煙草花葉病毒lamp檢測(cè)用的引物及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種煙草花葉病毒LAMP檢測(cè)用的引物，本發(fā)明還涉及一種采用上述 引物檢測(cè)煙草花葉病毒的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 煙草花葉病毒tobacco mosaic virus縮寫TMV，為RNA病毒，專門感染植物， 尤其是煙草及其他茄科植物，系Tobamovirus屬的代表種。該病毒是伊凡諾夫斯基 D. I. Iwanowski于1892年首次證明了這個(gè)TMV的存在。斯坦利W. M. Stanley于1935年首 先從煙草病葉榨汁中分離到TMV病毒狀結(jié)晶，其以了解到這個(gè)蛋白質(zhì)還含有核酸，并肯定 病原就是這個(gè)病毒。該病毒極其穩(wěn)定，因在病葉內(nèi)能大量地增殖，所以從1升病葉榨汁中可 提純2克結(jié)晶。TMV粒子長(zhǎng)300納米、直徑18納米，有一條分子量為2X IO6道爾頓的單鏈 RNA。核酸被2130個(gè)分子量為17530道爾頓的蛋白質(zhì)亞基所包裹。TMV的寄主范圍是十分 廣泛，現(xiàn)已知對(duì)22科植物中的198種植物都具有侵染性，如煙草及各種蔬菜等，是目前植物 病毒中寄生范圍最為廣泛的病毒之一。
[0003] 該病毒的致死溫度是90-93°C經(jīng)10分鐘，稀釋限點(diǎn)IO6倍，體外保毒期72-96小時(shí)。 在無菌條件下致病力達(dá)數(shù)年，在干燥病組織內(nèi)存活30年以上。而且該病毒有不同株系，我 國(guó)主要有普通株系、番茄株系、黃斑株系和珠斑等4個(gè)株系，因致病力差異及與其他病毒的 復(fù)合侵染而造成癥狀的多樣性。
[0004] TMV能在多種植物上越冬，初侵染源為帶病殘?bào)w和其它寄主植物，另外未充分腐熟 的，帶毒肥料也可引致初侵染。它主要通過汁液傳播，病健葉輕微摩擦造成微傷口，病毒即 可侵入，不從大傷口和自然孔口侵入，侵入后在薄壁細(xì)胞內(nèi)繁殖，后進(jìn)入維管束組織傳染整 株。在22- 28°C條件下，染病植株7 -14天后開始顯癥，田間通過病苗與健苗摩擦或農(nóng)事 操作進(jìn)行再侵染。另外煙田中的蝗蟲、煙青蟲等咀嚼式口器的昆蟲也可傳播。
[0005] 由于該病毒寄生范圍廣，可以侵染多種農(nóng)作物、而且極易傳播、帶病毒殘?bào)w潛伏侵 染時(shí)間又非常長(zhǎng)，給防治該病毒帶來了極大的困難，每年都會(huì)給農(nóng)作物造成無法估量的損 失，因此最經(jīng)濟(jì)有效的控制策略是對(duì)種苗就進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)TMV病毒的及時(shí)淘汰，在源頭上 把好防治病毒關(guān)。
[0006]目前植物病毒的檢測(cè)方法主要有生物學(xué)、血清學(xué)和分子生物學(xué)三種，生物學(xué)方法 就是用病毒指示植物來檢測(cè)病毒的存在與否，一般需要7-10天；血清學(xué)方法是根據(jù)抗原抗 體的特異性結(jié)合來檢測(cè)病毒，一般只需要4-6小時(shí)左右，但是它需要特異性的抗血清，而且 檢測(cè)靈敏度不高，還存在有非特異性問題；分子生物學(xué)方法主要是指PCR方法，該方法快且 準(zhǔn)確性也比較高，但是需要昂貴的檢測(cè)儀器和相關(guān)設(shè)備，而且對(duì)于像TMV這個(gè)病毒，由于其 稀釋限點(diǎn)是IO 6倍，即將病汁液稀釋到10 6倍才失去侵染力，故需要靈敏度非常高的檢測(cè)方 法才能將潛在的TMV檢測(cè)出來，以上三種方法靈敏度都難以達(dá)到，這樣必將存在漏檢的可 能，所以急需研宄新的檢測(cè)方法。
