原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET-IFNγ、干擾素及用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種干擾素，尤其是由重組質(zhì)粒pET-IFNy制得的干擾素，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展、高密度養(yǎng)殖技術(shù)的普及和養(yǎng)殖產(chǎn)量的迅速增加，水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物疾病的發(fā)生越來越頻繁、越來越嚴(yán)重，由此造成的損失逐年增加。每年有1/10的養(yǎng)殖面積受到病害的影響，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。尤其是魚類的病毒性疾病，至今都是無法有效控制的世界性難題。病毒性疾病的病原體微小，在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，潛伏期長(zhǎng)短不一、癥狀復(fù)雜多變、傳染性強(qiáng)、死亡率高。迄今已發(fā)現(xiàn)的魚類病毒有70多種，流行比較嚴(yán)重的如草魚出血病、鯉春病毒血癥、傳染性造血組織壞死病等。
[0003]草魚作為我國最主要的經(jīng)濟(jì)魚類，其產(chǎn)量約占我國淡水魚類養(yǎng)殖產(chǎn)量的20%。在其養(yǎng)殖的過程中受到各種病害的威脅，其中以由草魚呼腸孤病毒（Grass carp reovirus,GCRV)引起的草魚出血病最為嚴(yán)重，死亡率高達(dá)90%，造成了我國淡水漁業(yè)巨大損失。目前，對(duì)于魚類傳染性疾病的防治仍然沒有很有效的方案。一方面，魚類病毒病尚無有效的防治藥物，使用的化學(xué)藥劑和抗生素往往會(huì)導(dǎo)致藥物殘留和耐藥性的產(chǎn)生，甚至污染水環(huán)境。預(yù)防水產(chǎn)動(dòng)物疾病發(fā)生流行的有效途徑是免疫接種。然而，在病毒疫苗使用過程中，存在很多無法克服的障礙。魚用疫苗可分為三種類型：第一種為減毒及滅活疫苗；第二種為重組亞單位疫苗和合成多肽疫苗；第三種是核酸疫苗。第一、二種疫苗雖然在生產(chǎn)實(shí)踐中得到了較大程度的應(yīng)用，然而在生產(chǎn)成本、效價(jià)穩(wěn)定性、保護(hù)力等方面還存在一定的問題。疫苗免疫不適于大面積水面養(yǎng)殖；弱毒疫苗還有毒力返強(qiáng)的潛在危險(xiǎn)。近年來，核酸疫苗雖開辟了疫苗學(xué)的一個(gè)新領(lǐng)域，但是由于免疫效果不穩(wěn)定，以及免疫機(jī)制、安全性問題在理論上還沒有解決，因此大大限制了核酸疫苗的推廣應(yīng)用。因此，目前預(yù)防和治療措施仍然不能經(jīng)濟(jì)而有效地控制我國疫病的發(fā)展，迫切需要找到一種有效的防治措施或治療方法。
[0004]干擾素（interferon，IFN)是最先發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子，早在1957年，Issacs等發(fā)現(xiàn)，流感病毒處理的細(xì)胞產(chǎn)生一種因子，可抵抗病毒的感染，干擾病毒的復(fù)制，因而命名為干擾素。是一類具有廣泛生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)，如抗病毒、抗腫瘤、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)等，是機(jī)體防御系統(tǒng)的重要組成部分。干擾素系統(tǒng)是目前所知的機(jī)體防御反應(yīng)中出現(xiàn)最早的細(xì)胞功能調(diào)節(jié)系統(tǒng)，在病毒感染幾小時(shí)之內(nèi)就起作用，并幾乎作用于病毒復(fù)制的每一階段。IFN具有廣泛的抑制病毒增殖的活性，既可抑制多種RNA病毒，又可抑制多種DNA病毒的增殖，但不同病毒對(duì)INF的敏感性不同，相對(duì)而言，有囊膜的病毒最敏感。干擾素抗病毒作用表現(xiàn)在病毒繁殖量減少以及減輕細(xì)胞的損傷。干擾素系統(tǒng)被激活后，使動(dòng)物在1-3周時(shí)間內(nèi)對(duì)其它病毒的重復(fù)感染有抵抗。IFN的抗病毒作用可體現(xiàn)在病毒感染的各個(gè)階段：（1)感染初期：感染細(xì)胞IFN的釋放與新病毒粒子的產(chǎn)生幾乎同時(shí)發(fā)生，因此在體液免疫和細(xì)胞免疫作用之前，IFN反應(yīng)是限制病毒繁殖和擴(kuò)散的主要手段。（2)感染擴(kuò)散期間：血清干擾素在幾分鐘內(nèi)擴(kuò)散到身體的各種器官，而細(xì)胞接觸干擾素只需幾分鐘就產(chǎn)生抗病毒狀態(tài)，并可顯著降低病毒血癥水平。（3)病毒感染靶器官后：在感染恢復(fù)機(jī)制中，干擾素是促進(jìn)感染恢復(fù)的重要因子。數(shù)十年的研究表明，干擾素系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)的關(guān)系十分密切，在抗病毒免疫中可互相協(xié)調(diào)、互相作用。
