一種促進(jìn)Ru(II)金屬絡(luò)合物細(xì)胞核攝取的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種促進(jìn)Ru(II)金屬絡(luò)合物細(xì)胞核攝取的 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] DNA是遺傳信息的載體，因此了解DNA在細(xì)胞核內(nèi)的組裝和結(jié)構(gòu)具有非常重要的 意義。目前，利用熒光顯微鏡，使用能夠與DNA結(jié)合的細(xì)胞膜通透性良好的有機(jī)熒光分子作 為DNA標(biāo)記探針是實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的主要手段。但是，現(xiàn)有的許多熒光染料存在水溶性低，毒 性強(qiáng)及光漂白等的缺點(diǎn)。因此，探索新的生物顯像試劑似乎顯得尤為重要，而過(guò)渡金屬絡(luò) 合物為此提供了廣闊的應(yīng)用前景。1990年，Barton和Sauvage研究組報(bào)道聯(lián)吡啶并吩嗪 (dppz)金屬配體絡(luò)合物與DNA有著很強(qiáng)的親和力（結(jié)合常數(shù)Kb~106M3。有趣的是，這 些絡(luò)合物與DNA結(jié)合后會(huì)發(fā)出強(qiáng)烈的MLCT熒光（MLCT指金屬到配體的電荷轉(zhuǎn)移），而未與 DNA結(jié)合的絡(luò)合物則沒(méi)有熒光現(xiàn)象。這一現(xiàn)象被認(rèn)為是DNA的"光開關(guān)效應(yīng)"，已經(jīng)被廣泛 用于研究多種金屬多吡啶絡(luò)合物與DNA之間的相互作用。由于這種"光開關(guān)"現(xiàn)象可通過(guò) 熒光顯微鏡觀察并檢測(cè)，因此這類金屬絡(luò)合物在細(xì)胞顯像的應(yīng)用中可能具有廣闊的應(yīng)用前 景，其中又以d6過(guò)渡金屬絡(luò)合物最為顯著，這是因?yàn)榇祟惤j(luò)合物具有一系列吸引人的光學(xué) 顯像特性，包括：良好的水溶性、較強(qiáng)的光穩(wěn)定性、可見光區(qū)低MLCT激發(fā)能（避免UV損傷作 用）、發(fā)光壽命長(zhǎng)、相對(duì)高的Stokes位移（一般大于100nm)。此外，這類絡(luò)合物除自身具有 上述豐富的特性外，其配體的三維空間結(jié)構(gòu)還能使絡(luò)合物成功地與DNA結(jié)合；配體結(jié)構(gòu)的 細(xì)微修飾能導(dǎo)致絡(luò)合物與DNA的鍵合模式、鍵合位置、鍵合強(qiáng)度和光物理特性發(fā)生微弱或 明顯的變化，因此可以通過(guò)改變配體來(lái)調(diào)控絡(luò)合物的細(xì)胞攝取狀況，以及調(diào)節(jié)分子疏水性、 親和力及選擇性。這為篩選尋找具有不同功能的DNA結(jié)構(gòu)探針提供了良好的方法。
[0003] 近年來(lái)，有關(guān)金屬絡(luò)合物探針的研究主要集中于化學(xué)體系，而用于活細(xì)胞內(nèi)DNA 直接顯像的成功的實(shí)例卻較為少見。大量研究結(jié)果表明限制金屬絡(luò)合物在活細(xì)胞中顯像應(yīng) 用的主要因素是由于它們較低的膜通透性，而DNA作為胞內(nèi)的主要作用靶點(diǎn)，金屬絡(luò)合物 若要與活細(xì)胞內(nèi)的DNA相互作用，則分子不僅要進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，而且還要進(jìn)入到細(xì)胞核（或線 粒體）內(nèi)。例如，典型的金屬舒嵌入劑[Ru(bpy)2(dppz)]2+和[Ru(phen) 2(dppz)]2+絡(luò)合物， 因具有較弱的脂溶性而不能透過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。盡管如此，上述兩種絡(luò)合物都可用于 固定細(xì)胞條件下的DNA染色或用于區(qū)別活細(xì)胞顯像中的死細(xì)胞。但是，如果這些金屬絡(luò)合 物能夠用于活細(xì)胞內(nèi)的DNA染色，這將具有更重要的生物學(xué)意義。
