一種微生物菌株及其在降解煙草甾醇中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于煙草降害技術(shù)領(lǐng)域，也屬于生物強(qiáng)化技術(shù)的范疇，具體涉及留醇高效 降解菌在降解煙葉及其衍生產(chǎn)品中留醇的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物留醇是植物性留體化合物，它不僅是植物細(xì)胞的重要組成成分，也是一種重 要的植物活性成分，其基本結(jié)構(gòu)為環(huán)戊氫化菲體系。目前煙草中已報(bào)道植物留醇主要有膽 甾醇、菜油留醇、豆留醇和谷留醇，霉變煙葉中還可能含有麥角留醇。除游離態(tài)留醇外， 甾醇類化合物還以結(jié)合態(tài)存在，結(jié)合態(tài)包括與脂肪酸結(jié)合成酯、與糖類的羥基形成糖苷。
[0003] 煙草中植物留醇主要存在于細(xì)胞膜中，不但能促進(jìn)煙草生長(zhǎng)，而且對(duì)煙草的安全、 品質(zhì)都有較大的影響。有研宄表明煙草中的留醇是卷煙煙氣致癌物多環(huán)芳烴的主要前體 物，卷煙煙氣中61%的苯并[a]芘是由它裂解產(chǎn)生的。不同于食品和其它植物中的留醇，在 卷煙抽吸時(shí)約有20-25%的煙草植物留醇完整的轉(zhuǎn)移到主流和側(cè)流煙氣中。留醇中的羥基 高溫?zé)峤鈺r(shí)會(huì)與其母體的四輪環(huán)戊稀[a ]菲環(huán)結(jié)構(gòu)形成稠環(huán)芳徑化合物。Stedman的研宄 表明豆留醇在750°C下熱解生成苯并[a ]芘；Badger等的研宄表明，在豆留醇的裂解過(guò)程 中，發(fā)生了甾醇骨架的一系列單分子反應(yīng)后形成了菲、蒽等多環(huán)芳烴。
[0004]由于煙草中植物留醇是卷煙煙氣中苯并[a]芘生成的前體化合物，降解煙草及 其制品中的植物留醇對(duì)促進(jìn)卷煙的減害降焦研宄具有重要的參考價(jià)值和實(shí)踐意義。
[0005] 相關(guān)研宄表明：節(jié)桿菌、諾卡氏菌和分枝桿菌均可切除留醇的飽和側(cè)鏈，得到雄 甾-1，4-二烯-3, 17-二酮（ADD)，并且它們對(duì)留體化合物的降解作用并不停留在ADD上，大 多數(shù)野生菌株可以降解ADD直至最終產(chǎn)物C0 2，完全降解留醇母核需要20多種酶參與反應(yīng)， 其反應(yīng)式如圖1所示。這為開(kāi)展煙草中植物留醇降解研宄奠定了良好的理論基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明旨在篩選、培養(yǎng)條件優(yōu)化及研發(fā)出煙草留醇的高效降解微生物 Acinetobacter pittii TQ30002菌株、菌劑，并用于降解煙草材料中的留醇，以實(shí)現(xiàn)處理上 的溫和性與低成本。
[0007] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0008] 一種留醇降解菌株（Acinetobacter pittii) TCD0002,已于 2014 年 10 月 8 日保藏 于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)CGMCC No. 9752。
[0009] 所述的甾醇降解菌株（Acinetobacter pittii)TQ)0002在降解甾醇中的應(yīng)用。
[0010] 上述技術(shù)方案中所述的留醇為煙葉及其衍生產(chǎn)品中的甾醇。
[0011] 所述的留醇降解菌株（Acinetobacter pittii)TQ)0002在降解留醇中的應(yīng)用，包 括如下步驟：
[0012] 步驟（1)，斜面培養(yǎng)：將留醇降解菌株T⑶0002于斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為 28°C，培養(yǎng)時(shí)間為7d ;然后用無(wú)菌水將斜面表面生長(zhǎng)的菌苔用接種環(huán)刮洗，制備成第一菌 懸液；
[0013] 步驟（2)，擴(kuò)繁培養(yǎng)：將步驟（1)得到的第一菌懸液接種至擴(kuò)繁培養(yǎng)基上進(jìn)行擴(kuò)繁 培養(yǎng)，接種量為5%，培養(yǎng)溫度為28°C，培養(yǎng)時(shí)間為7d;
[0014]步驟（3)，降解應(yīng)用：將步驟（2)培養(yǎng)的留醇降解菌株T⑶0002制成第二菌懸液， 然后噴灑到煙葉及其衍生產(chǎn)品中進(jìn)行降解。