[0005]盡管干擾素具有抗病毒、調(diào)節(jié)免疫等諸多優(yōu)點(diǎn)，但是目前對(duì)于干擾素的應(yīng)用主要是在人類疾病上。在水產(chǎn)動(dòng)物界干擾素的應(yīng)用不常見，且水產(chǎn)界有關(guān)干擾素的應(yīng)用研究多集中的在I型干擾素，對(duì)于II型干擾素抗病毒作用的研究幾乎沒有。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明要解決上述技術(shù)問題，從而提供一種重組質(zhì)粒pET-IFN y。
[0007]本發(fā)明解決上述問題的技術(shù)方案如下：
重組質(zhì)粒pET-IFN y，它是通過以下方法制備的：
(1)、以草魚RNA為模板，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增，制得擴(kuò)增產(chǎn)物；
(2)、擴(kuò)增產(chǎn)物純化后連接到T載體，制得連接產(chǎn)物；
(3)、連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a，篩選陽性克隆產(chǎn)物；
(4)、陽性克隆產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)粒抽提，用BamHI、Hind III進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物回收IFN y片段，插入原核表達(dá)載體pET-30a的多克隆位點(diǎn)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，然后抽提質(zhì)粒進(jìn)行酶切，得到重組質(zhì)粒pET-IFN y ；
所述反轉(zhuǎn)錄試劑盒的引物如下：
pET-IFN y -U ：CGCGGATCCgattcttggctcaacatgat (酶切位點(diǎn) BamH I )pET-IFN y -L ：CCCAAGCTTtcattgaacctttttgtg (酶切位點(diǎn) Hind III)。
[0008]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種干擾素蛋白。
[0009]干擾素蛋白，它是通過以下方法制備的：
誘導(dǎo)表達(dá)：上述重組質(zhì)粒PET-IFNY轉(zhuǎn)化大腸桿菌，涂布于含抗生素的平板上，培養(yǎng)至平板上出現(xiàn)單克隆菌落，挑取單克隆菌落接種于含抗生素的培養(yǎng)基，培養(yǎng)；得到含有pET-IFNy質(zhì)粒的大腸桿菌菌種；
重組干擾素蛋白的純化：將含有pET-IFNy質(zhì)粒的大腸桿菌菌種接種于含抗生素的培養(yǎng)基，培養(yǎng)，加入IPTG，誘導(dǎo)表達(dá)；離心收集菌體，洗滌后，重懸菌體，并加入溶菌酶，超聲至液體清亮，離心，分離沉淀和上清，溶解沉淀，然后經(jīng)Ni-NTA親和層析獲得純化的融合蛋白。
[0010]本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供上述干擾素蛋白的用途。
[0011]干擾素蛋白的用途，上述干擾素蛋白在鯉科魚類的免疫保護(hù)方面的應(yīng)用。
[0012]本發(fā)明的最后一個(gè)目的是提供一種降低鯉科魚類死亡率的方法。
[0013]降低鯉科魚類死亡率的方法，將上述純化的融合蛋白注射于鯉科魚類腹腔。
[0014]作為上述技術(shù)方案的優(yōu)選，純化的融合蛋白注射量為0. 5?10Pg/g魚體重。
[0015]作為上述技術(shù)方案的優(yōu)選，純化的融合蛋白注射量為0. 5?5Pg/g魚體重。
[0016]作為上述技術(shù)方案的優(yōu)選，純化的融合蛋白注射量為1?3Pg/g魚體重。
[0017]本發(fā)明具有以下有益效果：
1、本發(fā)明提供了一種草魚干擾素原核表達(dá)質(zhì)粒，還提供了一種干擾素蛋白；
