一種l-色氨酸的提取新工藝的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及L-色氨酸生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種L-色氨酸 的提取新工藝。
【背景技術(shù)】
[0002]L-色氨酸的分子式為CnH1202N 2,分子量為204. 21，含氮13. 72%。L-色氨酸是含 有吲哚基的中性芳香族氨基酸，呈絹絲光澤、六角片狀自色晶體，無臭，有甜味，水中溶解度 1. 14g/L(25°C )溶于稀酸或稀堿，在堿液中較穩(wěn)定，強(qiáng)酸中分解，微溶于乙醇，不溶于氯仿、 乙醚。
[0003]L-色氨酸是人體和動(dòng)物生命活動(dòng)中八種必需的氨基酸之一，對(duì)人和動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā) 育、新陳代謝起著重要的作用，被稱為第二必需氨基酸，它是繼蛋氨酸和賴氨酸之后的第三 大飼料添加氨基酸，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和飼料行業(yè)。
[0004]近年來，隨著國(guó)內(nèi)飼料工業(yè)的發(fā)展和L-色氨酸及其代謝產(chǎn)物研究的深入，尤其是 隨著我國(guó)老齡化程度不斷加重，L-色氨酸在醫(yī)藥行業(yè)上的用途也不斷擴(kuò)大。目前，L-色氨 酸逐漸成為一種國(guó)際市場(chǎng)發(fā)展?jié)摿薮?、?guó)內(nèi)市場(chǎng)需求較大的產(chǎn)品。
[0005]目前，L-色氨酸的生產(chǎn)方法主要有4種：（1)蛋白質(zhì)水解法：主要從含有相對(duì)豐富 的L-色氨酸的廢蠶絲、毛發(fā)和血粉等蛋白質(zhì)原料通過酶水解或堿水解法來提取L-色氨酸。 蛋白質(zhì)水解法工藝復(fù)雜，生產(chǎn)周期長(zhǎng)，產(chǎn)品成分復(fù)雜，現(xiàn)在使用較少。（2)化學(xué)合成法：化學(xué) 合成主要以苯阱為原料或者以吲哚為原料合成，合成之后為DL-色氨酸，在經(jīng)過拆分得到 L-色氨酸。這種方法原料成本高，工藝復(fù)雜，工業(yè)推廣差。（3)酶促轉(zhuǎn)換法：利用微生物產(chǎn) 生的L-色氨酸合成酶系轉(zhuǎn)化前體合成L-色氨酸的方法。此法L-色氨酸合成酶受吲哚影 響較嚴(yán)重，底物L(fēng)-絲氨酸價(jià)格較高，吲哚水溶性較差，轉(zhuǎn)化率不高。（4)發(fā)酵法：是指利用 L-色氨酸高產(chǎn)菌種，采用葡萄糖等廉價(jià)碳源做原料，控制合適的發(fā)酵條件，從而獲得L-色 氨酸產(chǎn)品的一種方法。發(fā)酵法已經(jīng)成為當(dāng)前工業(yè)生產(chǎn)L-色氨酸的重要方法。
[0006] 從發(fā)酵液中提取L-色氨酸是發(fā)酵法生產(chǎn)L-色氨酸的關(guān)鍵工序，現(xiàn)有的提取工藝 主要存在以下三個(gè)方面的問題。第一方面：傳統(tǒng)的提取工藝主要采用粗品制備精品，在制備 過程中需要兩次結(jié)晶，耗費(fèi)大量的試劑，并需要增加工序去除這些試劑；這不僅增加了工藝 的復(fù)雜性和工作量，還會(huì)造成不必要的生產(chǎn)浪費(fèi)。第二方面：采用活性炭對(duì)L-色氨酸進(jìn)行 脫色，產(chǎn)生大量的廢水和活性炭廢料。第三方面：菌株產(chǎn)氨基酸效率低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是，克服了現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足之處，提供了一種 L-色氨酸的提取新工藝，該工藝操作簡(jiǎn)單，產(chǎn)率和純度高，能夠?qū)崿F(xiàn)廢物利用，并且合理配 伍菌株，大大提高了發(fā)酵效率，可大規(guī)模推廣使用。
