一種用于分析dna樣本中mlh1啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)的試劑盒、方法和引物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于分析DNA樣本中MLHl啟動(dòng)子甲基化 狀態(tài)的試劑盒、方法和引物。
【背景技術(shù)】
[0002] Lynch綜合征是結(jié)腸直腸腸癌（CRC)的遺傳形式，新診斷的CRC患者有2-5%與之 有關(guān)。Lynch綜合征是由DNA錯(cuò)配修復(fù)（MMR)基因（MLH1、MSH2、MSH6、PMS2)種系突變?cè)?成的，從而引起高的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性并且導(dǎo)致MMR蛋白表達(dá)缺失。然而，僅有15%的MSI-H CRC與Lynch綜合征相關(guān)聯(lián)，剩余的85%在起源上大部分是偶發(fā)性的，由此錯(cuò)配修復(fù)缺陷是 由MLHl基因的啟動(dòng)子超甲基化沉默造成的，并且這經(jīng)常與基因 BRAF突變相結(jié)合。因此，與 BRAF V600E突變相結(jié)合的MLHl啟動(dòng)子DNA甲基化已經(jīng)被認(rèn)為一種可靠且標(biāo)準(zhǔn)的現(xiàn)有技術(shù) 的分子測(cè)試，以區(qū)分Lynch綜合征和具有MSI-H表型的偶發(fā)性CRC并且確定需要基因檢測(cè) 的Lynch綜合征相關(guān)的CRC患者。作為一種遺傳性結(jié)腸癌綜合征，Lynch綜合征的特點(diǎn)以及 與之相關(guān)的這些基因標(biāo)記詳見(jiàn)于H. F. A. Vasen等（2007) J Med. Genet. 44:353-362，M. Gala 等（2011) Semin. Oncol. 38:490-499, R.S. Nelson 等（2009) Curr. Oncol. R印.11:482-489， E. Lastra 等（2012)Clin.Transl.0ncol.l4:254_262，E. Domingo 等（2004)J.Med. Genet.41:664_668 以及 E. Domingo 等（2005)0ncogene 24:3995-3998。
[0003] Lynch綜合征不過(guò)是在本發(fā)明的范圍內(nèi)的多種類(lèi)型的癌癥及非癌腫瘤性疾病。其 他癌癥可包括同樣在本發(fā)明的范圍內(nèi)的子宮內(nèi)膜癌和胃癌，以及任何未來(lái)發(fā)現(xiàn)的癌癥或表 現(xiàn)出MLHl基因啟動(dòng)子超甲基化的其他腫瘤性疾病。
[0004] 存在幾種現(xiàn)有技術(shù)的方法來(lái)確定MLHl DNA甲基化狀態(tài)的組織。然而，這些方法是 非定量的，或者它們使用不專(zhuān)門(mén)檢測(cè)甲基化MLHl DNA的引物和探針，或不選擇性靶向?qū)τ?MLHl表達(dá)關(guān)鍵的啟動(dòng)子基因組區(qū)域的引物和探針。這些方法詳見(jiàn)于M. Bettstetter (2007) Clin. Cancer Res. 13:3221-3228，C. A.Eads 等（2000)Nucl. Acids Res. 28: e32，K.Rand 等 (2002)Methods 27:114-120, H.Thomassin (2004) Nucl. Acids Res. 32: el68 以及 G. Deng 等 (1999)Cancer Res. 59:2029-2023。此外，這些方法都未在大患者群中得到驗(yàn)證。這些限制 會(huì)妨礙科學(xué)家和臨床醫(yī)生對(duì)測(cè)試的腫瘤的MLHl甲基化狀態(tài)給出明確的解釋。