[0004] 為實(shí)現(xiàn)上述活細(xì)胞內(nèi)DNA染色的目的，應(yīng)增強(qiáng)金屬絡(luò)合物的細(xì)胞攝取水平?；?此，人們開始采取多種方法對(duì)金屬絡(luò)合物進(jìn)行改造，如：通過(guò)增強(qiáng)絡(luò)合物的疏水性-即引入 疏水配體如苯環(huán)或烷基鏈，使得其在本質(zhì)上與脂質(zhì)更類似，從而改變其通過(guò)細(xì)胞膜的能力。 然而，在改變絡(luò)合物疏水性能從而調(diào)控細(xì)胞攝取的同時(shí)，也可能會(huì)影響該絡(luò)合物的細(xì)胞定 位，且通常會(huì)使其與細(xì)胞核結(jié)合的靶向性降低。此外，采用共價(jià)結(jié)合熒光分子如熒光素或 羅丹明是研究生物活性分子在細(xì)胞內(nèi)分布的一種普遍方法，而這同樣也可用于金屬絡(luò)合物 研究。Puckett等的研究表明，標(biāo)記了熒光素的Ru(dppz)絡(luò)合物可直接進(jìn)入細(xì)胞核，而未 標(biāo)記的則不能進(jìn)入。盡管熒光素的熒光發(fā)射明確定位出該絡(luò)合物定位于細(xì)胞核，但卻不能 觀察到分子中釕組分自身產(chǎn)生的核內(nèi)MLCT熒光。這很可能意味著，這些熒光分子改變了 Ru(dppz)絡(luò)合物自身的發(fā)光特性。
[0005] 綜上所述，無(wú)論是通過(guò)增加絡(luò)合物疏水性的方法還是將金屬絡(luò)合物進(jìn)行熒光素標(biāo) 記，都不僅需要消耗大量的時(shí)間和精力來(lái)設(shè)計(jì)合成，而且所合成的絡(luò)合物的光物理性能也 可能發(fā)生改變，使它們不能進(jìn)入到細(xì)胞核或是改變母體絡(luò)合物產(chǎn)生熒光的特性。因此，一種 簡(jiǎn)單且行之有效的可促進(jìn)Ru(II)絡(luò)合物在活細(xì)胞內(nèi)攝取的方法就顯得尤為重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種促進(jìn)Ru(II)金屬絡(luò)合物細(xì)胞核攝取的方法。
[0007] 本發(fā)明提供的促進(jìn)Ru(II)金屬絡(luò)合物細(xì)胞核攝取的方法包括如下步驟：在含 有陽(yáng)離子Ru(II)金屬絡(luò)合物和生物化學(xué)試劑的培養(yǎng)體系中培養(yǎng)細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)所述陽(yáng)離子 Ru(II)金屬絡(luò)合物進(jìn)入活細(xì)胞的細(xì)胞核；
[0008] 所述生物化學(xué)試劑為鹵代酚類、羰基氰類或非留體類抗炎藥。
[0009] 上述方法中，所述陽(yáng)離子Ru(II)金屬絡(luò)合物與所述生物化學(xué)試劑的物質(zhì)的摩爾 比為（1-5) : 3 ;
[0010] 所述陽(yáng)離子Ru(II)金屬絡(luò)合物為式I所示的[Ru(bpy) 2dppz]2+、式II所示 的[Ru(phen)2dppz]2+、式 III所示的[Ru(DIP)2dppz]2+或式 IV所示的[Ru(bpy)2tpphz Ru(bpy) 2]4+；
[0011]
[0012]
[0013] 所述鹵代酚類為五氯酚、2, 3, 5, 6-四氯酚、2, 3, 4, 6-四氯酚、2, 3, 4, 5-四氯酚、 2, 4, 5_二氣酸、3, 4, 5_二氣酸、2, 3, 4_二氣酸、2, 3, 5_二氣酸、五漠酸、2, 4, 6_二漠酸、四氣 兒茶酸、2, 3, 6_二氣酸、2, 4, 6_二氣酸、2, 3_二氣酸、2, 4_二氣酸、2, 5_二氣酸、2, 6_二氣 酚、3, 4-二氯酚、3, 5-二氯酚、2- -氯酚、3- -氯酚或4- 一氯酚；
