使用尿的無細(xì)胞dna評價腎狀態(tài)的方法和組合物的制作方法
【專利說明】使用尿的無細(xì)胞DNA評價腎狀態(tài)的方法和組合物
[0001] 相關(guān)申請的交叉參考
[0002] 本申請要求2013年3月15日提交的美國臨時專利申請順序號US61/793, 427的 優(yōu)先權(quán)利益，將該文獻的全部內(nèi)容引入本文作為參考。
[0003] 背景
[0004] 統(tǒng)稱為腎系統(tǒng)的腎執(zhí)行從血液中除去廢物和調(diào)節(jié)水基液體水平的主要功能。它們 是泌尿系統(tǒng)中必需的，而且可起自身穩(wěn)定功能的作用，例如調(diào)節(jié)電解質(zhì)、維持酸-堿平衡和 調(diào)節(jié)血壓。它們充當(dāng)身體血液的天然過濾器并且除去廢物，使廢物轉(zhuǎn)移至膀胱。在產(chǎn)生尿 的過程中，腎排泄廢物，例如尿和銨，且它們還負(fù)責(zé)水、葡萄糖和氨基酸的再吸收。腎還產(chǎn)生 激素，包括骨化三醇、紅細(xì)胞生成素和酶腎素。
[0005] 腎狀態(tài)受腎病或損傷（也稱作腎損傷、腎病）影響且可以因急性和慢性病癥而產(chǎn) 生。改變的腎狀態(tài)的另一種形式是移植的腎排斥。
[0006] 傳統(tǒng)上，通過使用針對肌酸酐的血液試驗評價腎狀態(tài)。較高水平的肌酸酐表示較 低的腎小球濾過率，且作為結(jié)果，腎排泄廢物的能力下降。為了完整地研究腎損害的主要原 因，各種形式的醫(yī)學(xué)成像、血液試驗和腎活組織檢查（取出腎組織小樣）通常用于發(fā)現(xiàn)是否 存在可逆的腎功能障礙的原因。
[0007] 對于改善的腎損傷和腎移植損傷的非侵害性診斷和用于評價腎狀態(tài)一般存 在關(guān)鍵的未得到滿足的需求。在腎移植損傷中，例如，已經(jīng)證實供體來源的無細(xì)胞 DNA(dd-cfDNA)是血液中移植物損傷的替代者，但需要以供體和受體DNA測序為代價。
[0008] 更近來，在人尿中發(fā)現(xiàn)了來自瀕臨死亡的細(xì)胞的無細(xì)胞DNA(CfDNA)。近期的嘗試 集中于測試尿的CfDNA作為同種異體移植物排斥的標(biāo)記，然而，該技術(shù)限于檢測已經(jīng)接受 了男性腎的女性接受者的Y染色體-特異性序列或預(yù)先測定供體與受體之間的遺傳組成/ 分子標(biāo)記的差異并且探測那些差異。照此，這些測試類型限于某些類型的構(gòu)造（例如，接受 男性供體腎的女性移植物接受者）且不能廣泛地適用于所有移植物構(gòu)造。
[0009] 因此，需要用于廣泛地適用于所有腎移植情況的非侵害性測試的改進的組合物和 方法來使用尿CfDNA評價腎狀態(tài)、腎損傷或腎移植物排斥。需要快速地用于測定所有腎損 傷和腎移植患者中的尿的無細(xì)胞DNA的方法，與性別無關(guān)且無需負(fù)擔(dān)DNA測序。
[0010] 本文提供了用于這樣的操作的組合物和方法，例如高流通量方法。
[0011] 將本說明書中引述的所有出版物和專利申請引入本文作為參考，如同將出版物或 專利申請各自特別地和分別地顯示以并入作為參考一樣。
[0012] 發(fā)明概述
[0013] 尿的無細(xì)胞DNA(CfDNA)可以是用于評估和評價腎狀態(tài)、腎健康、腎損傷、腎移植 損傷和高度急性腎排斥的強有力工具。可以通過數(shù)字或標(biāo)準(zhǔn)qPCR對尿CfDNA負(fù)荷進行依 次分析，無需供體和受體DNA測序。
