靶向肝癌細(xì)胞的細(xì)胞制備物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及免疫學(xué)領(lǐng)域，并具體涉及特異性識(shí)別肝癌細(xì)胞的細(xì)胞制備物、其制備 方法及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，人們將抗體對(duì)抗原的高特異性和T細(xì)胞對(duì)靶 細(xì)胞的細(xì)胞毒殺傷作用結(jié)合起來，構(gòu)建了能夠特異性識(shí)別抗原并活化T細(xì)胞的嵌合型抗 原受體（chimericantigenreceptor,CAR)。CAR主要包括抗原特異性抗體單鏈可變區(qū) (scFv)、間隔序列（spacer)、跨膜區(qū)（TMDomain)和T細(xì)胞活化基序。根據(jù)T細(xì)胞活化基序 的組成，CAR經(jīng)歷了三代的變革。最初第一代CAR僅含有1個(gè)胞內(nèi)的信號(hào)分子（FceRIY或 CD3 但人們用第一代CAR轉(zhuǎn)染T細(xì)胞并不能有效地活化T細(xì)胞，反而引起T細(xì)胞的失能 和凋亡。T細(xì)胞的完全活化需要CD3和CD28雙信號(hào)刺激，但有些腫瘤細(xì)胞不表達(dá)或低表達(dá) 共刺激分子如B7分子，人們發(fā)現(xiàn)在第一代CAR的基礎(chǔ)上，在胞內(nèi)區(qū)進(jìn)一步加入共刺激信號(hào) 分子（CD28活化區(qū)等），可顯著增強(qiáng)細(xì)胞因子（如IL-2、IFN-y和顆粒酶）的分泌和抗腫瘤 能力，這是第二代CAR，其中，共刺激信號(hào)分子還可以是41BB、IC0S、0X40等。在第二代CAR 的基礎(chǔ)上，發(fā)展出第三代CAR，其胞內(nèi)區(qū)包含三種信號(hào)分子。CAR修飾的T淋巴細(xì)胞可通過 scFv特異性識(shí)別腫瘤抗原或病毒，將T細(xì)胞活化信號(hào)傳遞到T細(xì)胞內(nèi)，激活T細(xì)胞靶向殺傷 腫瘤或病毒。
[0003]CAR修飾的T細(xì)胞（CAR-T)可用于治療相關(guān)腫瘤，通過對(duì)患者自體的T細(xì)胞的修 飾，使T細(xì)胞活化，分泌殺傷性物質(zhì)，殺傷腫瘤。因此，CAR-T淋巴細(xì)胞具有很好的腫瘤靶 向性，并且無主要組織相容性復(fù)合體（MHC)的限制。此外，CAR-T是對(duì)患者自體的T細(xì)胞進(jìn) 行改造，并且CAR的整個(gè)分子骨架是人源的，故能夠避免機(jī)體對(duì)CAR-T細(xì)胞的排斥反應(yīng)，使 CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)可長(zhǎng)時(shí)間存活。
[0004] 目前對(duì)于腫瘤過繼性細(xì)胞免疫治療主要包括CIK細(xì)胞，DC-CIK細(xì)胞等，但由于 CIK具有廣譜殺傷作用，可對(duì)自身組織造成損傷，這限制了其在臨床的應(yīng)用。另外，制備 DC-CIK的效率有待進(jìn)一步提高，從外周血中獲取CIK的數(shù)量有限，并且成本較高，大大限制 了DC-CIK的臨床應(yīng)用性。
[0005] HBV感染與原發(fā)性肝癌發(fā)生密切相關(guān)，據(jù)統(tǒng)計(jì)約70%以上的肝癌患者HBsAg陽性。 肝癌局部抗腫瘤免疫的效應(yīng)細(xì)胞主要是CTL和輔助性T細(xì)胞，肝癌細(xì)胞可通過抗原遞呈途 徑將HBsAg降解為肽段，呈遞到⑶8細(xì)胞表面，激活⑶8淋巴細(xì)胞。但由于腫瘤細(xì)胞低表達(dá) MHC分子和共刺激分子，不能有效呈遞抗原肽和活化CTL，因此，肝癌局部處于免疫低下狀 態(tài)，免疫系統(tǒng)不能有效清除肝癌細(xì)胞。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供分離的多核苷酸，其包含編碼一多肽的核苷酸序列，所述多肽包含識(shí) 別乙型肝炎病毒表面抗原的結(jié)構(gòu)域、間隔區(qū)、跨膜結(jié)構(gòu)域和T細(xì)胞活化結(jié)構(gòu)域。
[0007] 在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，所述識(shí)別乙型肝炎病毒表面抗原的結(jié)構(gòu)域是乙型肝 炎病毒表面抗原特異性抗體單鏈可變區(qū)。例如，所述單鏈可變區(qū)包含重鏈可變區(qū)、連接區(qū)和 輕鏈可變區(qū)。
[0008] 更加優(yōu)選地，所述重鏈可變區(qū)包含如SEQIDN0. 47所示的氨基酸序列；連接區(qū)包 含如SEQIDN0. 49所示的氨基酸序列；輕鏈可變區(qū)包含如SEQIDN0. 48所示的氨基酸序 列。
[0009] 在本發(fā)明的一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，所述間隔區(qū)包含如SEQIDN0. 50所示的氨基酸 序列。