[0007]目前已有的檢測(cè)方法，其檢測(cè)步驟繁瑣，采用儀器昂貴，不能快速、方便的實(shí)現(xiàn)鑒 別魚翅真?zhèn)?。故此，現(xiàn)有鑒別魚翅真?zhèn)蔚臋z測(cè)方法有待進(jìn)一步完善。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處，提供一種煙草花葉病毒LAMP 檢測(cè)用的引物；
[0009] 本發(fā)明另一個(gè)目的是提供一種采用上述引物檢測(cè)煙草花葉病毒的方法，該方法具 有快速、檢測(cè)靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、結(jié)果直接可以判讀等特點(diǎn)。
[0010] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下方案：
[0011] 一種煙草花葉病毒LAMP檢測(cè)用的引物，其特征在于包括：
[0012] 正向外引物 F3 :5'-TTACGGAATTACTACTCCATCT-3' ；
[0013] 反向外引物 B3 :5'-GGTCTAATACTGCGTTGTACC-3' ；
[0014] 正向內(nèi)引物FIP :
[0015] 5'-TGTTTGGAACTGATTACCTAAGGCA-GTGTTCTTGTCATCAGCGT-3' ；
[0016] 其中所述正向內(nèi)引物FIP包含F(xiàn)lc和F2序列：
[0017] Flc ：TGTTTGGAACTGATTACCTAAGGCA ；
[0018] F2 ：GTGTTCTTGTCATCAGCGT ；
[0019] 反向內(nèi)引物BIP :
[0020] 5'-CTGTCGTTCAACGACAATTCAGC-ACTTTAAAGTCACTATCAGGGA-3'
[0021] 所述反向內(nèi)引物BIP包括含Blc和B2序列：
[0022] Blc ：ACTTTAAAGTCACTATCAGGGA ；
[0023] B2 ：CTGTCGTTCAACGACAATTCAGC〇
[0024] -種煙草花葉病毒LAMP檢測(cè)方法，其特征在于包括以下步驟：
[0025] A、煙草花葉病毒RNA的提取
[0026] 采用納米磁珠提取煙草花葉病毒RNA ;
[0027] B、建立LAMP反應(yīng)體系
[0028] 25 μ L的LAMP反應(yīng)體系包括20 μ L預(yù)反應(yīng)溶液和5 μ L DNA模板，其中20 μ L預(yù)反 應(yīng)溶液，由以下組分組成：
[0029] 2 X反應(yīng)緩沖液 12. 5PL 引物 0. 5-4PL 熒光目視檢測(cè)試劑 ι.ομL 酶溶液 ι.ΟμL 去離子水 補(bǔ)齊至20 PL ;
[0030] 所述引物的序列包括：
[0031] 正向外引物 F3 :5'-TTACGGAATTACTACTCCATCT-3' ；
[0032] 反向外引物 B3 :5' -GGTCTAATACTGCGTTGTACC-3 ' ；
[0033] 正向內(nèi)引物FIP :
[0034] 5'-TGTTTGGAACTGATTACCTAAGGCA-GTGTTCTTGTCATCAGCGT
[0035] -3' ；
[0036] 其中所述正向內(nèi)引物FIP包含F(xiàn)lc和F2序列：
[0037] Flc ：TGTTTGGAACTGATTACCTAAGGCA ；
[0038] F2 ：GTGTTCTTGTCATCAGCGT ；
[0039] 反向內(nèi)引物BIP :
[0040] 5'-CTGTCGTTCAACGACAATTCAGC-ACTTTAAAGTCACTATCAGGGA