[0008]本發(fā)明的目的是通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0009] 一種L-色氨酸的提取新工藝，其包括如下步驟：
[0010] 步驟1):將大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌分別培養(yǎng)至濃度為1 x 108個(gè)/mL的菌液，按 照2 : 1的體積比混合得到混合菌液，然后按照2%接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng) 30小時(shí)，得到L-色氨酸發(fā)酵液；
[0011] 步驟2):將L-色氨酸發(fā)酵液送入提取儲(chǔ)料罐，加熱至60°C，用鹽酸調(diào)節(jié)調(diào)pH值為 4,經(jīng)微濾膜過濾得到截留物和濾過液；
[0012] 步驟3):步驟2)所得濾過液經(jīng)過三柱串聯(lián)離子交換柱，得到L-色氨酸高濃液；然 后用鹽酸調(diào)節(jié)L-色氨酸高濃液的pH值為3,最后進(jìn)行超濾膜過濾得到色氨酸超濾液和含有 色素及蛋白的濃縮液；
[0013] 步驟4):將步驟3)所得色氨酸超濾液利用反滲透膜脫水濃縮，得到純水和L-色 氨酸料液；將上述L-色氨酸料液打入雙效低溫濃縮鍋濃縮得到L-色氨酸濃縮液；
[0014] 步驟5):將步驟4)所得L-色氨酸濃縮液打入低溫密閉結(jié)晶罐中結(jié)晶，分別收集 上清液和沉淀，最后對(duì)沉淀進(jìn)行干燥得到L-色氨酸產(chǎn)品；
[0015] 步驟6)將步驟2)所得截留物、步驟3)所得含有色素及蛋白的濃縮液以及步 驟5)所得上清液合并得到廢棄料液，然后往廢棄料液中添加豆柏、酒糟、水稻秸桿粉 以及麥麩，2000rpm攪拌lOmin，通入蒸汽升溫至100°C，蒸饋30分鐘；然后將蒸饋物烘 干，粉碎機(jī)粉碎制得飼料；其中，廢棄料液、豆柏、酒糟、水稻秸桿粉以及麥麩的質(zhì)量比為 100 : 4 : 3 : 2 : 1。
[0016] 優(yōu)選地，
[0017] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組分為：葡萄糖20g/L、酵母粉12g/L、硫酸鎂2. 5g/L、硫酸銨 2g/L、梓檬酸2. 5g/L、磷酸氫二鉀9g/L、硫酸亞鐵76mg/L、硫酸猛5mg/L、硫酸鈉20mg/L、硫 酸鋅7mg/L、氯化鈷6mg/L、硫酸銅0? 9mg/L。
[0018] 所述微濾膜截留分子量為2000Da，微濾溫度為30°C，工作壓力：進(jìn)壓為3bar，出壓 為lbar。所述超濾膜器采用聚酰胺管式膜分離系統(tǒng)，截留分子量為600-1000KDa，操作溫度 5〇°C，壓力為 0? 25Mpa。
[0019] 所述反滲透膜為聚酰胺復(fù)合膜。
[0020] 本發(fā)明的技術(shù)方案具有以下突出優(yōu)點(diǎn)及獨(dú)特性：
[0021] 本發(fā)明在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上，通過大量試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采用兩種菌液按照一定比例混 合，各菌株之間具備一定的協(xié)同作用，比常規(guī)的單一菌株發(fā)酵方法，能夠大大提高色氨酸的 發(fā)酵產(chǎn)量。本發(fā)明采用三柱串聯(lián)離交柱提取L-色氨酸，其生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)潔，便于操作和維護(hù)， 占地面積少，可連續(xù)工業(yè)化生產(chǎn)。
