本發(fā)明主要涉及生物，具體是一種特異性區(qū)分不同滇重樓品種（ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ和ⅴ）的引物對(duì)、試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、滇重樓（ paris?polyphylla?var.? yunnanensis?(franch.)?hand.-mazz.，ppy）為百合科重樓屬多年生草本植物，主要分布在云南、貴州和四川等地區(qū)。滇重樓含有多種活性成分，如皂苷、萜類和黃酮類等，具有鎮(zhèn)痛、止血、抗腫瘤和抗炎等特性，是云南白藥、季德勝蛇藥片等著名中成藥的重要組成原料，市場(chǎng)需求量大。

2、作為重要藥用植物，滇重樓在我國(guó)已有超過(guò)2000年的栽培歷史。不同的氣候、土壤和生態(tài)條件孕育了豐富的滇重樓種質(zhì)資源。在目前的生產(chǎn)中，矮稈（品種ⅳ）和高稈（品種ⅴ）滇重樓是廣泛使用的品種，兩者在植物形態(tài)上存在顯著差異。通過(guò)對(duì)我國(guó)西南地區(qū)重樓人工種植基地的考察，我們發(fā)現(xiàn)除了高稈和矮稈，滇重樓還存在其他多個(gè)品種（ⅰ、ⅱ和ⅲ）。在種苗階段，由于其外形十分相似，僅憑外觀難以區(qū)分不同品種的滇重樓。由于滇重樓不同品種在藥用成分甾體皂苷的種類和含量等方面存在顯著差異，療效也有很大不同。不同品種的滇重樓混用將極大地影響中醫(yī)產(chǎn)業(yè)的質(zhì)量控制，帶來(lái)安全隱患。滇重樓品種的準(zhǔn)確識(shí)別是確保其藥材生產(chǎn)的基本保障。因此，對(duì)滇重樓不同品種進(jìn)行有效區(qū)分，建立一種快速、準(zhǔn)確的鑒別方法，對(duì)于滇重樓的用藥安全、質(zhì)量控制以及瀕危種群的保護(hù)具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種特異性區(qū)分滇重樓品種的引物對(duì)、試劑盒及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的引物對(duì)可在dna未降解的中藥干品狀態(tài)下準(zhǔn)確特異性區(qū)分5個(gè)滇重樓品種。

2、本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)上述目的，通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

3、本發(fā)明提供了一種特異性區(qū)分滇重樓品種的引物對(duì)，所述引物對(duì)包括上游引物f和下游引物r；所述上游引物f的核苷酸序列如seq?id?no.1所示：ctcggcccaatcttttcct，所述下游引物r的核苷酸序列如seq?id?no.2所示：cccaaggatccatcggatt。

4、本發(fā)明還提供了一種特異性區(qū)分滇重樓種質(zhì)的試劑盒，所述試劑盒包括上述的引物對(duì)。

5、本發(fā)明還提供了上述引物對(duì)或上述試劑盒在區(qū)分滇重樓品種中的應(yīng)用。

6、本發(fā)明還提供了一種區(qū)分滇重樓品種的方法，包括以下步驟：

7、以待測(cè)樣品基因組dna為模板，利用上述引物對(duì)或上述試劑盒配制pcr反應(yīng)體系，進(jìn)行pcr擴(kuò)增；pcr產(chǎn)物測(cè)序后，采用軟件codoncode?aligner?(codoncode?co.,?usa)進(jìn)行序列拼接及校對(duì)。首先，利用該軟件去除序列兩端的引物區(qū)，然后進(jìn)行測(cè)序質(zhì)量評(píng)估及預(yù)處理；

8、若擴(kuò)增產(chǎn)物176?-?247?bp位置的序列缺失，則待測(cè)樣品為滇重樓品種?。蝗魯U(kuò)增產(chǎn)物176?-?247?bp位置的序列無(wú)缺失，則待測(cè)樣品為品種ⅱ；若擴(kuò)增產(chǎn)物176?-?182?bp位置的序列缺失，則待測(cè)樣品為品種ⅲ；若擴(kuò)增產(chǎn)物176?-?235?bp位置的序列缺失，則待測(cè)樣品為品種ⅳ；若擴(kuò)增產(chǎn)物176?-?199?bp位置的序列缺失，則待測(cè)樣品為品種ⅴ。

9、優(yōu)選的，所述pcr擴(kuò)增反應(yīng)程序包括：95°c預(yù)變性3?min；94°c變性30?s，55°c退火30?s，72°c延伸1?min，共35個(gè)循環(huán)；最后72°c延伸5?min，終止溫度為4°c。

10、優(yōu)選的，所述pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系以20?μl計(jì)，包括模板dna?2?μl，上、下游引物各1μl，2?×?taq?plus?pcr?mastermix?10?μl，dd?h2o?6?μl。

11、優(yōu)選的，所述上游引物和下游引物濃度均為10?μmol/l；所述模板的濃度為40?-100?ng/ul

12、優(yōu)選的，所述2?×?taq?pcr?mastermix購(gòu)自北京鴻躍創(chuàng)新科技有限公司生產(chǎn)的貨號(hào)為dm1220。

