一種egfr抗體可變區(qū)及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體而言涉及一種EGFR的單克隆抗體，本發(fā)明還涉及 所述抗體的制備方法與其在制備檢測(cè)EGFR試劑盒中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor)是上皮生長(zhǎng)因子（EGF)細(xì)胞增殖和信 號(hào)傳導(dǎo)的受體。EGFR是一種糖蛋白，屬于酪氨酸激酶型受體，細(xì)胞膜貫通，分子量170KDa。 EGFR位于細(xì)胞膜表面，靠與配體結(jié)合來(lái)激活，包括EGF和TGFa (transforming growth factor α )。激活后，EGFR由單體轉(zhuǎn)化為二聚體。EGFR屬于ErbB受體家族的一種，該家族 包括 EGFR (ErbB-I)，HER2/c-neu (ErbB-2)，Her 3 (ErbB-3)和 Her 4 (ErbB-4)。EGFR 二聚后 可以激活它位于細(xì)胞內(nèi)的激酶通路，包括Y992, Y1045, Y1068, Y1148and Y1173等激活位點(diǎn)。 這個(gè)自磷酸化可以引導(dǎo)下游的磷酸化，包括MPAK，Akt和JNK通路，誘導(dǎo)細(xì)胞增殖。
[0003] EGFR也被稱作HERUErbBl，突變或過(guò)表達(dá)一般會(huì)引發(fā)腫瘤。研究表明在許多實(shí)體 腫瘤中存在EGFR的高表達(dá)或異常表達(dá)。EGFR與腫瘤細(xì)胞的增殖、血管生成、腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移 及細(xì)胞凋亡的抑制有關(guān)。EGFR的過(guò)表達(dá)在惡性腫瘤的演進(jìn)中起重要作用，膠質(zhì)細(xì)胞瘤、腎 癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌等組織中都有EGFR的過(guò)表達(dá)。EGFR的高表達(dá)主不僅涉 及其基因過(guò)多擴(kuò)增，還存在于翻譯及翻譯后。EGFR在腫瘤中的高表達(dá)還可能與活化后降解 減少有關(guān)，一些研究指出c-Src可通過(guò)抑制受體泛素化和內(nèi)吞作用而上調(diào)EGFR水平。
[0004] 單克隆抗體由單一 B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的高度均一、僅針對(duì)某一特定抗原表位的抗 體。通常采用雜交瘤技術(shù)來(lái)制備，雜交瘤（hybridoma)抗體技術(shù)是在細(xì)胞融合技術(shù)的基礎(chǔ) 上，將具有分泌特異性抗體能力的致敏B細(xì)胞和具有無(wú)限繁殖能力的骨髓瘤細(xì)胞融合為B 細(xì)胞雜交瘤。單克隆抗體除了用于制備特異性的治療藥物，此外由于其與物質(zhì)結(jié)合是特異 的，所以單克隆抗體還廣泛可用于檢測(cè)試劑的制備。
[0005] 鑒于此，本領(lǐng)域需要一種準(zhǔn)確檢測(cè)EGFR表達(dá)水平的試劑，用于各類與EGFR高表達(dá) 的疾病的診斷。為解決上述問(wèn)題本發(fā)明人通過(guò)雜交瘤技術(shù)篩選到了特異性強(qiáng)、靈敏度高的 EGFR抗體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 由于EGFR在眾多腫瘤疾病中高表達(dá)，為此開(kāi)發(fā)一種能準(zhǔn)確檢測(cè)EGFR表達(dá)水平的 試劑，對(duì)于用于各類與EGFR高表達(dá)的疾病的診斷具有重要的臨床意義。為此本發(fā)明通過(guò)雜 交瘤技術(shù)篩選出了多株與EGFR特異性結(jié)合的單克隆抗體，其中編號(hào)為YL06的抗體株結(jié)合 效果最好。
[0007] 本發(fā)明公開(kāi)了一種抗人EGFR的單克隆抗體YL06,所述單克隆抗體包括輕鏈和重 鏈，其氨基酸可變區(qū)序列分別如序列表中SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2所示。