[0014] 所述羰基氰類為羰基-氰-對(duì)_三氟甲氧基苯肼或羰基氰化物間氯苯腙；
[0015]所述非留體類抗炎藥為托芬那酸（Tolfenamicacid)、氟芬那酸（Flufenamic acid)、甲芬那酸（Mefenamicacid)、尼氟滅酸（Niflumicacid)、甲氯芬那酸 (Meclofenamicacid)或雙氯芬酉愛（Diclofenicacid)；
[0016] 所述陽(yáng)離子Ru(II)金屬絡(luò)合物具體為式I所示的[Ru(bpy)2dppz]2+或式II所示 的[Ru(phen)2dppz]2+;
[0017] 所述鹵代酚類具體為五氯酚；
[0018] 所述羰基氰類具體為羰基-氰-對(duì)-三氟甲氧基苯肼；
[0019] 所述非留體類抗炎藥具體為托芬那酸。
[0020] 上述方法中，所述細(xì)胞為真核細(xì)胞或原核細(xì)胞；所述真核細(xì)胞為QSG-7701細(xì) 胞、HeLa細(xì)胞、IfepG-2細(xì)胞、HL-7702細(xì)胞、MCF-7細(xì)胞或PC-12細(xì)胞；所述原核細(xì)胞為 Staphylococcusaureus；
[0021] 所述細(xì)胞具體為QSG-7701細(xì)胞。
[0022] 上述方法中，所述培養(yǎng)體系為含有體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清（FBS)和體積分?jǐn)?shù)為 1 %的雙抗青-鏈霉素的RMP1640培養(yǎng)基；或所述培養(yǎng)體系為含有體積分?jǐn)?shù)為1 %的雙抗 青-鏈霉素的RMP1640培養(yǎng)基。
[0023] 上述方法中，所述培養(yǎng)細(xì)胞的時(shí)間為l_3h;所述培養(yǎng)細(xì)胞的溫度為37°C。
[0024] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述方法的新用途。
[0025] 本發(fā)明提供了上述方法在促進(jìn)陽(yáng)離子Ru(II)金屬絡(luò)合物進(jìn)入活細(xì)胞的細(xì)胞核中 的應(yīng)用。
[0026] 本發(fā)明還提供了上述方法在促進(jìn)陽(yáng)離子Ru(II)金屬絡(luò)合物進(jìn)入活細(xì)胞中的應(yīng) 用。
[0027] 本發(fā)明還提供了上述方法在增加陽(yáng)離子Ru(II)金屬絡(luò)合物在細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度 中的應(yīng)用。
[0028] 本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種活細(xì)胞內(nèi)DNA結(jié)構(gòu)熒光探針的產(chǎn)品。
[0029] 本發(fā)明提供的活細(xì)胞內(nèi)DNA結(jié)構(gòu)熒光探針的產(chǎn)品由陽(yáng)離子Ru(II)金屬絡(luò)合物和 生物化學(xué)試劑組成；所述生物化學(xué)試劑為鹵代酚類、羰基氰類或非留體類抗炎藥。
[0030] 上述產(chǎn)品中，所述陽(yáng)離子Ru(II)金屬絡(luò)合物與所述生物化學(xué)試劑的物質(zhì)的摩爾 比為（1-5) : 3 ;
[0031 ] 所述陽(yáng)離子Ru(II)金屬絡(luò)合物為式I所示的[Ru(bpy) 2dppz]2+、式II所示 的[Ru(phen)2dppz]2+、式 III所示的[Ru(DIP)2dppz]2+或式 IV所示的[Ru(bpy)2tpphz Ru(bpy) 2]4+；