[0041] -3'
[0042] 所述反向內(nèi)引物BIP包括含Blc和B2序列：
[0043] Blc ：ACTTTAAAGTCACTATCAGGGA ；
[0044] B2 ：CTGTCGTTCAACGACAATTCAGC ；
[0045] C、向Loopamp反應(yīng)試管中分別加入上述預(yù)反應(yīng)溶液各20 μ L ;
[0046] D、在預(yù)反應(yīng)溶液中加入待檢測(cè)的待檢測(cè)樣品DNA 5 μ L，使總量達(dá)到25 μ L ;
[0047] Ε、對(duì)照反應(yīng)中，陰性對(duì)照反應(yīng)使用黃瓜花葉病毒的RNA 5 μ L，空白對(duì)照反應(yīng)使用 去尚子水5 μ L，陽性對(duì)照使用煙草花葉病毒RNA5 μ L ;
[0048] F、用移液器吸排液法混合，或者合上蓋子輕擊使溶液充分混合后瞬時(shí)離心；
[0049] G、將混合物置于LAMP濁度儀的反應(yīng)孔中，于60-70 °C恒溫反應(yīng)90min，最后 60-80°C下保溫5min以結(jié)束反應(yīng)；
[0050] H、采用LAMP濁度儀方法或熒光目測(cè)的方法檢測(cè)檢驗(yàn)結(jié)果。
[0051] 如上所述的一種煙草花葉病毒LAMP檢測(cè)方法，其特征在于所述（正向外引物F3+ 反向外引物B3):(正向內(nèi)引物FIP+反向內(nèi)引物BIP)的濃度比為1:2-1:10。
[0052] 如上所述的一種煙草花葉病毒LAMP檢測(cè)方法，其特征在于所述的FIP和BIP各 1. 6 μ M，各 40pmol ;F3 和 B3 各 0· 2 μ M，各 5pmol 〇
[0053] 如上所述的一種煙草花葉病毒LAMP檢測(cè)方法，其特征在于步驟A中所述的煙草花 葉病毒RNA的提取具體步驟：
[0054] 1)制樣：取0.1 g的煙草花葉病毒感病組織加入ImL抽提緩沖液進(jìn)行研磨，得樣 品；
[0055] 2)清洗納米磁珠：取出納米磁珠到PCR管中，用ddH20反復(fù)清洗納米磁珠3次，在 磁鐵的作用下吸去ddH20 ;
[0056] 3)結(jié)合：加入100 μ L的樣品到PCR管中，用移液槍吸吐混勻樣品和納米磁珠，室 溫下吸附；
[0057] 4)清洗：在磁鐵的作用下移去上清，納米磁珠清洗3次；
[0058] 5)裂解：加入50 μ L ddH20到PCR管中，用移液槍吸吐混勻納米磁珠后，95°C， IOmin ；
[0059] 6)取樣：用磁鐵吸附納米磁珠，待PCR管內(nèi)溶液澄清后，上清即為煙草花葉病毒的 RNA0
[0060] 如上所述的一種煙草花葉病毒LAMP檢測(cè)方法，其特征在于所述的LAMP濁度儀方 法包括有實(shí)時(shí)濁度檢測(cè)和/或終點(diǎn)度檢測(cè)。
[0061] 如上所述的一種煙草花葉病毒LAMP檢測(cè)方法，其特征在于所述熒光目測(cè)的方法：
[0062] 使用紫外線照射裝置從試管底部向上進(jìn)行照射，佩戴紫外防護(hù)眼鏡從試管側(cè)面進(jìn) 行觀查；如果與陽性對(duì)照一樣發(fā)出綠光，則判定為陽性，如果與陰性對(duì)照一樣沒有發(fā)出熒 光，而判定為陰性。
[0063] 綜上所述，本發(fā)明的有益效果：
[0064] 本發(fā)明米用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增 loop - mediated isothermal amplification，簡(jiǎn)稱 LAMP是一種新的核酸檢測(cè)方法，其原理是利用4個(gè)特殊設(shè)計(jì)的引物和具有鏈置換活性的 DNA聚合酶，在恒溫條件下特異、高效、快速地?cái)U(kuò)增DNA