[0014] 本發(fā)明涉及使用在尿中發(fā)現(xiàn)的CfDNA評價個體的腎狀態(tài)和腎健康。具體地，本發(fā) 明涉及用于監(jiān)測、診斷、預(yù)后和評價患有或疑似具有改變的腎狀態(tài)的受試者的治療方案的 方法和組合物。
[0015] 本發(fā)明尤其提供了用于評價腎狀態(tài)、腎損傷或腎移植物排斥的組合物和方法，其 基于測定尿中的常染色體的cfDNA。
[0016] 在一個方面，本發(fā)明提供了用于評價個體的腎狀態(tài)的方法，包括：測定尿樣中的常 染色體的拷貝數(shù)和比較所述染色體的拷貝數(shù)與來自正常群體的尿樣中所述染色體的標(biāo)準(zhǔn) 拷貝數(shù)，其中拷貝數(shù)的改變預(yù)示改變的腎狀態(tài)。在一個實施方案中，常染色體是染色體1。 在一個實施方案中，使用EIF2C1基因座測定染色體1的拷貝數(shù)。在一個實施方案中，使用 包含正向引物5' -GITCGGCTITCACCAGTCT和反向引物5' -CTCCATAGCTCTCCCACTC的引物組測 定EIF2C1基因座。在一個實施方案中，所述引物組用于實時PCR且進一步包括探針。在一 個實施方案中，所述探針包含如下序列和報道基因：5' -HEX-CGCCCTGCCATGTGGAAGAT-BHQ1。
[0017] 在本文的任意實施方案中，經(jīng)測定高于標(biāo)準(zhǔn)拷貝數(shù)的拷貝數(shù)預(yù)示受損的腎狀態(tài)。 在本文的任意實施方案中，經(jīng)測定等于或低于標(biāo)準(zhǔn)拷貝數(shù)的拷貝數(shù)預(yù)示良好的腎健康。在 本文的任意實施方案中，使用實時PCR、定量PCR或數(shù)字PCR(dPCR)測定拷貝數(shù)。在本文的 任意實施方案中，使用BioMark實時PCR系統(tǒng)測定拷貝數(shù)。在本文的任意實施方案中，受 損的腎狀態(tài)可以包含腎損害、腎損傷、腎臟病、腎病癥、腎移植物排斥或者對于腎損害、腎損 傷、腎病、腎病癥或腎移植物排斥的治療無響應(yīng)。在本文的任意實施方案中，腎狀態(tài)的評價 可以包括測定腎臟病，腎損傷、腎移植損傷或腎移植物排斥進程。在本文的任意實施方案 中，腎狀態(tài)的評價可以包括測定患有且目前正在進行或已經(jīng)進行過治療的腎臟病、腎損傷、 腎移植損傷或腎移植物排斥的個體中的治療響應(yīng)。
[0018] 在本文的任意實施方案中，CfDNA可以提取自尿。在本文的任意實施方案中，測定 提取自尿的cfDNA中的拷貝數(shù)。在本文的任意一個實施方案中，所述方法還可以包括測定 其它病理學(xué)和臨床數(shù)據(jù)。在本文的任意一個實施方案中，所述方法還可以包括測定肌酸酐 的量。在本文的任意一個實施方案中，所述方法還可以包括測定蛋白尿或cGFR。在本文的 任意一個實施方案中，所述方法還可以包括進行腎的活組織檢查。
[0019] 在本文的任意一個實施方案中，所述個體是處于腎損害、腎損傷、腎臟病、腎病癥、 腎移植物損傷或腎移植物排斥的風(fēng)險中的個體。在本文的任意一個實施方案中，所述個體 是糖尿病患者。在本文的任意一個實施方案中，所述個體患有高血壓。在本文實施方案的 任意一個中，所述個體是同種異體移植物腎移植的接受者。在本文的任意一個實施方案中， 所述個體處于腎移植物損傷或腎移植物排斥的治療中。在本文的任意一個實施方案中，所 述個體患有至少一種急性排斥反應(yīng)發(fā)作。
