用于檢測(cè)乙酰甲喹和喹乙醇代謝產(chǎn)物的單克隆抗體及酶聯(lián)免疫方法與試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于獸藥殘留分析和免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種能識(shí)別乙酰甲喹和喹乙 醇代謝產(chǎn)物的單克隆抗體和一種用于檢測(cè)乙酰甲喹和喹乙醇代謝產(chǎn)物的酶聯(lián)免疫方法 (ELISA)及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 脫二氧乙酰甲喹和脫二氧喹乙醇屬于喹噁啉類(lèi)藥物，是原型藥物乙酰甲喹和喹乙 醇在動(dòng)物體內(nèi)脫氧代謝的產(chǎn)物，具有苯并吡嗪1，4-二氮萘的基本結(jié)構(gòu)，乙酰甲喹和喹乙醇 抗菌譜較廣，抗革蘭氏陰性菌的作用要強(qiáng)于陽(yáng)性菌，在獸醫(yī)臨床和養(yǎng)殖業(yè)得到了廣泛應(yīng)用。 人們?yōu)榱俗非蠼?jīng)濟(jì)利益而濫用藥物，導(dǎo)致藥物在動(dòng)物食品中大量殘留。喹噁啉類(lèi)藥物會(huì)對(duì) 動(dòng)物產(chǎn)生三致作用、光敏反應(yīng)和腎上腺皮質(zhì)損壞等毒副作用，部分文獻(xiàn)報(bào)道，藥物對(duì)動(dòng)物機(jī) 體還有一定程度的生殖毒性和細(xì)胞毒性。
[0003] 現(xiàn)已發(fā)展了多種用于檢測(cè)該類(lèi)藥物殘留的方法，如微生物方法、儀器方法及酶聯(lián) 免疫方法。微生物法被用于大量樣品的初步篩選，儀器方法常用于對(duì)陽(yáng)性樣品的確證， ELISA方法既可以定性也可以半定量。在這些殘留分析方法中，儀器方法由于其所需儀器昂 貴、操作復(fù)雜、檢測(cè)費(fèi)用高，而不利于大批量樣品的篩選及現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。微生物法雖在殘留篩 選高通量上表現(xiàn)出良好的性能，但方法缺乏特異性，不能確證殘留物的種類(lèi)，且所用細(xì)菌對(duì) 不同種類(lèi)的抗菌藥物敏感性存在差異，易導(dǎo)致假陰性和假陽(yáng)性結(jié)果的產(chǎn)生。而ELISA方法 操作簡(jiǎn)便、高通量、高靈敏度、低費(fèi)用，能很好的克服儀器方法和微生物方法的缺陷。
[0004] 但目前，針對(duì)喹噁啉類(lèi)代謝物的檢測(cè)方法鮮有報(bào)道，所以，建立一種特異性較好、 靈敏度較高的單克隆抗體以檢測(cè)動(dòng)物體內(nèi)或肉類(lèi)食物中乙酰甲喹和喹乙醇代謝產(chǎn)物的殘 留顯得十分必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種能同時(shí)識(shí)別乙酰甲喹和喹乙醇代謝產(chǎn)物的單克 隆抗體；
[0006] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是利用該單克隆抗體，制備一種用于乙酰甲喹和喹乙醇代謝 產(chǎn)物檢測(cè)的酶聯(lián)免疫試劑盒。
[0007] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是利用該試劑盒，建立一種能用于乙酰甲喹和喹乙醇代謝產(chǎn) 物非診斷目的檢測(cè)的酶聯(lián)免疫方法。
[0008] 本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0009] -種能識(shí)別乙酰甲喹和喹乙醇代謝產(chǎn)物的單克隆抗體，它是由保藏號(hào)為CCTCC N0:C201496的雜交瘤細(xì)胞株DMEQ1A3所分泌的。
[0010] 上述雜交瘤細(xì)胞株DMEQ1A3,保藏在位于湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培 養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)，其保藏號(hào)為CCTCCNO:C201496。
[0011] 所用的免疫原是由結(jié)構(gòu)如式⑵所示的化合物（羧基-脫二氧喹賽多， COOH-DCYX)和人血清白蛋白偶聯(lián)制備的。