[0010] 在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，所述跨膜結(jié)構(gòu)域?yàn)镃D28的跨膜結(jié)構(gòu)域。
[0011] 在本發(fā)明的多核苷酸中，所述T細(xì)胞活化結(jié)構(gòu)域包含至少一個(gè)T細(xì)胞活化基序。
[0012] 優(yōu)選地，所述T細(xì)胞活化結(jié)構(gòu)域包含兩個(gè)T細(xì)胞活化基序。
[0013] 更優(yōu)選地，所述T細(xì)胞活化結(jié)構(gòu)域包含三個(gè)T細(xì)胞活化基序。
[0014] 優(yōu)選地，所述T細(xì)胞活化基序選自⑶137、⑶28和⑶3G的活化基序。
[0015] 本發(fā)明還提供真核表達(dá)載體，其包含上述本發(fā)明的多核苷酸。
[0016] 本發(fā)明還提供制備包含靶向肝癌細(xì)胞的T細(xì)胞的細(xì)胞制備物的方法，其包含以下 步驟：以上述本發(fā)明的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化分離的外周血單個(gè)核細(xì)胞。
[0017] 在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包括從轉(zhuǎn)化的外周血單個(gè)核細(xì)胞中 分離⑶8+T細(xì)胞。
[0018] 在本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包括體外擴(kuò)增所述細(xì)胞。
[0019] 本發(fā)明還提供包含靶向肝癌細(xì)胞的T細(xì)胞的細(xì)胞制備物，其根據(jù)上述本發(fā)明的方 法而制備。
[0020] 本發(fā)明還提供靶向肝癌細(xì)胞的CD8+T細(xì)胞，所述CD8+T細(xì)胞包含上述本發(fā)明的多核 苷酸，且所述CD8+T細(xì)胞能夠表達(dá)由所述多核苷酸編碼的多肽。
[0021] 本發(fā)明還涉及上述本發(fā)明的細(xì)胞制備物和細(xì)胞在制備用于治療肝癌的藥物組合 物中的應(yīng)用。
【附圖說明】
[0022] 圖1 :HBsAg特異性抗體單鏈可變區(qū)的克隆和MGT軟件分析。
[0023] 圖中A是重鏈可變區(qū)VH和輕鏈可變區(qū)VL的PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果；B是根據(jù)VH和 VL的PCR產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果翻譯的氨基酸序列與已知的其它抗體的重鏈和輕鏈的氨基酸序 列進(jìn)行同源性比對(duì)的結(jié)果。
[0024] 圖2:編碼HBsAg特異性嵌合型抗原受體的DNA的重組。
[0025] 圖中A是融合的DNA的組成結(jié)構(gòu)示意圖，B是構(gòu)建完成的DNA的電泳圖。
[0026] 圖3 :HBsAg特異性嵌合型抗原受體的表達(dá)和定位。
[0027] 圖中A是對(duì)分離的膜蛋白進(jìn)行Westernblot分析的結(jié)果；B是表達(dá)CAR-Flag融 合蛋白的293T細(xì)胞的共聚焦顯微鏡觀察的結(jié)果。
[0028]圖 4 :pLenti6. 3_MCS-IRES2_EGFP慢病毒載體圖譜。
[0029]圖5 :共聚焦顯微鏡觀察HBsAg特異性嵌合型抗原受體慢病毒載體的表達(dá)和定位。
[0030] 圖6 :HBsAg特異性嵌合型抗原受體慢病毒感染PBMC的效率以流式細(xì)胞儀檢測(cè)的 結(jié)果。
[0031] 圖7:ELISA檢測(cè)HBsAg特異性嵌合型抗原受體慢病毒感染的PBMC與肝癌細(xì)胞系 共培養(yǎng)后，分泌IFN-Y的結(jié)果，其中縱坐標(biāo)軸為細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-Y的濃度。
[0032] 圖中CAR組代表以HBsAg特異性嵌合型抗原受體慢病毒感染的PBMC，Negative組 代表未改造的慢病毒感染的PBMC。
[0033] 圖8 :HBsAg特異性嵌合型抗原受體慢病毒感染的PBMC對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響。
[0034] 圖中E:T表示PBMC與HeP3B肝癌細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)的比；CFSELow(%)表示CFSE低 標(biāo)記的的細(xì)胞所占的比例；CAR表示HBsAg特異性嵌合型抗原受體慢病毒感染的PBMC組； Negative表示未改造的慢病毒感染的PBMC組。
[0035] 發(fā)明詳述
[0036] 嵌合型抗原受體（CAR)又稱人工T細(xì)胞受體、嵌合型T細(xì)胞受體、嵌合型免疫受 體，是一種人工設(shè)計(jì)的受體，可以賦予免疫效應(yīng)細(xì)胞某一種特異性。普遍來講，這一技術(shù)被 用于賦予T細(xì)胞特異性識(shí)別腫瘤表面抗原的特性。通過這種方法，可以產(chǎn)生大量的靶向殺 傷腫瘤細(xì)胞。
[0037]HBsAg是HBV病毒的表面抗原，靶向