[0020] 在另一個方面，本發(fā)明提供用于評價個體的腎狀態(tài)的方法，包括：測定尿樣中ALU 重復(fù)單元的數(shù)量和比較ALU重復(fù)單元的數(shù)量與來自正常群體的尿樣中ALU重復(fù)單元的標(biāo)準(zhǔn) 數(shù)量，其中ALU重復(fù)單元的數(shù)量改變預(yù)示改變的腎狀態(tài)。在一個實施方案中，經(jīng)測定高于 重復(fù)單元的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)量的ALU重復(fù)單元的數(shù)量預(yù)示受損的腎狀態(tài)。在一個實施方案中，經(jīng)測 定等于或低于ALU重復(fù)單元的標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)量的ALU重復(fù)單元的數(shù)量預(yù)示良好的腎健康。在 另一個實施方案中，測定提取自尿的cfDNA中ALU重復(fù)單元的數(shù)量。在另一個實施方案 中，使用實時PCR、定量PCR或數(shù)字PCR測定ALU重復(fù)單元的數(shù)量。在另一個實施方案中， 使用BioMark實時PCR系統(tǒng)測定ALU重復(fù)單元的數(shù)量。在另一個實施方案中，使用實時 PCR測定ALU重復(fù)單元的數(shù)量。在另一個實施方案中，使用ALU基因座的115個堿基擴增 子測定ALU重復(fù)單元的數(shù)量。在本文的任意實施方案中，所述方法還可以包含測定同一樣 品中常染色體的拷貝數(shù)。在另一個實施方案中，測定染色體1的拷貝數(shù)。在一個實施方案 中，使用EIF2C1基因座測定染色體1的拷貝數(shù)。在另一個實施方案中，使用包含正向引物 5' -GITCGGCmCACCAGTCT和反向引物5' -CTCCATAGCTCTCCCACTC 的引物組測定EIF2C1 基因 座。在另一個實施方案中，所述引物組用于實時PCR且進一步包括探針。在另一個實施方 案中，所述探針包含如下序列和報道基因：5' -HEX-CGCCCTGCCATGTGGAAGAT-BHQ1。
[0021] 在本文的任意實施方案中，受損的腎狀態(tài)可以包含腎損害、腎損傷、腎臟病、腎病 癥、腎移植物排斥或者對腎損害、腎損傷、腎病、腎病癥或腎移植物排斥的治療無響應(yīng)。在本 文的任意實施方案中，腎狀態(tài)的評價可以包含測定腎臟病、腎損傷、腎移植損傷或腎移植物 排斥的進程。在本文的任意實施方案中，腎狀態(tài)的評價可以包含測定患有腎臟病、腎損傷、 腎移植損傷或腎移植物排斥且目前正在進行或已經(jīng)進行過治療的個體中的治療響應(yīng)。
[0022] 在本文的任意實施方案中，CfDNA可以提取自尿。在本文的任意一個實施方案中， 所述方法還可以包括測定其它病理學(xué)和臨床數(shù)據(jù)。在本文的任意一個實施方案中，所述方 法還可以包括測定肌酸酐的量。在本文的任意一個實施方案中，所述方法還可以包括測定 蛋白尿或cGFR。在本文的任意一個實施方案中，所述方法還可以包括進行腎的活組織檢查。
[0023] 在本文的任意一個實施方案中，所述個體是處于腎損害、腎損傷、腎臟病、腎病癥、 腎移植損傷或腎移植排斥的風(fēng)險中的個體。在本文的任意一個實施方案中，所述個體是糖 尿病患者。在本文的任意一個實施方案中，所述個體患有高血壓。在本文的任意一個實施 方案中，所述個體是同種異體移植物腎移植的接受者。在本文的任意一個實施方案中，所述 個體處于腎移植物損傷或腎移植物排斥的治療中。在本文的任意一個實施方案中，所述個 體患有至少一種急性排斥反應(yīng)發(fā)作。
