基于蛋白結(jié)合的fv文庫(kù)及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及構(gòu)建基于蛋白結(jié)合的Fv文庫(kù)的方法，用所述構(gòu)建的Fv文庫(kù)篩選需要 的抗體的方法，通過(guò)所述篩選方法篩選的Fv抗體，W及通過(guò)所述Fv文庫(kù)構(gòu)建方法構(gòu)建的Fv 文庫(kù)。
【背景技術(shù)】
[0002] 抗體是通過(guò)免疫系統(tǒng)的B-淋己細(xì)胞應(yīng)答抗原、識(shí)別抗原和結(jié)合抗原所產(chǎn)生的蛋 白。該類抗體被視為新的用于治療疾病的蛋白質(zhì)藥物候選物。為了發(fā)現(xiàn)所需的功能性抗體， 構(gòu)建了各種抗體文庫(kù)，并從抗體文庫(kù)中篩選功能性抗體。使用基因重組技術(shù)構(gòu)建該類抗體 文庫(kù)。具體地說(shuō)，從人體的B-細(xì)胞中提取編碼抗體蛋白的基因W構(gòu)建抗體基因文庫(kù)，從文 庫(kù)中篩選具有所需抗原結(jié)合特異性的抗體?？贵w文庫(kù)技術(shù)為構(gòu)建諸如人類抗體的抗體帶來(lái) 了革命。如果抗原是不同于體內(nèi)成分的外來(lái)物質(zhì)，抗體免疫應(yīng)答最突出的特征是在一周內(nèi) 抗體能特異性地與一種抗原或一種形態(tài)的抗原結(jié)合。抗體由B-淋己細(xì)胞產(chǎn)生，一種單一的 B淋己細(xì)胞只產(chǎn)生一種類型的抗體。事實(shí)上，已知人體中存在無(wú)數(shù)的B淋己細(xì)胞，每個(gè)B淋己 細(xì)胞表達(dá)在細(xì)胞膜上具有獨(dú)特抗原結(jié)合特異性的抗體。通常已知在人體中大約有1〇8種抗 原結(jié)合多樣性存在。當(dāng)抗原侵入身體時(shí)，只有表達(dá)特異性結(jié)合該抗原的抗體的B淋己細(xì)胞 快速增殖從而產(chǎn)生大量的抗體，因此，血清中抗體的濃度快速增加從而迅速地清除入侵的 抗原，因此，在人體中抗體多樣性數(shù)W萬(wàn)計(jì)，該種抗體多樣性被稱為抗體譜（repertoire)。 因此，當(dāng)從人體通過(guò)血液收集到足夠數(shù)量的B淋己細(xì)胞之后，從細(xì)胞中分離mRNA并通過(guò) RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈反應(yīng)）合成編碼抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的cDNA，能 W相對(duì)簡(jiǎn)單的方式在體外構(gòu)建基因形式的人類抗體譜?？贵w文庫(kù)技術(shù)的關(guān)鍵是當(dāng)通過(guò)任何 介質(zhì)（基因型-表型連接）拼接結(jié)合（paring)編碼該抗體蛋白的基因時(shí)，都能將該種人類 抗體基因譜表達(dá)（或展示）為蛋白，從而測(cè)試從抗體文庫(kù)中篩選的與特定抗原結(jié)合的抗體 并獲得編碼特異性抗體的基因。在此，不需要完全免疫，抗體譜或W具有抗原結(jié)合功能的抗 體的Fab展示，或W名為scFv(單鏈可變片段）的抗體片段展示，所述scFv的重鏈可變區(qū) 和輕鏈可變區(qū)（Vh和VJ通過(guò)大概15個(gè)氨基酸的短膚接頭相互連接。在此，根據(jù)用于基因 型-表型連接介質(zhì)的類型，將所述展示分為瞻菌體展示、核糖體展示、酵母展示等等，并且 不用通過(guò)給予抗原誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答就能獲得具有所需的抗原結(jié)合特征的抗體。然而，抗體 文庫(kù)構(gòu)建和抗體篩選所需的很多訣資存在缺點(diǎn)，獲得高親和力抗體不容易，因此抗體篩選 后頻繁地進(jìn)行諸如親和力成熟的抗體優(yōu)化步驟，因?yàn)橹T如毒性問(wèn)題不能進(jìn)行哺乳動(dòng)物細(xì)胞 中的功能性分析，特別是在第一步篩選中。因?yàn)橹委熜钥贵w不是簡(jiǎn)單地結(jié)合抗原還應(yīng)該有 治療功能，此缺點(diǎn)成為治療性抗體開(kāi)發(fā)的障礙。
