用于乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的Long-range PCR檢測的引物組、方法及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種PCR擴增方法，尤其涉及一種用于乳腺癌易 感基因BRCA1和BRCA2的Long-range PCR檢測的引物組、方法及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 乳腺癌是一種嚴(yán)重威脅女性健康的惡性腫瘤，其死亡率僅次于肺癌而位居第二 位。BRCA(breast cancer susceptibility gene)是遺傳性乳腺癌和卵巢癌的易感基因，其 與乳腺癌密切相關(guān)。自BRCA1和BRCA2基因成功地定位、分離后，國內(nèi)外學(xué)者對其進行了廣 泛、深入的研宄。在我國的許多大中城市，乳腺癌已占婦女惡性腫瘤死因的首位，嚴(yán)重威脅 著女性健康。
[0003] 早診斷早發(fā)現(xiàn)，乳腺癌病情的治愈還是相當(dāng)樂觀的。在第IV期得到診斷的乳腺癌 患者只有20%能夠存活到5年之后，而在第I期就診的患者100%活到5年之后。因此乳腺 癌的早期診斷是目前亟待解決的問題。
[0004] BRCA1和BRCA2為乳腺癌遺傳性主要的風(fēng)險因子。二者都是抑癌基因，均呈常染色 體顯性遺傳，且容易引發(fā)早年發(fā)病。BRCA1基因定位于17q21，編碼BRCA1蛋白含1863個氨 基酸，在維持細(xì)胞正常增殖、分化中發(fā)揮重要作用，并參與DNA損傷修復(fù)功能，是第一個被 證實和克隆的BRCA。BRCA1基因突變會引發(fā)DNA修復(fù)功能障礙，使細(xì)胞代謝和增殖紊亂，促 進細(xì)胞惡變和腫瘤發(fā)生。
[0005] BRCA2基因位于13ql2,編碼BRCA2蛋白含3418個氨基酸，對細(xì)胞生長的調(diào)節(jié)有重 要作用。BRCA2變異范圍達(dá)整個基因的編碼區(qū)，目前尚未發(fā)現(xiàn)非編碼區(qū)的變異。BRCA2基因 發(fā)生突變后表達(dá)的蛋白質(zhì)失去了修復(fù)DNA損傷的功能，導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定，促進腫瘤發(fā)生。 總之，BRCA1和BRCA2突變、功能缺失，造成基因不穩(wěn)定，逃避集體防御體系監(jiān)視，使細(xì)胞非 控制性增殖，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[1]。
[0006] 有研宄表明，有5%~10%的乳腺癌和10%~15%的卵巢癌是由BRCA1/2突變引起的， 而在乳腺癌和卵巢癌高發(fā)家族中80%的患者BRCA1/2基因存在突變。與正常女性相比，攜 帶BRCA1或BRCA2基因突變的女性，患乳腺癌或卵巢癌的風(fēng)險高5-20倍，一生中可能有 45%-65%的概率患乳腺癌，11%-40%的概率患卵巢癌，且易早年發(fā)病[2, 3]。 據(jù)報道，乳腺癌的BRCA1和BRCA2基因檢測方法有很多，Ozcelik H等曾利用 Long-range PCR擴增BRCA1和BRCA2兩個基因全基因，設(shè)計17對引物，采用invitrogen公 司的SequalPrep Long PCR體系擴增，由于擴增片段長度太長，引物設(shè)計區(qū)域不恰當(dāng)，導(dǎo)致 出現(xiàn)擴增產(chǎn)物中非特異帶型較多，干擾BRCA1和BRCA2目標(biāo)區(qū)域富集[4]。利用多重PCR技 術(shù)將BRCA1和BRCA2外顯子區(qū)域擴增富集，需設(shè)計200多對引物分到不同PCR體系中。同 樣擴增片段、引物設(shè)計、退火溫度和延伸時間優(yōu)化不恰當(dāng)，會導(dǎo)致非特異性條帶的增多，可 能有10幾對引物混合在一個反應(yīng)中，經(jīng)常會導(dǎo)致交互配對或增加錯配產(chǎn)物，影響目標(biāo)區(qū)域 擴增效率及產(chǎn)物量。
[0007] 因此本領(lǐng)域迫切需要建立新的乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2檢測技術(shù)，而通過 對樣本的BRCA1和BRCA2的Long-range PCR擴增，可更全面準(zhǔn)確的評估患乳腺癌的風(fēng)險。 能夠早期客觀、靈敏和穩(wěn)定的檢測BRCA1和BRCA2基因突變，以便進行及時、有針對性的治 療或預(yù)防乳腺癌，降低醫(yī)療成本，節(jié)約社會資源。
[0008] 參考文獻：
[1]登云特，王國平.乳腺癌易感基因BRCA1/2的研宄進展[J/CN].中國乳腺病雜志： 電子版，2013,7(5):374-378.