[0015] 上述技術(shù)方案中步驟（1)所述的斜面培養(yǎng)基為：NaCl 1. 5g，K2HP04 1. 5g，NaN03 4. 5g，F(xiàn)eS04 ? H20 0? 0075g，MgS04 0? 3g 和 1. Og/L 豆甾醇乳濁液 150mL，瓊脂 30g，一起加入 至自來(lái)水中定容成1. 5L，調(diào)整pH = 7. 0,加熱煮沸，待瓊脂融化后，分裝至帶棉塞lOmL玻璃 試管內(nèi)，每管分裝量為4mL，接著121°C滅菌30分鐘，然后放置成斜面，冷卻至室溫，即得。
[0016] 上述技術(shù)方案中步驟（1)所述的第一菌懸液濃度為109CFU/mL。
[0017] 上述技術(shù)方案中步驟（2)所述的擴(kuò)繁培養(yǎng)基為：NaCl 1. 5g，K2HP041. 5g，NaN03 4. 5g，F(xiàn)eS04 ?H20 0?0075g，MgS040?3g，1. Og/L 豆甾醇乳濁液 150mL 和瓊脂 30g，一起加入 至自來(lái)水中定容成1. 5L，調(diào)整pH= 7. 0,加熱煮沸，待瓊脂融化后，分裝至帶棉塞500mL三 角瓶，每瓶分裝量為100mL，接著121°C滅菌30分鐘，冷卻至室溫，即得。
[0018] 上述技術(shù)方案中步驟（3)所述的第二菌懸液濃度為109CFU/mL。
[0019] 上述技術(shù)方案中步驟（3)所述的降解應(yīng)用是將每50mL菌懸液噴灑至1000g煙絲 上，然后將其放置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱內(nèi)，于溫度為28°C，濕度為60%培養(yǎng)48小時(shí)后，50°C烘 干20分鐘，即可。
[0020] 上述技術(shù)方案中步驟（3)所述的降解應(yīng)用是每lmL菌懸液接種100mL煙浸膏稀 釋液，然后放置于恒溫?fù)u床，于28°C下180rpm培養(yǎng)48小時(shí)，減壓濃縮，50°C烘干，即可；所 述的煙浸膏稀釋液是將煙浸膏用自來(lái)水稀釋5倍得到的。
[0021] 本發(fā)明利用煙草種植區(qū)的土壤、根腐病煙株的根部及葉片的微生物細(xì)菌群，通過(guò) 豆甾醇為唯一碳源誘導(dǎo)底物的培養(yǎng)基進(jìn)行分離，再采用篩選驗(yàn)證，菌株對(duì)煙草留醇具有良 好降解性能。
[0022] 同時(shí)，通過(guò)進(jìn)一步采用工業(yè)煙葉產(chǎn)品進(jìn)行菌劑處理，以未經(jīng)過(guò)微生物菌劑處理的 工業(yè)煙葉為空白對(duì)照，比較菌劑在工業(yè)煙葉產(chǎn)品留醇降解處理工藝上的應(yīng)用效果。
[0023] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其有益效果為：
[0024] 本發(fā)明微生物菌株為留醇降解菌株T⑶0002,保藏編號(hào)為CGMCC No. 9752,該菌株 可用于工業(yè)煙草及其衍生產(chǎn)品留醇類物質(zhì)降解，反應(yīng)條件溫和，成本低，效率高，不會(huì)對(duì)環(huán) 境造成二次污染。具體應(yīng)用方式有：（1)為相關(guān)煙草企業(yè)提供特效留醇降解菌劑，用于處理 煙葉留醇降解，降低留醇含量，減少留醇物質(zhì)在燃燒過(guò)程中形成的有害物質(zhì)含量；（2)為相 關(guān)煙草企業(yè)提供特效留醇降解菌劑，用于處理煙葉衍生產(chǎn)品-煙浸膏中留醇降解，降低甾 醇含量，減少留醇物質(zhì)在燃燒過(guò)程中形成的有害物質(zhì)含量，實(shí)現(xiàn)煙草產(chǎn)品減焦降害的目的。
【附圖說(shuō)明】
[0025] 圖1是豆留醇的微生物降解途徑的反應(yīng)式；
[0026] 圖2是HPLC分析豆甾醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0027]圖3是菌株Acinetobacter pittii TQ30002降解豆留醇HPLC分析譜圖；其中， 12. 58min為豆甾醇的峰，其峰面積為15767. 8;
[0028] 圖4米用鄰接法構(gòu)建基于菌株Acinetobacter pittii_TCD0002的16S rRNA基因 部分序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)；
[0029] 圖 5 是菌株 Acinetobacter pittii TCD0002 的掃描電鏡圖；
[0030] 圖6是麥角留醇標(biāo)準(zhǔn)工作液HPLC色譜圖；