[0008] 本發(fā)明所述的單克隆抗體YL06的輕鏈蛋白質(zhì)分子可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)CDR1、 CDR2、CDR3的氨基酸序列，分別如序列表中SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5所示。 所述單克隆抗體的重鏈蛋白質(zhì)分子可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分 別如序列表中 SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8 所示。
[0009] 本發(fā)明還公開(kāi)了上述單克隆抗體YL06的制備方法，主要包括如下：
[0010] 1.抗人EGFR單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的構(gòu)建
[0011] 首先，原核表達(dá)人EGFR蛋白，免疫Balb/c小鼠，用常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞融合。用間 接ELISA法篩選陽(yáng)性細(xì)胞克隆再反復(fù)亞克隆，直到所有雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清檢測(cè)為100% 陽(yáng)性。
[0012] 2.雜交瘤細(xì)胞抗體輕、重鏈基因的釣取
[0013] 提取單克隆抗體YL06細(xì)胞的RNA，經(jīng)RT-PCR，用特異性引物釣取抗體的輕重鏈基 因。常規(guī)法連接入載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌，培養(yǎng)后挑取單個(gè)菌落，提取質(zhì)粒PCR鑒定后進(jìn)行 DNA測(cè)序分析。
[0014] 3.單克隆抗體YL06可變區(qū)氨基酸序列和互補(bǔ)決定區(qū)氨基酸序列的分析
[0015] 用www. expasy. org在線軟件將單克隆抗體YL06的輕、重鏈可變區(qū)核苷酸序列翻 譯為其編碼的氨基酸序列，單克隆抗體YL06的輕、重鏈可變區(qū)氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO :1 和 SEQ ID NO :2 所示；
[0016] 根據(jù)Kabat數(shù)據(jù)庫(kù)確定單克隆抗體YL06輕鏈可變區(qū)序列中的互補(bǔ)決定區(qū)⑶R1、 CDR2和CDR3的氨基酸序列分別如序列表中SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4和SEQ ID NO :5所 示；重鏈可變區(qū)序列中的互補(bǔ)決定區(qū)⑶R1XDR2和⑶R3的氨基酸序列分別如序列表中SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7 和 SEQ ID NO :8 所示；
[0017] 本發(fā)明的單克隆抗體基于上述已克隆到的人EGFR結(jié)合性單克隆抗體YL06輕、重 鏈可變區(qū)基因，可構(gòu)建和表達(dá)多種小分子基因工程抗體，如單鏈抗體、單域抗體、嵌合抗體、 Fab抗體、抗體融合蛋白等；基于上述基因所編碼的多肽或蛋白質(zhì)，可以交聯(lián)上多種生物活 性分子，制備用于EGFR表達(dá)水平檢測(cè)、診斷和治療EGFR高表達(dá)所導(dǎo)致疾病的診斷或治療藥 物。
[0018] 本發(fā)明基于YL06抗體構(gòu)建了用于檢測(cè)EGFR的ELISA試劑盒，所述的ELISA試劑 盒包括：抗EGFR抗體YL06、HRP標(biāo)記的羊抗小鼠 IgG抗體、辣根過(guò)氧化物酶底物緩沖液、蛋 白標(biāo)準(zhǔn)品人EGFR(100ug/ml，0.1 ml)、陰性對(duì)照樣品BSA。
[0019] 本發(fā)明還對(duì)單克隆抗體YL06的靈敏性進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示本發(fā)明的試劑盒能 夠靈敏的檢測(cè)樣品中EGFR的含量，其靈敏度能夠達(dá)到0. lng/ml。
[0020] 本發(fā)明的所述的YL06抗體或其片段也可連接化學(xué)物部分。這些化學(xué)物部分可以 是多聚物、熒光標(biāo)記物、細(xì)胞毒性因子、放射性核素等?；瘜W(xué)物部分優(yōu)選可提供抗體在體內(nèi) 半衰期的多聚物。適合的多聚物包括（但不限于）聚乙二醇、右旋糖酐和單甲基聚乙二醇。