[0012]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種能識(shí)別乙酰甲喹和喹乙醇代謝產(chǎn)物的單克隆抗體，它是由保藏號(hào)為CCTCC N0:C201496的雜交瘤細(xì)胞株DMEQ1A3所分泌的，所述乙酰甲喹和喹乙醇代謝產(chǎn)物是脫二氧 乙酰甲喹、脫二氧喹乙醇。
2. -株雜交瘤細(xì)胞株DMEQ1A3,保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏號(hào)為CCTCC NO:C201496,所述雜交瘤細(xì)胞株DMEQ1A3分泌的單克隆抗體能識(shí)別乙酰甲喹和喹乙醇代謝 產(chǎn)物，所述乙酰甲喹和喹乙醇代謝產(chǎn)物是脫二氧乙酰甲喹、脫二氧喹乙醇。
3. 權(quán)利要求1所述的單克隆抗體在制備檢測(cè)乙酰甲喹和喹乙醇代謝產(chǎn)物的酶聯(lián)免疫 試劑盒中的應(yīng)用。
4. 包含權(quán)利要求1所述的單克隆抗體的試劑盒。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，該試劑盒是檢測(cè)乙酰甲喹和喹乙醇代謝產(chǎn)物的酶聯(lián) 免疫試劑盒。
6. 權(quán)利要求4或5所述的試劑盒在乙酰甲喹和喹乙醇代謝產(chǎn)物非診斷目的檢測(cè)中的應(yīng) 用。
7. -種用于檢測(cè)肉類(lèi)食物中乙酰甲喹和喹乙醇代謝產(chǎn)物殘留的酶聯(lián)免疫方法，其特征 在于包括以下步驟： (1) 將結(jié)構(gòu)如式（1)所示的化合物與卵清白蛋白偶聯(lián)得到包被原； (2) 用保藏號(hào)為CCTCCN0:C201496的雜交瘤細(xì)胞株DMEQ1A3制備單克隆抗體； (3) 用步驟（1)的包被原包被固相載體； (4) 將待測(cè)樣品提取后進(jìn)行酶聯(lián)免疫檢測(cè)，
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的用于檢測(cè)肉類(lèi)食物中乙酰甲喹和喹乙醇代謝產(chǎn)物殘留的 酶聯(lián)免疫方法，其特征在于：所述待測(cè)樣品的提取方法是：將待測(cè)樣品用體積比為乙酸乙 酯：乙腈=1 : 1的混合溶劑振蕩提取，再加入lmol/L的NaOH，靜置，取有機(jī)層用氮?dú)獯?干，加入稀釋液離心后取上清， 所述稀釋液的成分為：NaCl8.Og，KH2P040. 2g，Na2HP04 ? 12H20 2. 9g，KC1 0? 2g，Tween200. 5mL，加雙蒸水至lOOOmL，調(diào)節(jié)pH至 7. 4〇
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種能識(shí)別乙酰甲喹和喹乙醇代謝產(chǎn)物的特異性單克隆抗體和一種用于檢測(cè)乙酰甲喹和喹乙醇代謝產(chǎn)物的酶聯(lián)免疫方法及試劑盒，本發(fā)明的單克隆抗體是由保藏號(hào)為CCTCC？NO:C201496的雜交瘤細(xì)胞株DMEQ1A3所分泌的。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明制備的單克隆抗體可以同時(shí)識(shí)別脫二氧乙酰甲喹和脫二氧喹乙醇，具有較高的靈敏度和特異性。本發(fā)明建立的ELISA方法和試劑盒能同時(shí)檢測(cè)乙酰甲喹和喹乙醇代謝產(chǎn)物在肉類(lèi)食品中的殘留，具有檢測(cè)效率和靈敏度高，精密度和準(zhǔn)確度好等優(yōu)點(diǎn)。CCTCC NO:C20149620140520
【IPC分類(lèi)】C07K16-44, G01N33-577, G01N33-543, C12N5-20
【公開(kāi)號(hào)】CN104558185
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410830096
【發(fā)明人】袁宗輝, 何秀平, 彭大鵬, 潘源虎, 王玉蓮, 陳冬梅, 陶燕飛, 劉振利
【申請(qǐng)人】華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年4月29日
【申請(qǐng)日】2014年12月26日