[0022] 本發(fā)明采用超濾脫色技術(shù)，脫色過程簡(jiǎn)單，脫色效果明顯；與傳統(tǒng)活性炭脫色所產(chǎn) 生大量工業(yè)廢水和活性炭廢料相比，減輕廢水處理負(fù)擔(dān)，節(jié)省了工業(yè)成本。
[0023] 本發(fā)明在提取色氨酸過程中，對(duì)菌體蛋白、大分子多糖等進(jìn)行回收利用，幾乎無廢 水外排，避免此類物質(zhì)的廢液對(duì)環(huán)境造成的污染，綠色環(huán)保；而且獲得了營(yíng)養(yǎng)豐富的菌體蛋 白飼料，變廢為寶，增加經(jīng)濟(jì)效益。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 為了使本技術(shù)領(lǐng)域的人員更好地理解本申請(qǐng)中的技術(shù)方案，下面將結(jié)合本申請(qǐng)具 體實(shí)施例，對(duì)本申請(qǐng)的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。
[0025] 實(shí)施例1
[0026] -種L-色氨酸的提取新工藝，其包括如下步驟：
[0027]步驟 1):將大腸桿菌（Escherichia coli)ATCC 27325 (可參見 Appl. Environ. Microbiol. October 1994vol. 60no. 10, 3724-3731)和谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032 (Journal of Biotechnology, V104,September 2003,Pages5-25) 分別培養(yǎng)至濃度為1X108個(gè)/mL的菌液，按照2 : 1的體積比混合得到混合菌液，然后按照 2% (v/v)接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基（葡萄糖20g/L、酵母粉12g/L、硫酸鎂2. 5g/L、硫酸銨 2g/L、梓檬酸2. 5g/L、磷酸氫二鉀9g/L、硫酸亞鐵76mg/L、硫酸猛5mg/L、硫酸鈉20mg/L、硫 酸鋅7mg/L、氯化鈷6mg/L、硫酸銅0? 9mg/L)中，溫度37°C，溶氧控制20%，罐壓0? 05MPa， PH7. 0,當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖耗完后，進(jìn)入補(bǔ)糖生產(chǎn)L-色氨酸階段，流加葡萄糖液濃度為 600g/L，液氨調(diào)節(jié)pH控制在7. 0,色氨酸濃度可以達(dá)到50g/L，葡萄糖轉(zhuǎn)化率為18. 8%。待 色氨酸生成速率明顯下降，殘?zhí)菨舛壬仙秊?. 〇g/L時(shí)，結(jié)束發(fā)酵；整個(gè)發(fā)酵過程時(shí)間為30 小時(shí)；
[0028] 本發(fā)明采用菌株組合，配伍合理，大大提高了色氨酸葡萄糖轉(zhuǎn)化率和縮短發(fā)酵時(shí) 間，有利于工業(yè)化；色氨酸含量采用HPLC方法測(cè)定，具體參照2007版英國(guó)藥典（Ph Eur monograph 1272);同時(shí)在其他條件不變的前提下，檢測(cè)了單一大腸桿菌發(fā)酵色氨酸濃度， 僅為33g/L，葡萄糖轉(zhuǎn)化率為17. 1%。
[0029] 步驟2):將L-色氨酸發(fā)酵液送入提取儲(chǔ)料罐，加熱至60°C，用鹽酸調(diào)節(jié)調(diào)pH值 為4,經(jīng)微濾膜過濾得到截留物和濾過液；所述微濾膜截留分子量為2000Da，微濾溫度為 30°C，工作壓力：進(jìn)壓為3bar，出壓為lbar;
[0030] 步驟3):步驟2)濾過液進(jìn)入三柱串聯(lián)離交柱，柱中填充陽離子交換樹脂柱 (001 X 7)，吸附溫度為30°C，得到L-色氨酸高濃液；然后用鹽酸調(diào)節(jié)上述L-色氨酸高濃液 的pH值為3,超濾膜過濾得到色氨酸超濾液和含有色素及蛋白的濃縮液；所述超濾膜器采 用聚酰胺管式