[0021] 本發(fā)明抗體和抗體片段可以連接熒光或化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物，如熒光團(tuán)如稀土螯合 物、熒光素及其衍生物、羅丹明及其衍生物、異硫氰酸酯、藻紅蛋白、水母發(fā)光蛋白標(biāo)記物、 生物素/親和素、旋光標(biāo)記物和穩(wěn)定自由基。
[0022] 本發(fā)明抗體和抗體片段分子也可交聯(lián)細(xì)胞毒性因子，例如白喉毒素、蓖麻毒素 A 鏈、α-八疊球菌、Phytoiacca americana蛋白、PAP I，PAP II和PAPS、苦瓜抑制物、局限曲 霉素、酸霉素和依諾霉素。
[0023] 對(duì)本發(fā)明的抗體或抗體片段對(duì)應(yīng)的氨基酸或核苷酸序列進(jìn)行淺顯的或微小的修 改也在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)，包括（但絕不限于）把一個(gè)氨基酸殘基替換成另外一個(gè)具有 類似特征的氨基酸。具有特征類似的氨基酸被本領(lǐng)域所熟知。例如可互相替換的極性/ 親水氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、 天冬氨酸和谷氨酸；可互相替換的非極性/疏水氨基酸，包括甘胺酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨 酸、異亮氨酸、脯氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；可互相替換的酸性氨基酸，包 括天冬氨酸和谷氨酸；可以互相替換的堿性氨基酸，包括組胺酸、賴氨酸和精氨酸。
[0024] 本發(fā)明所述的抗體、抗體片段或抗體突變體的表達(dá)，可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技 術(shù)，將獲得編碼部分或全長(zhǎng)輕鏈和重鏈的DNA，克隆到不同的表達(dá)載體中，使該基因有效地 連接于轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列。選擇和使用的表達(dá)宿主細(xì)胞相容的表達(dá)載體和表達(dá)調(diào)控序 列。該抗體輕鏈基因和抗體重鏈基因可以插入到不同的載體，或者更通常地，這兩種基因都 被插入到同一個(gè)表達(dá)載體中。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法（例如，連接抗體基因片段和載體上的互補(bǔ)性 限制位點(diǎn)，或者，如果不存在限制位點(diǎn)，進(jìn)行平端連接）將該抗體基因插入到表達(dá)載體中。 本文所述的該抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)可用于產(chǎn)生任何抗體同類型的全長(zhǎng)抗體基因，其通 過(guò)以這樣的方式將它們插入到已經(jīng)編碼期望的同種型的重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)的表達(dá) 載體，使得VH片段有效連接到載體中的重鏈恒定（CH)片段，VL片段有效連接到載體中的輕 鏈恒定（CL)片段。此外或可選地，該重組表達(dá)載體可以編碼促進(jìn)宿主細(xì)胞分泌抗體鏈的信 號(hào)肽。該抗體鏈基因可以被克隆到載體中，使得信號(hào)肽符合讀碼框地連接抗體鏈基因的氨 基端。該信號(hào)肽可以是免疫球蛋白信號(hào)肽或異源信號(hào)肽（即源自非免疫球蛋白的信號(hào)肽）。
[0025] 本發(fā)明的抗EGFR抗體分子可通過(guò)重組技術(shù)生產(chǎn)在原核細(xì)胞中表達(dá)。如將編碼本 發(fā)明抗體分子的核酸插入到PET的質(zhì)粒中，并在大腸桿菌/T7系統(tǒng)中表達(dá)。將重組后的表 達(dá)載體可以通過(guò)任何已知的方法導(dǎo)入宿主細(xì)胞。將異源多核苷酸導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法 為本領(lǐng)域所熟知，包括右旋糖酐介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、磷酸鈣沉淀法、polybrene介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、原生質(zhì) 體融合法、電穿孔法、多核