[0003] 在抗體文庫(kù)中，最頻繁使用的是瞻菌體展示抗體文庫(kù)。實(shí)際上，阿達(dá)木單抗 (Humira)(抗-TNF-alpha人單克隆抗體）是通過(guò)瞻菌體展示技術(shù)制備的治療性抗體，所述 阿達(dá)木單抗是目前商業(yè)上可購(gòu)買的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎治療制劑。理想的抗體文庫(kù)包括巨大的 抗體多樣性，因此具有所需的抗原結(jié)合特異性的高親和性抗體克隆可W從其中篩選。為了 該個(gè)目的，應(yīng)該構(gòu)建具有大約l〇W-l〇ii抗體文庫(kù)的庫(kù)。然而，通過(guò)抗體基因克隆構(gòu)建具有該 個(gè)規(guī)模的文庫(kù)很困難，被看做是瞻菌體展示抗體文庫(kù)構(gòu)建中最困難的問(wèn)題。此外，因?yàn)檎熬?體本身表現(xiàn)毒性，存在由于功能性分析不能直接進(jìn)行的缺點(diǎn)。核糖體展示技術(shù)最大的優(yōu)勢(shì) 是無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)，因此理論上，能通過(guò)核糖體展示技術(shù)容易地構(gòu)建具有10"大容量的文庫(kù)。因 此，核糖體展示技術(shù)有利于篩選高親和力抗體（通常，抗體文庫(kù)容量越大，文庫(kù)中包括的高 親和力抗體的可能性越大）。此外，因?yàn)樵诤颂求w展示技術(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，能使用易于出錯(cuò) 的聚合酶等等，因此很容易引入人工誘導(dǎo)的突變。然而，核糖體展示技術(shù)也有毒性問(wèn)題和不 同的實(shí)驗(yàn)問(wèn)題。為此，瞻菌體展示技術(shù)主要用于原初起源（naiveorigin)的抗體文庫(kù)的構(gòu) 建。在酵母展示技術(shù)中，因?yàn)樾枰獙⒅亟M載體插入釀酒酵母（S.cerevisiae)菌株的過(guò)程并 且酵母細(xì)胞的細(xì)胞大，制備具有1〇9或更多多樣性的抗體文庫(kù)有許多的技術(shù)限制。因此，酵 母展示技術(shù)主要用于構(gòu)建已建立的抗原特異性的抗體的突變文庫(kù)和用于從突變文庫(kù)中篩 選高親和力抗體。
[0004] 然而，在該些抗體文庫(kù)中，所有抗體沒(méi)有單獨(dú)地分開(kāi)，而是混合在一起。該些抗體 文庫(kù)在篩選針對(duì)基于其功能（活性）的目標(biāo)抗原的抗體有局限但不是不可能，只有篩選基 于與抗體結(jié)合的抗體有可能。在隨后步驟中檢查該個(gè)過(guò)程獲得的起始抗體候選物的功能 來(lái)選擇具有功能的抗體。大部分情況下，在選擇步驟中獲得能容易結(jié)合但不具有功能的抗 體。因此，需要新的方法克服篩選方法的局限。換句話說(shuō)，需要從一開(kāi)始就基于抗體的功 能來(lái)篩選抗體的方法。然而，現(xiàn)有文庫(kù)處在不同抗體混合在一起的狀態(tài)，不可能基于抗體 的功能篩選單個(gè)抗體。因此，在特別分離的文庫(kù)中，類似于低分子量化合物文庫(kù)，如果有可 能單個(gè)地純化和儲(chǔ)存所有抗體，則有可能基于抗體功能篩選抗體。然而，因?yàn)榭贵w是蛋白 質(zhì)，需要表達(dá)并純化抗體的過(guò)程，因此，實(shí)際上不可能構(gòu)建100, 000或1，000, 000種不同 抗體的文庫(kù)。換句話說(shuō)，傳統(tǒng)方法的缺點(diǎn)在于，由于當(dāng)文庫(kù)多樣性被假定為1，000, 000,就 需要純化1，000, 000種蛋白質(zhì)，隨著多樣性的增加，所需蛋白質(zhì)純化的個(gè)數(shù)呈指數(shù)增加。 傳統(tǒng)文庫(kù)構(gòu)建技術(shù)包括通過(guò)在DNA水平在載體中結(jié)合Vh和Vj勾建文庫(kù)的技術(shù)扣.S.Pat No. 8, 178, 320)，在DM水平構(gòu)建抗體輕鏈和重鏈的文庫(kù)技術(shù)扣.S.PatNo. 