本發(fā)明屬于動(dòng)物疫病檢測(cè)，涉及一種用于同時(shí)檢測(cè)細(xì)粒棘球絳蟲和多房棘球絳蟲的雙重pcr引物，具體地說，涉及一種用于終末宿主的細(xì)粒棘球絳蟲和多房棘球絳蟲雙重pcr檢測(cè)方法及檢測(cè)用引物。

背景技術(shù)：

1、棘球蚴病(echinococcusis)，俗稱包蟲病，是由棘球絳蟲成蟲和幼蟲引起的兩宿主寄生蟲病，是一種嚴(yán)重危害人體健康和畜牧業(yè)生產(chǎn)的人畜共患病，由于棘球蚴生長(zhǎng)緩慢，在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)無癥狀且臨床表現(xiàn)復(fù)雜難以確診，被世界衛(wèi)生組織列為被忽視的主要熱帶疾病之一。該病呈世界性分布，主要在以畜牧業(yè)發(fā)展為主國(guó)家和地區(qū)流行，在我國(guó)人畜間主要感染2種類型的包蟲病，即：細(xì)粒棘球蚴病和多房棘球蚴病。據(jù)估算，棘球蚴病致使我國(guó)畜產(chǎn)品經(jīng)濟(jì)損失達(dá)30億元以上。

2、棘球蚴病的流行循環(huán)于家養(yǎng)動(dòng)物循環(huán)(細(xì)粒棘球絳蟲)和野生動(dòng)物循環(huán)(多房棘球絳蟲)。家養(yǎng)動(dòng)物循環(huán)參與動(dòng)物有：犬、牛、羊、豬和馬等家畜，野生動(dòng)物循環(huán)參與動(dòng)物有：犬、狼、狐及田鼠、旱獺、高原鼠兔等嚙齒類動(dòng)物。

3、基于我國(guó)西部地區(qū)棘球蚴(包蟲)病流行的高發(fā)狀態(tài)，我國(guó)采取高強(qiáng)度棘球蚴病防控措施，即犬犬投藥，月月驅(qū)蟲和綿羊免疫接種的措施，在包括新疆、內(nèi)蒙古、寧夏、甘肅等地區(qū)已經(jīng)實(shí)行了10年，結(jié)果顯示了明顯的控制效果，綿羊的感染率從50％左右下降到10％左右，犬的感染率從20-60％下降到目前的5-10％。在這種背景下，“犬犬投藥，月月驅(qū)蟲”和全部的羊的免疫接種，將不適于目前的現(xiàn)狀和需求，根據(jù)國(guó)外包括新西蘭、澳大利亞和塞浦路斯等成功控制棘球蚴病的經(jīng)驗(yàn)，在低感染階段需要采取對(duì)終末宿主和中間宿主進(jìn)行全檢的措施，做到精準(zhǔn)防控，才能將棘球蚴病完全消除。

4、目前對(duì)于棘球蚴病的監(jiān)控方法存在明顯的不足，解剖鏡檢對(duì)操作者及環(huán)境危害性大，且易出現(xiàn)漏檢、假陰性等問題；免疫學(xué)檢測(cè)如elisa等，易出現(xiàn)交叉反應(yīng)，造成不敏感和特異性低，使得流調(diào)數(shù)據(jù)(假陽性率)高于金標(biāo)準(zhǔn)(屠宰)；分子生物學(xué)技術(shù)如實(shí)時(shí)熒光pcr，設(shè)備成本較高、耗時(shí)較長(zhǎng)、數(shù)據(jù)分析復(fù)雜，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的技術(shù)水平要求較高，不利于基層推廣，且由于細(xì)粒棘球絳蟲和多房棘球絳蟲親緣關(guān)系較近，不能有效區(qū)分，給棘球蚴病的精準(zhǔn)防控帶來了一定困難。因此，如何能夠簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確地檢測(cè)出細(xì)粒棘球絳蟲和多房棘球絳蟲，已成為亟待解決的問題。

5、本發(fā)明基于細(xì)粒棘球絳蟲、多房棘球絳蟲線粒體基因組保守區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物，建立可同時(shí)檢測(cè)兩型棘球絳蟲的雙重pcr檢測(cè)方法，其具有簡(jiǎn)單、成本低、特異性強(qiáng)和敏感性高的特點(diǎn)，可以快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)并鑒別細(xì)粒棘球絳蟲和多房棘球絳蟲，為棘球蚴病的檢測(cè)以及精準(zhǔn)防控提供有效的技術(shù)手段，具有顯著的公共衛(wèi)生學(xué)意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明目的在于，針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種用于同時(shí)檢測(cè)細(xì)粒棘球絳蟲和多房棘球絳蟲的雙重pcr引物，細(xì)粒棘球絳蟲引物的堿基序列為seq?id?no:1、seq?id?no:2，多房棘球絳蟲引物的堿基序列為seq?id?no:3、seq?id?no:4。本發(fā)明通過提取細(xì)粒棘球絳蟲、多房棘球絳蟲的dna，設(shè)計(jì)細(xì)粒棘球絳蟲、多房棘球絳蟲的特異性引物，進(jìn)行雙重pcr反應(yīng)條件的優(yōu)化，確定最佳的pcr反應(yīng)條件，并按照最佳反應(yīng)條件進(jìn)行驗(yàn)證所建立方法的特異性、敏感性以及臨床樣品檢測(cè)方法的可行性。本發(fā)明可以準(zhǔn)確鑒定并區(qū)分細(xì)粒棘球絳蟲和多房棘球絳蟲，具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)成本低、特異性和敏感性高、結(jié)果直觀等優(yōu)點(diǎn)，可以快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)出終末宿主(犬、狐、貓)糞便樣本中的細(xì)粒棘球絳蟲和多房棘球絳蟲。

