本發(fā)明屬于生物，具體涉及一種與小麥籽粒超氧化物歧化酶活性相關(guān)的kasp標(biāo)記及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、超氧化物歧化酶對(duì)小麥面粉色澤及面制品營養(yǎng)品質(zhì)有重要作用。超氧化物歧化酶(superoxide?dismutase，sod)可以催化超氧化物歧化反應(yīng)，是清除活性氧的第一防線，其活性水平與植物的生長發(fā)育、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定性、植物的抗逆性密切相關(guān)，超氧化物歧化酶是小麥中膳食纖維的重要組分之一，已成為研究者關(guān)注的主要組分之一，因此也逐漸成為小麥與人類健康營養(yǎng)方面的研究熱點(diǎn)。通過遺傳途徑改良我國小麥的營養(yǎng)和加工品質(zhì)是可行的，而育種上突破性的成就主要取決于關(guān)鍵基因的發(fā)掘和利用。

2、隨著人們生活水平的不斷提高，對(duì)小麥品質(zhì)提升的需求越來越迫切，包括營養(yǎng)價(jià)值、口感、色澤等方面。研究發(fā)現(xiàn)小麥籽粒中sod通過發(fā)生氧化還原反應(yīng)，將面粉中的類胡蘿卜素和黃色素的共軛雙鍵變?yōu)閱捂I，從而起到漂白的作用；sod可催化超氧陰離子自由基分解為過氧化氫和氧氣，從而將小麥面粉中的膳食纖維降解為有益的低聚糖等物質(zhì)；sod促進(jìn)面團(tuán)中巰基與二硫鍵的反應(yīng)，使得二硫鍵含量提升，能將同一條肽鏈上不同部位或者不同肽鏈上的氨基酸殘基聚攏，形成相對(duì)較穩(wěn)定的空間拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)可有效維持蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)，因此ss鍵的含量對(duì)面粉的流變學(xué)特性有積極影響。

3、sod含量是由多基因控制的復(fù)雜數(shù)量性狀，受環(huán)境影響大，直接對(duì)sod含量高低進(jìn)行選擇難度較大，利用分子標(biāo)記聚合sod含量相關(guān)基因，是進(jìn)行sod含量改良的重要途徑。功能標(biāo)記是根據(jù)功能基團(tuán)內(nèi)部序列單核苷酸多態(tài)性開發(fā)出的一種新型分子標(biāo)記，依據(jù)理論，此類標(biāo)記不需要進(jìn)一步的驗(yàn)證就可以在不同的遺傳背景下知道特異位點(diǎn)的等位變異類型，且目前可用功能標(biāo)記較少。因此，發(fā)掘小麥sod活性相關(guān)基因，開發(fā)基因特異性分子標(biāo)記，是進(jìn)行基因聚合育種和品質(zhì)性狀分子機(jī)理研究的重要基礎(chǔ)，對(duì)培育具有優(yōu)良品質(zhì)的小麥新品種，具有重要的理論與現(xiàn)實(shí)意義。因此，挖掘小麥籽粒sod含量基因，開發(fā)與其緊密連鎖的分子標(biāo)記，進(jìn)而培育高sod活性小麥品種，對(duì)改善面粉及面制品營養(yǎng)品質(zhì)具有重要的理論與現(xiàn)實(shí)意義。

4、小麥籽粒sod含量受基因型和環(huán)境的影響，但主要由基因型影響。有關(guān)小麥品種間sod含量主效位點(diǎn)挖掘的研究相對(duì)較少。在對(duì)小麥幼苗時(shí)期根冠組織的研究中發(fā)現(xiàn)，sod含量在不同品種間相差1.5-2倍。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種用于鑒定小麥籽粒超氧化物歧化酶含量的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。

2、本發(fā)明首先提供了一種與小麥籽粒中超氧化物歧化酶含量相關(guān)的分子標(biāo)記，為核苷酸為seq?id?no.4的dna分子。

3、以參考小麥品種中國春基因組iwgsc_refseq_v1.0(http://202.194.139.32/)及小麥基因組遺傳變異數(shù)據(jù)庫，所述snp位點(diǎn)位于小麥5b染色體上的第551414145位核苷酸(seq?id?no.4的第41位)，位于traescs5b01g373700基因內(nèi)部，，該snp位點(diǎn)處的核苷酸為a或g。