7, 858, 559)等 等。然而，該些文庫(kù)構(gòu)建技術(shù)的缺陷在于；要純化所需數(shù)量的蛋白質(zhì)W構(gòu)建具有在DM水平 滿足蛋白結(jié)合的多樣性的文庫(kù)，由于抗體的幾何級(jí)數(shù)，不能立即分析在構(gòu)建的文庫(kù)中的抗 體的功能，為此，需要減少抗體數(shù)目的附加步驟，所述抗體能通過(guò)結(jié)合抗原來(lái)篩選并分析它 們的功能。在篩選過(guò)程中，會(huì)丟失真正重要的抗體。特別是，在傳統(tǒng)文庫(kù)構(gòu)造方法中，F(xiàn)v應(yīng) 在DNA水平組合表達(dá)，因此，需要與文庫(kù)多樣性相對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)純化。因此，在傳統(tǒng)文庫(kù)構(gòu) 建方法中，不可能構(gòu)建一個(gè)包括單個(gè)地分開(kāi)的抗體的文庫(kù)。
[0005] 在該種情況下，本發(fā)明人開(kāi)展大量的工作來(lái)開(kāi)發(fā)將抗體單個(gè)地分開(kāi)從而能功能性 地篩選它們的文庫(kù)。因此，本發(fā)明人關(guān)注文庫(kù)的構(gòu)建，不同于傳統(tǒng)文庫(kù)構(gòu)建中在DNA水平結(jié) 合抗體結(jié)構(gòu)域的技術(shù)，而是在蛋白質(zhì)水平發(fā)生結(jié)合，并發(fā)現(xiàn)在蛋白質(zhì)水平通過(guò)結(jié)合Vh和VL 能構(gòu)建基于蛋白結(jié)合的Fv文庫(kù)，從而完成本發(fā)明。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種基于蛋白結(jié)合構(gòu)建Fv(可變片段）文庫(kù)的方法。
[0007] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種通過(guò)上述基于蛋白結(jié)合構(gòu)建Fv文庫(kù)的方法所構(gòu) 建的Fv文庫(kù)篩選所需抗體的方法。
[000引本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供通過(guò)上述篩選方法篩選的所需Fv抗體。
[0009] 本發(fā)明的再另一目的是提供通過(guò)上述基于蛋白結(jié)合構(gòu)建Fv文庫(kù)的方法構(gòu)建的Fv 文庫(kù)。
[0010] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，一方面，本發(fā)明提供基于蛋白結(jié)合的Fv(可變片段）文庫(kù)和構(gòu) 建該Fv文庫(kù)的方法。
[0011] 更具體地說(shuō)，本發(fā)明提供基于蛋白結(jié)合的Fv文庫(kù)，所述Fv文庫(kù)包括與V苗吉構(gòu)域 蛋白連接的Vh結(jié)構(gòu)域蛋白。
[0012] 本發(fā)明也提供基于蛋白結(jié)合構(gòu)建Fv文庫(kù)的方法。該方法包括步驟；(a)制備重鏈 可變區(qū)（Vh)結(jié)構(gòu)域蛋白和輕鏈可變區(qū)（W結(jié)構(gòu)域蛋白；和化）將步驟（a)制備的Vh結(jié)構(gòu) 域蛋白和V苗吉構(gòu)域蛋白相互拼接結(jié)合（paring)。
【附圖說(shuō)明】
[0013] 圖1示意性示出融合蛋白，每個(gè)融合蛋白包括祀標(biāo)-LPETG-連接膚（linker)(具 有任何一種不同長(zhǎng)度）-轉(zhuǎn)膚酶-組氨酸標(biāo)簽。（A);由7個(gè)氨基酸組成的連接膚，炬）：由 18個(gè)氨基酸組成的連接膚，（C):由20個(gè)氨基酸組成的連接膚。
[0014] 圖2示意性示出通過(guò)配對(duì)結(jié)合來(lái)連接W構(gòu)建根據(jù)本發(fā)明的基于蛋白結(jié)合的Fv文 庫(kù)。（A);野生型之間的配對(duì)結(jié)合；炬）：通過(guò)二硫鍵的配對(duì)；和（C)通過(guò)卷曲螺旋的配對(duì)。