[0005] 用于分析MLHl甲基化的兩種高引用的方法詳見(jiàn)于M. Bettstetter等（2007)和 C. A. Eads等（2000)。然而，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)沒(méi)有方法對(duì)用MLHl蛋白表達(dá)和BRAF突變的已知 信息明確確定在CRC腫瘤組中MLHl甲基化提供一貫明確的界限。
[0006] 照慣例，結(jié)合MSI分析，MMR蛋白表達(dá)，MLHl啟動(dòng)子甲基化和BRAF突變已被認(rèn)為是 用于選擇未來(lái)基因測(cè)試的Lynch綜合征候選項(xiàng)的標(biāo)準(zhǔn)分子測(cè)試。E. Lastra等（2012)。然 而，目前可用的測(cè)定MLHl DNA甲基化的方法在不同的研究中頻繁地產(chǎn)生不一致的結(jié)果，因 此無(wú)法應(yīng)用于診斷目的。MLHl甲基化的不同策略的比較詳見(jiàn)于L. P6rez-Carbonell (2010) J. Mol. Diagn. 12:498-504,該文獻(xiàn)通過(guò)引用的方式全部并入本文中。此外，在現(xiàn)在臨床的使 用中，并沒(méi)有FDA認(rèn)準(zhǔn)的對(duì)MLHl甲基化的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試。
[0007] 另外，選擇患者進(jìn)行基因測(cè)試以診斷Lynch綜合征在臨床實(shí)踐中具有挑戰(zhàn)性。用 于確定應(yīng)當(dāng)測(cè)試MSI的人的Amsterdam和Bethesda標(biāo)準(zhǔn)在Lynch綜合征檢測(cè)的敏感性和 特異性方面有大量限制，詳見(jiàn)于S.A. Wahlberg等（2002) Cancer Res. 62:3485-3492以及 A. Umar (2004) J. Natl Cancer Inst. 96:261-268。結(jié)果，忽視了大量的 Lynch 綜合征患者并 且并沒(méi)有錯(cuò)配修復(fù)基因突變的許多患者卻被送去進(jìn)行基因測(cè)試，從而導(dǎo)致不必要地增加患 者的不便以及實(shí)驗(yàn)室開(kāi)支。因此，需要額外的更特異的測(cè)試方法。
[0008] 包括結(jié)合MSI的分析、MMR蛋白表達(dá)、MLHl啟動(dòng)子甲基化和BRAF突變的常規(guī)測(cè)試 已被當(dāng)作候選未來(lái)基因檢測(cè)選擇Lynch綜合征的標(biāo)準(zhǔn)分子測(cè)試。然而，目前可用的方法是 非定量的，或者它們使用不專(zhuān)門(mén)檢測(cè)甲基化MLHl DNA的引物和探針，或不選擇性靶向?qū)τ?MLHl表達(dá)關(guān)鍵的啟動(dòng)子基因組區(qū)域的引物和探針。這些限制妨礙對(duì)測(cè)試的腫瘤的MLHl甲 基化狀態(tài)給出明確的解釋并且得出假陽(yáng)性。
[0009] 因此，需要一種可復(fù)制的方法用于明確檢測(cè)患者（包括但不限于患有結(jié)腸直腸 癌、胃癌和子宮內(nèi)膜癌的患者）的某些瘤細(xì)胞，并且定量測(cè)量MLHl啟動(dòng)子DNA的甲基化 DNA，這種定量測(cè)量提供正-負(fù)DNA甲基化的離散測(cè)量。還需要一種連續(xù)測(cè)量DNA甲基化水 平及模式方法，以分類(lèi)并預(yù)測(cè)癌癥的不同類(lèi)型及階段、癌癥的治療結(jié)果及患者的生存率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明公開(kāi)了通過(guò)以下方式對(duì)與一般在個(gè)體中的一些癌癥和腫瘤性疾病有關(guān)的 差異甲基化MLHl啟動(dòng)子DNA序列進(jìn)行識(shí)別并定量分析的方法和單管試驗(yàn)：從個(gè)體獲得包含 DNA的生物樣本；檢測(cè)甲基化MLHl啟動(dòng)子序列并且測(cè)量其水平；并且將樣本中的甲基化和 甲基化水平與在同一單管反應(yīng)中擴(kuò)增的"正常"的β-肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子的正?；瘏⒄?水平作比較，其中，樣本甲基化的水平或模式與正?；瘏?shù)水平相比的差異識(shí)別異常甲基 化MLHl啟動(dòng)子序列。