[0031] 圖7是0 -谷留醇標(biāo)準(zhǔn)工作液HPLC色譜圖；
[0032] 圖8是豆留醇標(biāo)準(zhǔn)工作液HPLC色譜圖；
[0033] 圖9是膽留醇標(biāo)準(zhǔn)工作液HPLC色譜圖；
[0034] 圖10是實(shí)施例2中樣品HPLC色譜圖；
[0035] 圖11是實(shí)施例3中樣品HPLC色譜圖；
[0036] 其中，1-內(nèi)標(biāo)物（6-酮膽甾烷醇），2_麥角甾醇，3-膽甾醇，4-豆甾醇，5-0-谷甾 醇；
[0037] 留醇降解菌株（Acinetobacter pittii) TCD0002,已于2014年10月8日保藏于中 國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)CGMCC No. 9752,保藏地址為北京 市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研宄所。
【具體實(shí)施方式】
[0038] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
[0039] 本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā) 明的范圍。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件 或者按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)購(gòu)買獲得的 常規(guī)產(chǎn)品。
[0040] 實(shí)施例1.菌株T⑶0002分離及降解留醇性能篩選
[0041] (1)以豆甾醇為唯一碳源的富集、篩選培養(yǎng)基配制
[0042] NaCl 1. 5g，K2HP04 1. 5g，NaN03 4. 5g，F(xiàn)eS04 ? H20 0? 0075g，MgS04 0? 3g 和 1. Og/L 豆甾醇乳濁液150mL，一起加入至自來(lái)水中定容成1. 5L，pH = 7. 0,分裝至帶棉塞500mL三 角瓶（每瓶分裝量為l〇〇mL)，121°C滅菌30分鐘，自然冷卻到室溫，得到富集培養(yǎng)基，待用。
[0043] (2)甾醇降解菌的富集培養(yǎng)
[0044] 富集培養(yǎng)時(shí)稱取1克煙田土壤、煙葉或煙根部，加入到裝有100mL富集培養(yǎng)基的三 角瓶中，置于28°C恒溫?fù)u床中培養(yǎng)。次日起每天取樣，顯微鏡下觀察菌體生長(zhǎng)情況，選擇有 微生物生長(zhǎng)明顯的樣品涂平皿培養(yǎng)，待有單菌落長(zhǎng)出時(shí)，挑取單菌落轉(zhuǎn)入斜面保存。
[0045] (3)甾醇降解菌的初步篩選
[0046] 經(jīng)選擇性培養(yǎng)基的富集培養(yǎng)、顯微鏡觀察生物量來(lái)進(jìn)行留醇降解菌的初步篩選。 將培養(yǎng)后生物量很大的樣品進(jìn)行稀釋后涂平皿分離，分離得到單一的純菌株斜面保存、編 號(hào)。將分離得到的菌株轉(zhuǎn)接到裝有l(wèi)〇〇mL液體培養(yǎng)液的三角瓶中培養(yǎng)，每瓶接種1支菌株斜 面。不接菌空白培養(yǎng)基設(shè)為對(duì)照。每個(gè)菌株2個(gè)平行，培養(yǎng)溫度為28°C，轉(zhuǎn)速為200r/min， 豆甾醇濃度為〇. 1%。
[0047]所述的液體培養(yǎng)液為：NaCl 1. 5g，K2HP04 1. 5g，NaN03 4. 5g，F(xiàn)eS04 ? H200. 0075g， MgS04 0. 3g，1. Og/L豆甾醇乳濁液150mL，一起加入至自來(lái)水中定容成1. 5L，調(diào)整pH = 7. 0， 分裝至帶棉塞500mL三角瓶（每瓶分裝量為100mL)，121°C滅菌30分鐘，自然冷卻到室溫 即可。
[0048] 培養(yǎng)5d后每個(gè)樣均用移液槍吸取培養(yǎng)液0. 5-1. 5mL到離心管內(nèi)，同時(shí)吸取相同體 積的分析純氯仿加入到離心管，充分混勻萃取，去除水層部分。氯仿部分用毛細(xì)管半定量吸 取，TLC薄層板上以0. 01%豆留醇為對(duì)照逐個(gè)點(diǎn)樣，以體積比為1:1的氯仿和石油醚的混合 溶劑作為展開(kāi)劑擴(kuò)展，之后用5%硫酸-乙醇的顯色劑噴灑后加熱顯色。將不接菌空白培養(yǎng) 基氯仿提取物設(shè)為空白對(duì)照。
[0049] 試驗(yàn)結(jié)果表明，從煙葉和煙田土壤分離的54株細(xì)菌中，篩選獲得可降解豆留醇的 菌株T⑶0002。與空白對(duì)照相比，即與不接菌空