[0024] 在另一個方面，本發(fā)明提供了診斷測定試劑盒，該試劑盒包含：用于測定來自樣 品的至少一種常染色體的拷貝數(shù)的試劑；用于測定所述拷貝數(shù)的引物組；和用于測定的 使用說明書。在一個實施方案中，常染色體是染色體1。在另一個實施方案中，所述引物 組能夠擴增基因座EIF2C1的擴增子。在另一個實施方案中，所述引物組包含正向引物 5' -GITCGGCTITCACCAGTCT 和反向引物 5' -CTCCATAGCTCTCCCACTC。在另一個實施方案中，弓丨 物添加包含用于d PCR的探針。在一個實施方案中，所述探針的序列包含如下序列和報道 基因：5' -HEX-CGCCCTGCCATGTGGAAGAT-BHQ1。
[0025] 在本文的任意實施方案中，所述試劑盒還包含用于從樣品中提取CfDNA的試劑。 在本文的任意實施方案中，所述樣品包含尿。在本文的任意實施方案中，所述引物組能夠用 于實時PCR、定量PCR或數(shù)字PCR。在本文的任意實施方案中，所述引物組還包含用于數(shù)字 PCR的探針。
[0026] 在另一個方面，本發(fā)明提供了診斷測定試劑盒，該試劑盒包含：用于測定樣品中 ALU重復(fù)單元的數(shù)量的試劑；用于測定所述ALU重復(fù)單元的數(shù)量的引物組；和用于測定的 使用說明書。在一個實施方案中，所述引物組是能夠擴增ALU基因座的擴增子的組。在 另一個實施方案中，所述引物組包含正向引物5' -GCCTGTAATCCCAGCTACTC-3'和反向引 物5' -ATCTCGGCTCACTGCAAC-3'。在另一個實施方案中，引物另外包含用于數(shù)字PCR的探 針。在一個實施方案中，所述探針的序列包含如下序列和報道基因：5'-HEXTCAAGCGATTC TCCTGCCTCAGC-BHQ-3'。在另一個實施方案中，所述試劑盒還能夠包含測定常染色體拷貝 數(shù)的引物組。在一個實施方案中，常染色體是染色體1。在另一個實施方案中，所述引物 組能夠擴增基因座EIF2C1的擴增子。在另一個實施方案中，所述引物組包含正向引物 5' -GITCGGCTITCACCAGTCT 和反向引物 5' -CTCCATAGCTCTCCCACTC。在另一個實施方案中，弓丨 物另外包含用于數(shù)字PCR的探針。在一個實施方案中，所述探針的序列包含如下序列和報 道基因：5' -HEX-CGCCCTGCCATGTGGAAGAT-BHQ1。
[0027] 在本文的任意實施方案中，所述試劑盒還包含用于從樣品中提取CfDNA的試劑。 在本文的任意實施方案中，所述樣品包含尿。在本文的任意實施方案中，所述引物組能夠用 于實時PCR、定量PCR或數(shù)字PCR。在本文的任意實施方案中，所述引物組還包含用于數(shù)字 PCR的探針。
[0028] 附圖簡述
[0029] 圖1呈現(xiàn)來自個體的血漿樣品中染色體1染色體Y拷貝數(shù)之間的相關(guān)性，所述個 體進行了腎移植，具有或沒有急性排斥（AR)發(fā)作。
[0030] 圖2呈現(xiàn)來自個體的血漿樣品中染色體1染色體Y拷貝數(shù)之間的相關(guān)性，所述個 體進行了腎移植，具有或沒有急性排斥（AR)發(fā)作。
[0031] 圖3呈現(xiàn)質(zhì)量控制測定。為了評價尿樣中染色體1拷貝數(shù)的穩(wěn)定性，以重復(fù)試驗 發(fā)問那個是測定來自3位患者的9份樣品中染色體1的拷貝數(shù)。在一式兩份試驗之間觀察 到緊密的相關(guān)性。
[0032] 圖4顯示與染色體1拷貝數(shù)相關(guān)的尿中的蛋白質(zhì)的量。
[0033] 圖5顯示尿樣中ALU重復(fù)單元與染色體1拷貝數(shù)之間的相關(guān)性。
[0034] 圖6顯示實施例4所用研究樣品和方法的示意圖。本研究評價腎移植患者尿和血 漿中無細(xì)胞DNA測量值的意義。分3期進行本研究。在第1期中，評價尿和血漿中dd-cfDNA 的意義。在第2期中，評價常染色體基因座（Chrl)的測量值。在第3期中，分析尿中總 CfDNA負(fù)荷的定量以用于特異性移植物損傷檢測。