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[3] Antoniou A, Pharoah P D, Narod S, et al: Average risks of breast and ovarian cancer associated with BRCA1 or BRCA2 mutations detected in case series unselected for family history: A combined analysis of 22 studies. Am J Hum Genet, 2003,72:1117-1130.
[4] Ozcelik H, Shi X, Chang MC, et al. Long-range PCR and next-generation sequencing of BRCA1 and BRCA2 in breast cancer. J Mol Diagn. 2012;14:467 - 475。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的首要目的是提供用于乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的Long-range PCR 檢測的引物組，以及提供一種用于乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的Long-range PCR檢測 的方法和試劑盒，以優(yōu)化的Long-range PCR方法代替其他PCR方法進行檢測分析。
[0010] 為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下： 一種用于乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的Long-range PCR檢測的引物組，包括用于 特異性擴增乳腺癌易感基因BRCA1的10個引物對和用于特異性擴增乳腺癌易感基因BRCA2 的8個引物對，其中，用于特異性擴增乳腺癌易感基因BRCA1的10個引物對中包含以下3 個引物對： (1) 引物對1 : 正向引物BR1_P6. 1F :5' -ACGTTGCGGAGAGGTGAG-3' 反向引物BR1_P6. 1R:5' -TAGCCAGGCATAGTTGCACA -3' (2) 引物對2 : 正向引物BR1_P6. 2F :5' - CTCCACCTCCCTGGTTCAGT -3' 反向引物BR1_P6.2R:5' - AGCITTGTGGTGAGGTGITG -3' (3) 引物對3 : 正向引物BR1_P7F:5' - GGCTCAAAGGACCTCCTACC -3' 反向引物BR1_P7R:5' - AGGCAGAGGAACCTCTTGAA -3'。
[0011]本發(fā)明的另一種目的是提供一種用于乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的 Long-range PCR檢測的方法，包括以下步驟： A. 利用TIANamp Genomic DNA Kit血液/細(xì)胞/組織DNA提取試劑盒（DP304)對采集 的樣本進行DNA提??； B. 利用總共18個引物對分別進行目標(biāo)序列的Long-range PCR擴增，其中BRCA1需要 10個引物對進行10個片段的擴增，所述10個引物對中包含下述3個引物對： (1) 引物對1 : 正向引物 BR1_P6. 1F :5' -ACGTTGCGGAGAGGTGAG-3' 反向引物 BR1_P6. 1R:5' -TAGCCAGGCATAGTTGCACA -3' (2) 引物對2 : 正向引物 BR1_P6. 2F :5' - CTCCACCTCCCTGGTTCAGT -3' 反向引物 BR1_P6.2R:5' - AGCITTGTGGTGAGGTGITG -3' (3) 引物對3 : 正向引物 BR1_P7F:5' - GGCTCAAAGGACCTCCTACC -3' 反向引物 BR1_P7R:5' - AGGCAGAGGAACCTCTTGAA -3'， BRCA2需要8個引物對進行8個片段的擴增； C. QIAquick Gel Extraction Kit 回收純化擴增產(chǎn)物，Invitrogen Qubit2.0測定PCR 產(chǎn)物濃度； D. 將純化后的擴增子等摩爾混合； E. 以lug混合后的擴增子進行小片段文庫構(gòu)建； F?對測序文庫進行 2100 Bioanalyzer(Agilent)/LabChip GX(Caliper)及 QPCR 檢 測，利用Illumina HiSeq? 2500對文庫進行測序。
[0012] 進一步的，所述的Long-range PCR擴增體系如下： SequalPr印10X反應(yīng)緩沖液(包括Mg 2+和dNTPs) 2ul SequalPr印 PCR 增強劑 2ul 二甲基亞砜DMSO 0. 4ul 引物對（2. 5umol/L) lul SequalPrep Long 聚合酶 0? 25ul DNA 模板 50ng ddH20 加至 20ul。