4、本發(fā)明提供了鑒定或輔助鑒定小麥籽粒超氧化物歧化酶含量的方法，包括檢測待測小麥基因組中所述snp位點(diǎn)的基因型，根據(jù)所述基因型鑒定或輔助鑒定小麥籽粒超氧化物歧化酶含量，所述snp位點(diǎn)為小麥5b染色體上的一個(gè)位點(diǎn)，其核苷酸種類為a或g，為序列表中序列4的第41位核苷酸。

5、上述方法中，所述snp的基因型可為基因型aa或基因型gg，所述基因型aa是所述snp為a的純合型(序列表中序列4的第41位核苷酸為a的純合型)，所述基因型gg是所述snp為g的純合型(序列表中序列4的第41位核苷酸為g的純合型)。

6、作為一種實(shí)施方案，所述鑒定或輔助鑒定小麥籽粒超氧化物歧化酶含量的方法可包括如下步驟：

7、(1)以待測小麥的基因組dna為模板，采用引物組合物進(jìn)行kasp分子標(biāo)記檢測；所述引物組合物由引物a、引物b和引物c組成；

8、所述引物a為核苷酸序列是序列表中序列1的單鏈dna分子或核苷酸序列是序列表中序列1的第22-40位的單鏈dna；

9、所述引物b為核苷酸序列是序列表中序列2的單鏈dna分子或核苷酸序列是序列表中序列2的第22-39位的單鏈dna；

10、所述引物c為核苷酸序列是序列表中序列3的單鏈dna分子；

11、(2)完成步驟(1)后，進(jìn)行熒光檢測，確定待測小麥的所述snp的基因型；

12、(3)根據(jù)基因型結(jié)果進(jìn)行鑒定待測小麥的籽粒超氧化物歧化酶含量：所述snp位點(diǎn)的基因型為aa的待測小麥的籽粒超氧化物歧化酶含量高于所述snp位點(diǎn)的基因型為gg的待測小麥。

13、本發(fā)明還提供了小麥育種的方法。

14、本發(fā)明所提供的小麥育種的方法，包括檢測小麥基因組中所述snp位點(diǎn)的基因型，選擇所述snp位點(diǎn)的基因型為aa的小麥作為親本進(jìn)行育種，所述aa是所述snp的基因型為gg(序列表中序列4的第41位核苷酸為a的純合型)。

15、作為一種實(shí)施方法，小麥育種的方法可包括如下步驟：

16、(1)以待測小麥的基因組dna為模板，采用上述引物組進(jìn)行kasp分子標(biāo)記檢測；

17、(2)完成步驟(1)后，進(jìn)行熒光檢測，確定待測小麥所述snp位點(diǎn)的基因型；

18、(3)選擇基因型gg的小麥進(jìn)行籽粒超氧化物歧化酶含量高的小麥育種。

19、上述方法中，引物溶解與配制方法可為：先將3條引物分別用ddh2o稀釋7.5μm，再按如下配制引物工作液：引物a12μl、引物b12μl、引物c?30μl、ddh2o?46μl，作為kasp標(biāo)記的引物工作液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

20、反應(yīng)體系：2.0ul?kasp?2×master?mix、0.0448ul?kasp引物(3條引物混合，總濃度為50μm，其中兩條上游引物和一條下游引物的摩爾比為2:2:5)、2.0ul模板dna。

21、上述方法中，kasp標(biāo)記可在普通pcr擴(kuò)增儀上進(jìn)行。

22、上述方法中，kasp標(biāo)記的反應(yīng)程序可為：

23、反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性，15min；94℃變性20s，61℃-55℃(選用touch?down程序，每循環(huán)降低1℃)，45s，擴(kuò)增10個(gè)循環(huán)；94℃變性20s，55℃，45s，繼續(xù)擴(kuò)增37個(gè)循環(huán)。

24、上述方法中，確定待測小麥所述snp的基因型的方法可為：pcr反應(yīng)完成后，利用熒光信號(hào)閱讀儀(omega)和熒光檢測系統(tǒng)(araya)將熒光信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)榭煞治龅臄?shù)值對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行熒光數(shù)據(jù)讀取。采用終末端讀取熒光值進(jìn)行基因分型，熒光掃描結(jié)果利用r軟件包進(jìn)行圖形化展示，a堿基類型帶有fam熒光，分布于x軸附近；g堿基類型帶有hex熒光，分布于y軸附近；無檢出信號(hào)的樣本分布于原點(diǎn)附近。

