīng)器制備人MPO的成本低。
[0014]
【附圖說(shuō)明】
[0015]圖1為重組供體質(zhì)粒的構(gòu)建；
其中 A:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain React1n, PCR)產(chǎn)物(?2277 bp)。B:供體質(zhì)粒 pFastBacHTb (Lane 1-2)和 PCR 產(chǎn)物(Lane 3-4) ^Xho I 和III 雙酶切。C:連接反應(yīng)前酶切產(chǎn)物膠回收效率的鑒定，Lane 1:供體質(zhì)粒pFastBacHTb，Lane 2: PCR產(chǎn)物。D:挑選的克隆雙酶切鑒定，Lane 1:空供體質(zhì)粒作為對(duì)照，Lane 2_4:連接產(chǎn)物涂平板過(guò)夜后所挑選克隆經(jīng)雙酶切反應(yīng)后的瓊脂糖膠。圖中酶切后的供體質(zhì)粒和MPO片段分別用箭頭表示，Lane M表示標(biāo)準(zhǔn)DNA標(biāo)記(marker)，左邊的數(shù)字表示標(biāo)準(zhǔn)DNA標(biāo)記的位置，以堿基對(duì)bp (base pair)表示。
[0016]圖2為發(fā)生同源重組家蠶Bacmid DNA的PCR鑒定；
其中以MPO中間引物C1669TGAATCGTCAGAACCAAATTG169。作為正引物和特異性反向引物(pUC/Ml3: 5’ -AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’)對(duì)挑選的白斑 Bacmid DNA 進(jìn)行的 PCR 鑒定，圖中M表示DNA marker，以左邊的數(shù)字表示(bp)，“I”表示以未發(fā)生轉(zhuǎn)座的藍(lán)斑Bacmid DNA作為對(duì)照，“2”和“3”表示發(fā)生