[0011] 本發(fā)明的第一方面提供了一種用于分析DNA樣本中與腫瘤性疾病相關(guān)的MLHl啟 動(dòng)子甲基化狀態(tài)的試劑盒，試劑盒包括寡核苷酸引物，所述寡核苷酸引物與在相對(duì)于轉(zhuǎn)錄 起始位點(diǎn)從-248bp至-178bp的區(qū)域中的MLHl啟動(dòng)子的至少一部分序列互補(bǔ)并且與其中 的甲基化位點(diǎn)重疊。
[0012] 優(yōu)選的，所述寡核苷酸引物為正向和反向寡核苷酸引物，作為相對(duì)于所述轉(zhuǎn)錄起 始位點(diǎn)從-248bp至-178bp的所述MLHl啟動(dòng)子區(qū)域的至少一部分的側(cè)翼，并且其中所述正 向和反向寡核苷酸引物的至少一個(gè)在其中的甲基化位點(diǎn)重疊。
[0013] 優(yōu)選的，所述正向寡核苷酸引物選自由以下組成的組：SEQ ID NO. :1，SEQ ID NO. :3, SEQ ID NO. :5, SEQ ID NO. :6, SEQ ID NO. :7 和 SEQ ID NO. :8 ;
[0014] 所述反向寡核苷酸引物選自由以下組成的組：SEQ ID NO. :2和SEQ ID NO. :9。
[0015] 優(yōu)選的，所述試劑盒還包括寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針與所述MLHl啟動(dòng)子 互補(bǔ)，并且在5'端用熒光報(bào)告劑標(biāo)記并且在3'端用熒光淬滅劑標(biāo)記。
[0016] 本發(fā)明的第二方面提供了一種用于分析單管DNA樣本中與腫瘤性疾病相關(guān)的 MLHl啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)的試劑盒，所述試劑盒包括：
[0017] 第一對(duì)正向和反向寡核苷酸引物，作為相對(duì)于所述轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)從-248bp 至-178bp的所述MLHl啟動(dòng)子區(qū)域的至少一部分的側(cè)翼，并且其中所述正向和反向寡核苷 酸引物的至少一個(gè)在其中的甲基化位點(diǎn)重疊；以及
[0018] 第二對(duì)正向和反向寡核苷酸引物，所述引物為所述樣本DNA的未甲基化區(qū)域的側(cè) 翼；所述樣本DNA的未甲基化區(qū)域是β-肌動(dòng)蛋白基因。
[0019] 優(yōu)選的，所述的試劑盒進(jìn)一步包括：
[0020] 第一寡核苷酸探針，與所述MLHl啟動(dòng)子序列互補(bǔ)，并且在5'端用第一焚光報(bào)告劑 標(biāo)記并且在3'端用熒光淬滅劑標(biāo)記；以及
[0021] 第二寡核苷酸探針，與所述樣本DNA的未甲基化區(qū)域互補(bǔ)，并且在5'端用第二熒 光報(bào)告劑標(biāo)記并且在3'端用熒光淬滅劑標(biāo)記，其中所述第一和第二熒光報(bào)告劑不同。
[0022] 本發(fā)明的第三方面提供了一種用于分析DNA樣本中與腫瘤性疾病相關(guān)的MLHl啟 動(dòng)子甲基化狀態(tài)的方法，包括以下步驟：
[0023] 提供第一對(duì)正向和反向寡核苷酸引物，所述第一對(duì)正向和反向寡核苷酸引物作為 相對(duì)于所述轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)從 -248bp至-178bp的所述MLHl啟動(dòng)子區(qū)域的至少一部分的側(cè) 翼，并且其中所述正向和反向寡核苷酸引物的至少一個(gè)在其中的甲基化位點(diǎn)重疊；并且
[0024] 提供第一寡核苷酸探針，所述第一寡核苷酸探針與所述MLHl啟動(dòng)子序列互補(bǔ)，并 且在5'端用第一熒光報(bào)告劑標(biāo)記并且在3'端用熒光淬滅劑標(biāo)記；<