丁基羥基茴香醚對中央記憶性t細胞體外擴增中的應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于中央記憶性T細胞體外擴增技術領域，更具體地，涉及丁基羥基茴香 醚對中央記憶性T細胞體外擴增中的應用。
【背景技術】
[0002] 丁基羥基茴香醚(英語：Butylatedhydroxyanisole，簡稱BHA)，是一種抗氧化劑， 為兩種同分異構體2-叔丁基-4-羥基茴香醚和3-叔丁基-4-羥基茴香醚的混合物，BHA的 主要用途是在食品(包括動物食品)、食品包裝、化妝品和石油產(chǎn)品中起到抗氧化劑和防腐 劑作用。除此之外，它還被用于藥物的抗氧化，如異維甲酸、辛伐他汀等。
[0003] 由于T細胞在免疫系統(tǒng)中起著重要的作用，越來越多的研宄小組嘗試運用T細胞 的過繼治療的方式來進行腫瘤治療。中央記憶性T細胞（TCM)具有自我更新的能力，而且應 答時間短，作用時間長，對人體的副作用小。今年來，多個研宄組報道，發(fā)現(xiàn)具有記憶功能的 T細胞回輸腫瘤患者體內(nèi)以后，治療效果明顯并且持續(xù)治療時間長，可以減少患者的痛苦以 及降低細胞體外培養(yǎng)次數(shù)過多的生物安全風險。但是在人體內(nèi)相對數(shù)量較少，且由于體外 長時間培養(yǎng)的T細胞會使T細胞失去活力，絕大部分細胞分化為終末分化的效應細胞，使得 回輸體內(nèi)的T細胞存活時間過短，無法產(chǎn)生持續(xù)的殺傷腫瘤細胞的功能，因此如何在體外 獲得大量的記憶性T細胞是細胞免疫治療的一個新的研宄熱點。
[0004] 目前，國外的許多研宄小組通過構建人工抗原提呈細胞，將其應用于T細胞的體 外培養(yǎng)，提高T細胞的存活時間，用于過繼免疫治療，但要獲得足夠量的T細胞，技術要求復 雜，培養(yǎng)的成功率較低。在進行T細胞治療時，主要策略是先通過克隆擴增，得到足夠量的 具有殺傷功能的T細胞，可以與DC等提呈細胞共培養(yǎng)，也可以直接用相關腫瘤抗原刺激細 胞克隆擴增，得到具有特定腫瘤抗原特異性的T細胞。此種辦法培養(yǎng)得到的T細胞未經(jīng)過 任何轉(zhuǎn)基因修飾，安全性較高。但這種腫瘤高反應性的細胞需要擴增至臨床需要的l〇9_l〇n 治療劑量的數(shù)量數(shù)，過程持續(xù)時間比較長，對于腫瘤患者來說時間也是一個需要更多考慮 的因素。而且體外培養(yǎng)的時間長，細胞容易變老，活力下降，多為終末分化的細胞，在體外有 較好的效果，但是在體內(nèi)存活時間較短，治療效果受影響。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術問題是克服現(xiàn)有中央記憶性T細胞體外擴增技術的不足，提 供丁基羥基茴香醚對中央記憶性T細胞體外擴增中的應用。
[0006] 本發(fā)明上述目的通過以下技術方案實現(xiàn)： 本發(fā)明提供了丁基羥基茴香醚對中央記憶性T細胞在體外擴增上的應用。
[0007] 優(yōu)選地，所述丁基羥基茴香醚的濃度為5~40uM。
[0008] 更優(yōu)選地，所述丁基羥基茴香醚的濃度為20uM。
[0009] 優(yōu)選地，所述中央記憶性T細胞為⑶4+T細胞。
[0010] 優(yōu)選地，所述中央記憶性T細胞的提取方法是先將外周成分血與含2%BSA和0. 5% EDTA的PBS按1:4混合均勻；然后將稀釋后的血液緩慢加入淋巴細胞分離液的上方，二者 的比例為1:1 ;離心300Xg30min;小心吸取單核細胞，置入另一離心管中，加入5倍體積 的含0. 5%BSA和2%EDTA的PBS稀釋，混合均勻后，300Xg15min;重復上一步驟一次； 孵育CD4+T細胞陰選一抗，15min;用10倍體積的含0. 5%BSA和2%EDTA的PBS稀釋， 混合均勾后，300Xg12min;孵育帶有磁珠的二抗，30min;過柱進行細胞分選，得到⑶4+ T細胞。
[0011] 優(yōu)選地，所述中央記憶性T細胞的培養(yǎng)方法是在5%C02、飽和濕度及37°C條件下 將5X105個/孔的⑶4 +T細胞置于1mL含10%胎牛血清的RPMI1640中培養(yǎng)。
[0012] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點及有益效果： 本發(fā)明首次公開了丁基羥基茴香醚在體外T細胞培養(yǎng)中的應用，方法安全有效，成本 低廉，為過繼免疫治療的廣泛開展提供了良好的技術支持。
【附圖說明】
[0013] 圖1為BHA濃度為20uM時對⑶4+T細胞中⑶4+TCM所占比例的檢測。
[0014] 圖2為不同濃度的BHA對中央記憶性⑶4+T細胞的比例擴增效果。
【具體實施方式】
[0015] 以下結合具體實施例來進一步說明本發(fā)明，但實施例并不對本發(fā)明做任何形式的 限定。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設備為本技術領域常規(guī)試劑、方法和設備。