[0015] 圖3示意性示出簡(jiǎn)單的蛋白質(zhì)純化過(guò)程。
[0016] 圖4示出純化的Vl和VH突變體的SDS-PAGE結(jié)果。
[0017] 圖5示出為無(wú)Flag標(biāo)簽的Vh結(jié)構(gòu)域蛋白Vh-G44C的表達(dá)、在N-端具有Flag標(biāo)簽 的Flag-VH-G44C的表達(dá)、在N-端和C-端具有Flag標(biāo)簽的Flag-VH-G44C-Flag蛋白的表 達(dá)，其隨著Flag標(biāo)簽的存在而增加。
[001引圖6示出存在和不存在轉(zhuǎn)膚酶W及存在和不存在Flag的情況下，重組蛋白的表達(dá) 和純化產(chǎn)率的對(duì)比。
[0019] 圖7是示出分析通過(guò)配對(duì)而連接的Vh-Vl的方法的示意圖。
[0020] 圖8示出分析Vh-VJS對(duì)的ELISA結(jié)果。
[002U圖9示出分析Flag-Va和Flag-VL配對(duì)的化ISA結(jié)果。
[002引圖10示出引入半脫氨酸突變的Vh-VJS對(duì)的SDS-PA(iE結(jié)果。
[002引 圖11示出SDS-PAGE結(jié)果，表明Flag-Va和Flag-VL的配對(duì)增加VH和VL的配對(duì)。
[0024]圖 12 示出Vl-IAALK3、Flag-VH-IAALE3-Flag和組裝的Fv的沈C-HPLC結(jié)果。
[002引 圖13示出V。Vh和組裝的Fv野生型的MLDI-TOF分析結(jié)果。
[0026]圖14示出V廣Q100C、Flag-VH-G44C-Flag和組裝的Fv的MALDI-TOF分析結(jié)果。
[0027]圖 15 示出VL-IAALK3、Flag-VH-IAALE3-Flag和組裝的Fv的MALDI-TOF分析結(jié)果。
[0028] 圖16示出通過(guò)CCK8測(cè)定法值oj jindo)分析4D5Fv抗體對(duì)BT-474增殖的影響的 結(jié)果。
[0029] 圖17示出通過(guò)FACS監(jiān)測(cè)4D5IgG、VH結(jié)構(gòu)域、VL結(jié)構(gòu)域和組裝的Fv抗體與BT-474細(xì) 胞的化r2-表達(dá)細(xì)胞表面結(jié)合特征的結(jié)果。
[0030] 圖18示出根據(jù)氨基酸殘基的長(zhǎng)度分布用于CDR設(shè)計(jì)的VhCDR3和V術(shù)DR3的選擇 方案。
[0031] 圖19示出引入Vh CDR和Vl CDR多樣性的高頻分析結(jié)果。
[0032] 圖20示出根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例而設(shè)計(jì)出具有多樣性的文庫(kù)的結(jié)果。
[003引 圖21示出通過(guò)5Vh與5V L結(jié)合構(gòu)建的25F V的SEC-HPLC分析結(jié)果。
[0034] 圖22示出通過(guò)4D5Vh與5個(gè)合成V為合制備的組裝的Fv的FACS和沈C-HPLC分 析結(jié)果。
[0035] 圖23示出文庫(kù)篩選過(guò)程。
[0036] 圖24示出通過(guò)alpha測(cè)定法篩選單個(gè)Fv和10種混合抗原的相互作用的結(jié)果。
[0037] 圖25示出將與混合抗原結(jié)合的Fv和單個(gè)抗原的相互結(jié)合進(jìn)行第二次篩選的結(jié) 果。
[003引圖26是示出主要與CSF1R結(jié)合的Fv的alpha測(cè)定法結(jié)果圖。
[0039] 圖27示出在alpha測(cè)定法中被確認(rèn)主要與CSF1R結(jié)合的Fv的相互作用的化ISA 結(jié)果。
[0040] 圖28示出在al地a測(cè)定法中被確認(rèn)主要與CSF1R結(jié)合的Fv的相互作用的Western 印跡結(jié)果。
[0041] 圖29是示出主要與C-MET結(jié)合的Fv的alpha測(cè)定法結(jié)果圖。
[00創(chuàng)圖30示出在alpha測(cè)定法中被確認(rèn)主要與CSF1R結(jié)合的Fv的相互作用的化ISA 結(jié)果。