2、本發(fā)明還通過試驗(yàn)驗(yàn)證了該干擾素蛋白的有效性：為確定IFNy重組蛋白在草魚體內(nèi)誘導(dǎo)ISG表達(dá)的效果，本技術(shù)用2l^g/g魚體重的IFNy重組蛋白腹腔注射免疫草魚，并通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)草魚肝、脾、腎、腸等4種組織中的ISG，包括IFN、IRF1、IRF7、PKR、STAT3、Mx等基因的轉(zhuǎn)錄水平的變化情況；經(jīng)重組干擾素刺激后，與對(duì)照組相比較，這些ISG基因在4種組織中均被強(qiáng)烈誘導(dǎo)表達(dá)，其中大多數(shù)ISG基因在24 h達(dá)到最高水平，在72h內(nèi)回落到正常水平。這從另一個(gè)方面證實(shí)IFNy重組蛋白的抗病毒效果。
【附圖說明】
[0018]圖1是本發(fā)明的重組質(zhì)粒pET-IFNy構(gòu)建圖（A)及酶切鑒定圖（B);
圖2是本發(fā)明的重組質(zhì)粒pET-IFNy誘導(dǎo)表達(dá)電泳圖；
圖3是本發(fā)明草魚干擾素重組蛋白純化效果圖；
圖4是本發(fā)明IFNy重組蛋白對(duì)CO細(xì)胞的抗病毒活性效果圖；
圖5是本發(fā)明經(jīng)不同劑量IFNy蛋白免疫草魚抗GCRV的累計(jì)死亡率分析圖；
圖6是本發(fā)明腹腔注射IFNy重組蛋白對(duì)草魚IFN刺激基因表達(dá)情況的影響圖（肝臟和脾臟）;
圖7是本發(fā)明腹腔注射IFNy重組蛋白對(duì)草魚IFN刺激基因表達(dá)情況的影響圖（腎臟和腸)。
【具體實(shí)施方式】
[0019]以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的解釋說明。
[0020]本【具體實(shí)施方式】?jī)H僅是對(duì)本發(fā)明的解釋，并不是對(duì)本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀了本發(fā)明的說明書之后所做的修改，只要在權(quán)利要求的范圍內(nèi)，都將受到法律的保護(hù)。
[0021]一、草魚II型干擾素IFNy基因克隆健康草魚以5ML/g魚體重的Poly I:C (lmg/mL)腹腔注射草魚，誘導(dǎo)3 d后取脾臟組織lOOmg，提取脾臟組織的總RNA，用TRizol (Takara，大連）提取總RNA，實(shí)驗(yàn)操作依據(jù)說明書進(jìn)行。提取的RNA用Nanodrop 2000 (Thermo，USA)測(cè)定濃度及純度，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒SMART? MMLV Reverse Transcriptase (TAKARA，大連）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和 PCR 擴(kuò)增，引物如下：pET-IFN y -U ：CGCGGATCCgattcttggctcaacatgat (酶切位點(diǎn) BamH I )pET-IFN y -L ：CCCAAGCTTtcattgaacctttttgtg (酶切位點(diǎn) Hind III)
擴(kuò)增產(chǎn)物采用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit (愛思進(jìn)，USA)進(jìn)行純化，然后再連接到T載體（Takara，大連)，具體操作步驟均按照說明書所示。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a，篩選陽性克隆進(jìn)行測(cè)序鑒定，轉(zhuǎn)化和鑒定方法參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》進(jìn)行。
[0022]二、草魚干擾素原核表達(dá)載體的構(gòu)建上述陽性克隆采用AxyPrep Plasmid Miniprep Kit (愛思進(jìn)，USA)試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒抽提，然后用BamH I、Hind III (Takara，大連）進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物用AxyPrep DNA GelExtraction Kit (愛思進(jìn)，USA)回收IFN y片段，插入原核表達(dá)載體pET_30a的多克隆位點(diǎn)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，然后抽提質(zhì)粒進(jìn)行酶切和測(cè)序鑒定，重組質(zhì)粒構(gòu)建圖及酶切鑒定圖如圖1所