[0032] 所述鹵代酚類為五氯酚、2, 3, 5, 6-四氯酚、2, 3, 4, 6-四氯酚、2, 3, 4, 5-四氯酚、 2, 4, 5_二氣酸、3, 4, 5_二氣酸、2, 3, 4_二氣酸、2, 3, 5_二氣酸、五漠酸、2, 4, 6_二漠酸、四氣 兒茶酸、2, 3, 6_二氣酸、2, 4, 6_二氣酸、2, 3_二氣酸、2, 4_二氣酸、2, 5_二氣酸、2, 6_二氣 酚、3, 4-二氯酚、3, 5-二氯酚、2- -氯酚、3- -氯酚或4- 一氯酚；
[0033] 所述羰基氰類為羰基-氰-對(duì)-三氟甲氧基苯肼或羰基氰化物間氯苯腙；
[0034] 所述非留體類抗炎藥為托芬那酸、氟芬那酸、甲芬那酸、尼氟滅酸、甲氯芬那酸或 雙氯芬酸；
[0035] 所述陽(yáng)離子Ru(II)金屬絡(luò)合物具體為式I所示的[Ru(bpy)2dppz]2+或式II所示 的[Ru(phen)2dppz]2+;
[0036] 所述鹵代酚類具體為五氯酚；
[0037] 所述羰基氰類具體為羰基-氰-對(duì)-三氟甲氧基苯肼；
[0038] 所述非留體類抗炎藥具體為托芬那酸。
[0039] 上述產(chǎn)品中，所述細(xì)胞為真核細(xì)胞或原核細(xì)胞；所述真核細(xì)胞為QSG-7701細(xì) 胞、HeLa細(xì)胞、IfepG-2細(xì)胞、HL-7702細(xì)胞、MCF-7細(xì)胞或PC-12細(xì)胞；所述原核細(xì)胞為 Staphylococcusaureus；
[0040] 所述細(xì)胞具體為QSG-7701細(xì)胞。
[0041] 本發(fā)明的最后一個(gè)目的是提供生物化學(xué)試劑的新用途。
[0042] 本發(fā)明提供了生物化學(xué)試劑在制備促進(jìn)陽(yáng)離子Ru(II)金屬絡(luò)合物進(jìn)入活細(xì)胞的 細(xì)胞核的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0043] 本發(fā)明還提供了生物化學(xué)試劑在制備促進(jìn)陽(yáng)離子Ru(II)金屬絡(luò)合物的活細(xì)胞的 細(xì)胞核攝取的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0044] 本發(fā)明還提供了生物化學(xué)試劑在制備促進(jìn)陽(yáng)離子Ru(II)金屬絡(luò)合物進(jìn)入活細(xì)胞 的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0045] 本發(fā)明還提供了生物化學(xué)試劑在制備促進(jìn)陽(yáng)離子Ru(II)金屬絡(luò)合物的活細(xì)胞攝 取的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0046] 本發(fā)明還提供了生物化學(xué)試劑在增加陽(yáng)離子Ru(II)金屬絡(luò)合物在細(xì)胞內(nèi)的熒光 強(qiáng)度中的應(yīng)用。
[0047] 上述應(yīng)用中，所述生物化學(xué)試劑為鹵代酚類、羰基氰類或非留體類抗炎藥；
[0048] 所述陽(yáng)離子Ru(II)金屬絡(luò)合物為式I所示的[Ru(bpy) 2dppz]2+、式II所示 的[Ru(phen)2dppz]2+、式 III所示的[Ru(DIP)2dppz]2+或式 IV所示的[Ru(bpy)2tpphz Ru(bpy) 2]4+；
[0049] 所述鹵代酚類為五氯酚、2, 3, 5, 6-四氯酚、2, 3, 4, 6-四氯酚、2, 3, 4, 5-四氯酚、 2, 4, 5_二氣酸、3, 4, 5_二氣酸、2, 3, 4_二氣酸、2, 3, 5_二氣酸、五漠酸、2, 4, 6_二漠酸、四氣 兒茶酸、2, 3, 6_二氣酸、2, 4, 6_二氣酸、2, 3_二氣酸、2, 4_二氣酸、2, 5_二氣酸、2, 6_二氣 酚、3, 4-二氯酚、3, 5-二氯酚、2- -氯酚、3-