[0016] 除非特別說明，本發(fā)明所用試劑和材料均為市購。
[0017] 實施例1 1、 試驗材料準備 人的外周成分血由廣州市血液中心提供，試驗中隨機選取了 24份正常人的血液樣本。
[0018] 主要試劑：胎牛血清購自于GIBCO公司；RPMI1640培養(yǎng)基購自于INVERTROGEN 公司；BHA購自于INVERTROGEN公司；流式細胞儀檢測抗體anti-CD45RA-TexasRed、 anti-CCR7-AF700\anti-CD62L-PE-cy7購自于BD公司；淋巴細胞分離液購自于天津灝陽 生物制品有限責任公司；CD4+T細胞陰性選擇磁珠購自于BD公司。
[0019] 主要的實驗儀器：臺式高速離心機（EppendorfCentrifuge5810R)、流式細胞 儀（BeckmanCoulter公司）、（1)2細胞培養(yǎng)箱（ThermoSCIENTIFIC)、生物安全柜（Thermo SCIENTIFIC)、倒置生物顯微鏡（Leica)、磁珠分選磁力架（BDPharmigen)。
[0020] 細胞培養(yǎng) 2. 1細胞提取分離 將外周成分血與PBS緩沖液(含2%BSA、0. 5%EDTA)按1:4混合均勻；然后將稀釋后 的血液緩慢加入淋巴細胞分離液的上方，二者的比例為1:1 ;離心300Xg30min;小心吸 取單核細胞，置入另一離心管中，加入5倍體積的PBS(含0.5%BSA、2%EDTA)稀釋，混合均 勻后，300Xg15min;重復上一步驟一次；孵育⑶4+T細胞陰選一抗，15min;10倍體積 的PBS(含0.5%BSA、2%EDTA)稀釋，混合均勻后，300Xg12min;孵育帶有磁珠的二抗，30 min;過柱進行細胞分選，得到⑶4+T細胞，加入含10%胎牛血清的RPMI1640重懸細胞，計 數(shù)細胞后調(diào)整細胞至所需濃度。
[0021] 2. 2培養(yǎng)條件 在5%C02、飽和濕度及37°C下，將5X105個/孔的CD4 +T細胞置于1mL含10%胎牛 血清的RPMI1640中培養(yǎng)。
[0022] 細胞鋪板及加藥處理 3. 1鋪板 將分選出來的CD4+T細胞鋪在12孔板中，按照實驗設計，每孔預期的細胞數(shù)為5 X 105。
[0023] 3. 2加藥處理 對鋪板后的CD4+T細胞進行5種不同的處理，每種處理設置三個復孔作為平行對照，并 在細胞培養(yǎng)的第4天，第7天，第10天，第13天施加相應刺激。
【主權項】
1. 丁基羥基茴香醚對中央記憶性T細胞在體外擴增上的應用。
2. 根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于，所述丁基羥基茴香醚的濃度為5~40uM。
3. 根據(jù)權利要求2所述的應用，其特征在于，所述丁基羥基茴香醚的濃度為20uM。
4. 根據(jù)權利要求1至3任意一項所述的應用，其特征在于，所述中央記憶性T細胞為 CD4+ T細胞。
5. 根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于，所述中央記憶性T細胞的提取方法是先將 外周成分血與含2% BSA和0. 5% EDTA的PBS按1:4混合均勻；然后將稀釋后的血液緩慢加 入淋巴細胞分離液的上方，二者的比例為1:1 ;離心300 Xg 30 min ;小心吸取單核細胞，置 入另一離心管中，加入5倍體積的含0.5% BSA和2% EDTA的PBS稀釋，混合均勻后，300Xg 15 min ;重復上一步驟一次；孵育⑶4+ T細胞陰選一抗，15 min ;用10倍體積的含0. 5% BSA 和2% EDTA的PBS稀釋，混合均勻后，300 Xg 12 min;孵育帶有磁珠的二抗，30 min;過柱 進行細胞分選，得到⑶4+ T細胞。
6. 根據(jù)權利要求1所述的BHA對中央記憶性T細胞在體外擴增上的應用，其特征在于， 所述中央記憶性T細胞的培養(yǎng)方法是在5% CO2、飽和濕度及37°C條件下將5 X IO5個/孔的 ⑶4+ T細胞置于I mL含10%胎牛血清的RPMI1640中培養(yǎng)。
【專利摘要】本發(fā)明提供了丁基羥基茴香醚對中央記憶性T細胞在體外擴增上的應用，所述丁基羥基茴香醚的濃度為5~40uM，最適濃度為20uM，所述中央記憶性T細胞為CD4+T細胞。本發(fā)明中首次公開了丁基羥基茴香醚在體外T細胞培養(yǎng)中的應用，方法安全有效，成本低廉，為過繼免疫治療的廣泛開展提供了良好的技術支持。
【IPC分類】C12N5-0783
【公開號】CN104830769
【申請?zhí)枴緾N201510228515
【發(fā)明人】張輝, 張譯文
【申請人】中山大學
【公開日】2015年8月12日
【申請日】2015年5月7日