25、本文中，所述育種的目的可包括培育籽粒超氧化物歧化酶含量高的小麥。所述小麥可為純系或自交系。

26、本發(fā)明還提供了用于檢測小麥基因組中snp位點(diǎn)的多態(tài)性或基因型的產(chǎn)品。

27、本發(fā)明所提供的用于檢測小麥基因組中所述snp位點(diǎn)的多態(tài)性或基因型的產(chǎn)品，含有上述檢測小麥基因組中snp位點(diǎn)的多態(tài)性或基因型的物質(zhì)，所述產(chǎn)品可為下述任一種：

28、c1)檢測小麥籽粒超氧化物歧化酶含量相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性或基因型的產(chǎn)品；

29、c2)鑒定或輔助鑒定小麥籽粒超氧化物歧化酶含量的產(chǎn)品；

30、c3)用于小麥育種的產(chǎn)品。

31、上述應(yīng)用、方法和產(chǎn)品中，所述物質(zhì)可為通過下述至少一種方法確定所述snp位點(diǎn)的多態(tài)性或基因型所需的試劑和/或儀器：dna測序、限制性酶切片段長度多態(tài)性、單鏈構(gòu)象多態(tài)性、變性高效液相色譜和snp芯片。其中，snp芯片包括基于核酸雜交反應(yīng)的芯片、基于單堿基延伸反應(yīng)的芯片、基于等位基因特異性引物延伸反應(yīng)的芯片、基于“一步法”反應(yīng)的芯片、基于引物連接反應(yīng)的芯片、基于限制性內(nèi)切酶反應(yīng)的芯片、基于蛋白dna結(jié)合反應(yīng)的芯片，及基于熒光分子dna結(jié)合反應(yīng)的芯片。

32、可選地，所述物質(zhì)為如下d1)、d2)或d3)：

33、d1)所述物質(zhì)為擴(kuò)增包括所述snp位點(diǎn)在內(nèi)的小麥基因組dna片段的引物組合物；

34、d2)所述物質(zhì)為含有d1)所述引物組合物的pcr試劑；

35、d3)所述物質(zhì)為含有d1)所述引物組合物或d2)所述pcr試劑的試劑盒。

36、可選地，所述擴(kuò)增可為pcr擴(kuò)增。所述引物組合物由所述引物a、所述引物b和所述引物c組成。

37、d3)所述試劑盒還可包括kasp?master?mix。

38、上述應(yīng)用、方法和產(chǎn)品中，所述引物組合物可被標(biāo)記物標(biāo)記也可不被標(biāo)記物標(biāo)記。所述標(biāo)記物指可用于提供可檢測的效果且可以連接至核酸的任何原子或分子。標(biāo)記物包括但不限于染料；放射性標(biāo)記，諸如32p；結(jié)合部分，諸如生物素(biotin)；半抗原，諸如地高辛(dig)；發(fā)光、發(fā)磷光或發(fā)熒光部分；和單獨(dú)的熒光染料或與可以通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fret)抑制或移動(dòng)發(fā)射光譜的部分組合的熒光染料。標(biāo)記可以提供可通過熒光、放射性、比色、重量測定、x射線衍射或吸收、磁性、酶活性等檢測的信號(hào)。標(biāo)記可以是帶電荷的部分(正電荷或負(fù)電荷)或可選地，可以是電荷中性的。標(biāo)記可以包括核酸或蛋白序列或由其組合，只要包含標(biāo)記的序列是可檢測的。在一些實(shí)施方案中，核酸在沒有標(biāo)記的情況下直接檢測(例如，直接讀取序列)。

39、上述應(yīng)用、方法和產(chǎn)品中，所述物質(zhì)可為kasp引物組，所述kasp引物組可由引物a、引物b和引物c組成。

40、(a1)所述引物a為自5'端到3'端依次為熒光標(biāo)簽序列a和seq?id?no.1的第22-40位的單鏈dna；

41、(a2)所述引物b為自5'端到3'端依次為熒光標(biāo)簽序列b和seq?id?no.2的第22-39位的單鏈dna；

42、(a3)所述引物c為核苷酸序列如序列表中seq?id?no.3所示的單鏈dna。

43、其中，所述熒光標(biāo)簽序列a為熒光標(biāo)簽序列fam,其核苷酸序列為seq?id?no.1的第1-21位；所述熒光標(biāo)簽b為熒光標(biāo)簽序列hex，其核苷酸序列為seq?id?no.2的第1-21位。