[0035] 圖7顯示在具有男性移植物的19位女性接受者的小組中，當(dāng)與穩(wěn)定（STA)移植物 功能過程中測定的血漿dd-cfDNA值比較時，在急性排斥反應(yīng)（AR)時觀察到血漿dd-cfDNA 的量增加。
[0036] 圖8顯示正如根據(jù)Chr 1基因座EIF2C1拷貝數(shù)測定的，尿cfDNA負(fù)荷顯示甚至尿 中檢測到的常染色體DNA是供體來源的。Chr Y基因座SRY的尿cfDNA負(fù)荷與Chr 1基因 座EIF2C的尿cfDNA負(fù)荷強烈相關(guān)。
[0037] 圖9顯示作為腎移植損傷指示劑的尿中的無細(xì)胞Chrl拷貝數(shù)。（A)來自具有移植 物損傷的腎移植患者的尿中Chrl的基因座EIF2C1的拷貝數(shù)在與來自無移植物損傷的腎移 植患者的尿中的Chrl的基因座EIF2C1的拷貝數(shù)比較時具有顯著性。（B)數(shù)據(jù)的ROC分析 產(chǎn)生0. 777的AUC，其中p值〈0. 0001。（C)移植物損傷表型中的蛋白質(zhì)與肌酸酐之顯著地 高于來自無移植物損傷患者的尿的蛋白質(zhì)與肌酸酐之比。（D) ROC分析產(chǎn)生0. 66的AUC，其 中P值為0.004。
[0038] 圖10顯示用于移植物損傷適應(yīng)征的無細(xì)胞DNA。（A)顯示根據(jù)ALU測定數(shù)據(jù)計算 基因組當(dāng)量時來自有代表性的患者的數(shù)據(jù)，與低級AR或其它慢性損傷比較時嚴(yán)重AR的尿 中的cfDNA負(fù)荷增加。（B)在一種有代表性的情況中尿中的總cfDNA增加顯著地高于其它 慢性損傷相比高級AR和返流性腎病的尿中的總cfDNA增加。（C)呈現(xiàn)了尿cfDNA的增加特 別地高于AR前后樣品時的樣品數(shù)據(jù)。（D) cfDNA負(fù)荷增加高于BKVN中且在前-BKVN尿中可 以觀察到cfDNA負(fù)荷升高。
[0039] 圖11顯示在與AR前后相比時尿cfDNA負(fù)荷升高在AR發(fā)作中增加。評價3位患 者（患者#1、#2和#3)的AR前后尿中的總cfDNA，顯示在AR過程中和發(fā)作時尿中的cfDNA 負(fù)荷升高。
[0040] 詳細(xì)描述
[0041] 本文所述的本發(fā)明特別地提供了用于管控腎健康（腎臟健康）、腎病和腎移植的 組合物和方法。本發(fā)明提供了用于評價個體（例如患者）的腎健康、監(jiān)測腎健康和鑒定用 于治療干預(yù)的個體和個體亞群的診斷、預(yù)后和/或治療組合物和方法。一般地，本發(fā)明基于 測定尿中的cfDNA。如下所述，測定尿cfDNA中的常染色體的拷貝數(shù)和/或測定來自那些 已經(jīng)進行過腎/腎臟移植的尿的cfDNA中的ALU重復(fù)單元的數(shù)量，可以用于精確地鑒定處 于發(fā)生腎移植物損傷或腎移植物排斥癥狀風(fēng)險的個體；監(jiān)測腎移植損傷或腎移植排斥的進 程；監(jiān)測腎移植物損傷或腎移植物排斥的進程；監(jiān)測對治療腎移植物損傷或腎移植物排斥 的個體的治療響應(yīng)；鑒定和/或預(yù)測腎移植物損傷或腎移植物排斥發(fā)作的風(fēng)險；鑒定應(yīng)開 始或持續(xù)腎移植物損傷或腎移植物排斥治療的患者亞群；評價腎移植物損傷或腎移植物排 斥的治療效能；和/或鑒定應(yīng)監(jiān)測發(fā)生腎移植損傷或腎移植排斥癥狀的患者亞群。另外進 一步如下所述，測定尿cfDNA中的常染色體拷貝數(shù)和/或測定尿