13、優(yōu)選的，所述待測(cè)樣品包括新鮮組織和/或dna未降解的干品組織。

14、有益效果

15、本發(fā)明提供了一種特異性區(qū)分滇重樓品種的引物對(duì)，所述引物對(duì)包括上游引物f和下游引物r；所述上游引物f的核苷酸序列如seq?id?no.1所示seq?id?no.1所示：ctcggcccaatcttttcct，所述下游引物r的核苷酸序列如seq?id?no.2所示：cccaaggatccatcggatt。本發(fā)明對(duì)滇重樓品種的葉綠體全基因組進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)5個(gè)高度可變的位點(diǎn)，包括 clpp-psbb,? rbcl-accd,? peta-psbj,? trne(uuc)-trnt(ggu)和 rps16-trnq (uug)在5個(gè)滇重樓品種中存在顯著差異；本發(fā)明基于上述差異序列區(qū)間設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)，利用該引物對(duì)待測(cè)滇重樓樣品進(jìn)行pcr擴(kuò)增和測(cè)序，分析測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn) rbcl-accd序列的引物組prime?2在5個(gè)品種間差異最明顯，可準(zhǔn)確鑒定滇重樓品種（ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ和ⅴ）。

16、具體地，本發(fā)明所述方法如下：

17、（1）取待測(cè)樣品的新鮮葉片/或干燥樣品藥材，加液氮徹底磨碎，采用dneasyplant?maxi?試劑盒（qiagen，巴倫西亞，加利福尼亞州，美國(guó)）提取待測(cè)滇重樓葉片的總dna。

18、（2）以步驟（1）提取的dna為模板，以所述分子特異性標(biāo)記引物（a-f、a-r）作為擴(kuò)增引物，進(jìn)行pcr擴(kuò)增。

19、pcr反應(yīng)體系每20?μl組成如下：

20、

21、pcr擴(kuò)增條件如下：95°c預(yù)變性3?min；94°c變性30?s，55°c退火30?s，72°c延伸1min，共35個(gè)循環(huán)；最后72°c延伸5?min，終止溫度為4°c。

22、（3）取步驟（2）的擴(kuò)增產(chǎn)物2?μl，點(diǎn)樣于1%的瓊脂糖凝膠上，以dna分子量標(biāo)準(zhǔn)（dl2000?dna?marker）作為dna?marker，于1?×?tae緩沖液中進(jìn)行電泳，電壓及電泳時(shí)間分別設(shè)置為110?v、30?min。電泳結(jié)束后將瓊脂糖凝膠置于紫外凝膠成像分析儀上顯影，電泳結(jié)果出現(xiàn)明顯且清晰的dna條帶，則可以進(jìn)一步將pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。采用軟件codoncode?aligner?(codoncode?co.,?usa)進(jìn)行序列拼接及校對(duì)。首先，利用該軟件去除序列兩端的引物區(qū)，然后進(jìn)行測(cè)序質(zhì)量評(píng)估及預(yù)處理，即去除測(cè)序結(jié)果兩端的低質(zhì)量部分，獲得目標(biāo)片段的序列參見(jiàn)sed?id?no.3?-?sed?id?no.7。若擴(kuò)增產(chǎn)物176?-?247?bp位置的序列缺失，則待測(cè)樣品為滇重樓品種??；若擴(kuò)增產(chǎn)物176?-?247?bp位置的序列無(wú)缺失，則待測(cè)樣品為滇重樓品種ⅱ；若擴(kuò)增產(chǎn)物176?-?182?bp位置的序列缺失，則待測(cè)樣品為滇重樓品種ⅲ；若擴(kuò)增產(chǎn)物176?-?235?bp位置的序列缺失，則待測(cè)樣品為品種ⅳ；若擴(kuò)增產(chǎn)物176-?199?bp位置的序列缺失，則待測(cè)樣品為品種ⅴ。

23、本發(fā)明提供了一種特異性區(qū)分滇重樓品種的引物對(duì)，所述引物對(duì)包括上游引物f和下游引物r；所述上游引物f的核苷酸序列如seq?id?no.1所示seq?id?no.1所示：ctcggcccaatcttttcct，所述下游引物r的核苷酸序列如seq?id?no.2所示：cccaaggatccatcggatt。本發(fā)明對(duì)不同滇重樓品種的葉綠體全基因組進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)5個(gè)高度可變的位點(diǎn)，包括 clpp-psbb,? rbcl-accd,? peta-psbj,? trne(uuc)-trnt(ggu)和 rps16- trnq(uug)在5個(gè)滇重樓品種中存在顯著差異；本發(fā)明基于上述差異序列區(qū)間設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)，利用該引物對(duì)待測(cè)滇重樓樣品進(jìn)行pcr擴(kuò)增和測(cè)序，分析測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn) rbcl-accd序列的引物組prime?2在5個(gè)品種間差異最明顯，可準(zhǔn)確鑒定滇重樓品種ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ和ⅴ。