44、進(jìn)一步地，所述引物a為核苷酸序列如seq?id?no.1所示的單鏈dna；所述引物b為核苷酸序列為seq?id?no.2所示的單鏈dna。

45、第六方面，本發(fā)明要求保護(hù)前文中所述的kasp引物組或所述的分子標(biāo)記在如下任一中的應(yīng)用：

46、(e1)鑒定小麥籽粒超氧化物歧化酶活性；

47、(e2)鑒定或輔助鑒定待測小麥為高sod含量小麥還是低sod含量小麥；

48、(e3)鑒定或輔助鑒定低sod含量小麥品種；

49、(e4)鑒定或輔助鑒定高sod含量小麥品種；

50、(e5)比較或輔助比較不同待測小麥的籽粒中sod含量高低；

51、所述低sod含量小麥中的sod含量小于等于1772.15u/g；

52、所述高sod含量小麥中的sod含量大于等于1807.00u/g；

53、在一個(gè)具體的實(shí)施例中，鑒定或輔助鑒定待測小麥為高sod含量小麥還是低sod含量小麥的方法，包括如下步驟：

54、檢測待測小麥基因組上所述snp位點(diǎn)處的核苷酸，確定所述待測小麥的基因型，根據(jù)所述待測小麥的基因型按照如下確定所述待測小麥sod含量：aa基因型的所述待測小麥的sod含量高于gg基因型的所述待測小麥的sod含量。所述snp位點(diǎn)位于小麥5b染色體上seqid?no.4的第41位，該snp位點(diǎn)處的核苷酸位a或g。

55、所述aa基因型為在小麥基因組上所述snp位點(diǎn)處的核苷酸為a的純合型，與高sod含量相關(guān)；所述gg基因型為在小麥基因組上所述snp位點(diǎn)處的核苷酸為g的純合型，與低sod含量相關(guān)；

56、所述低sod含量小麥中的sod含量小于等于1772.15u/g；

57、所述高sod含量小麥中的sod含量大于等于1807.00u/g。

58、在本發(fā)明中，所述sod含量均表示超氧化物歧化酶含量。

59、在本發(fā)明中，小麥的sod含量通過檢測小麥籽粒的sod含量體現(xiàn)。

60、所述低sod含量小麥中的sod含量小于等于1772.15u/g；

61、所述高sod含量小麥中的sod含量大于等于1807.00u/g。

62、可將檢測所述snp位點(diǎn)多態(tài)性和基因型的物質(zhì)與其他物質(zhì)(如檢測其他與小麥sod含量相關(guān)的分子標(biāo)記的單核苷酸多態(tài)性或基因型的物質(zhì))聯(lián)合在一起制備鑒定小麥sod含量高的小麥品種的產(chǎn)品。

63、實(shí)驗(yàn)證明：本發(fā)明的分子標(biāo)記可以快速鑒定出選定位點(diǎn)的核苷酸，檢測該位點(diǎn)基因型為aa或gg，及其sod含量的高低，運(yùn)用本發(fā)明的分子標(biāo)記能快速篩選出具有較高sod含量的小麥品種(材料)，不僅加速優(yōu)質(zhì)小麥新品種的育成步伐，而且對(duì)利用分子標(biāo)記輔助選擇高sod含量小麥品種具有重要的理論意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

64、本發(fā)明通過全基因組關(guān)聯(lián)和連鎖分析，得出控制小麥籽粒sod活性高低的重要位點(diǎn)位于5b染色體。為了更準(zhǔn)確地鑒定小麥不同品種sod含量的基因型，根據(jù)主效位點(diǎn)的不同等位變異類型的序列開發(fā)kasp標(biāo)記，進(jìn)一步提高分子標(biāo)記輔助選育種的效率，為改良小麥sod含量提供切實(shí)可行的分子標(biāo)記，最終為分子標(biāo)記輔助育種培育新品種奠定一定的理論基礎(chǔ)。