2、本發(fā)明所述的一種用于同時(shí)檢測(cè)細(xì)粒棘球絳蟲和多房棘球絳蟲的雙重pcr引物，細(xì)粒棘球絳蟲的特異性引物：

3、seq?id?no:1?5’-gtggtgggttgtaaaccctttg-3’；

4、seq?id?no:2?5’-ccgagacgacaccaacgtaa-3’；

5、多房棘球絳蟲的特異性引物：

6、seq?id?no:3?5’-ggctgccactgtccttactt-3’；

7、seq?id?no:4?5’-ctagtgccaccctcagttgg-3’；

8、細(xì)粒棘球絳蟲目的片段的核苷酸序列如seq?id?no:5所示，多房棘球絳蟲目的片段的核苷酸序列如seq?id?no:6所示。

9、所述引物seq?id?no:1?5’-gtggtgggttgtaaaccctttg-3’；

10、seq?id?no:2?5’-ccgagacgacaccaacgtaa-3’在制備用于檢測(cè)終末宿主感染細(xì)粒棘球絳蟲試劑中的應(yīng)用。

11、所述引物seq?id?no:3?5’-ggctgccactgtccttactt-3’，

12、seq?id?no:4?5’-ctagtgccaccctcagttgg-3’在制備用于檢測(cè)終末宿主感染多房棘球絳蟲試劑中的應(yīng)用。

13、本發(fā)明所述的一種用于同時(shí)檢測(cè)細(xì)粒棘球絳蟲和多房棘球絳蟲的雙重pcr引物，其具體步驟包括：

14、步驟1、細(xì)粒棘球絳蟲、多房棘球絳蟲基因組dna的提?。?/p>

15、按照tianamp?genomic?dna?kit血液/細(xì)胞/組織基因組dna提取試劑盒說明書分別提取經(jīng)鑒定后的細(xì)粒棘球絳蟲、多房棘球絳蟲的基因組dna，溫度-20℃保存?zhèn)溆茫?/p>

16、步驟2、引物設(shè)計(jì)與篩選：

17、從美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(ncbi)數(shù)據(jù)庫下載細(xì)粒棘球絳蟲、多房棘球絳蟲線粒體基因組序列，應(yīng)用primer-blast設(shè)計(jì)特異性引物，最終選擇細(xì)粒棘球絳蟲線粒體基因組trna-tyr至nd5區(qū)域、多房棘球絳蟲線粒體基因組cytb區(qū)域分別設(shè)計(jì)特異性引物，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成；

18、步驟3、雙重pcr反應(yīng)體系與反應(yīng)條件的優(yōu)化：

19、雙重pcr反應(yīng)體系25μl，對(duì)2對(duì)引物濃度為10μm，加入量1μl、1.5μl，退火溫度65±5℃進(jìn)行優(yōu)化，最終確定最佳的雙重pcr反應(yīng)體系為：2×taq?pcr預(yù)混試劑12.5μl，2對(duì)上、下游引物濃度為10μm，加入量均為1μl，模板dna?1μl，最后加ddh2o補(bǔ)齊至25μl，最佳pcr反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；94℃變性30sec，67.8℃退火30sec，72℃延伸1min?30sec，共35個(gè)循環(huán)；74℃終延伸10min；

20、步驟4、雙重pcr擴(kuò)增特異性檢測(cè)：

21、分別以細(xì)粒棘球絳蟲，多房棘球絳蟲，兩型棘球絳蟲混合，多頭絳蟲，泡狀帶絳蟲，陰性犬糞便，陰性狐貍糞便，陰性貓糞便的基因組dna為模板，按照步驟3的pcr反應(yīng)體系與條件進(jìn)行擴(kuò)增，評(píng)價(jià)該方法的特異性；

22、步驟5、雙重pcr擴(kuò)增敏感性檢測(cè)：

23、利用nano-drop?2000超微量分光光度計(jì)測(cè)定兩種棘球絳蟲基因組dna的質(zhì)量濃度，分別稀釋成濃度100ng/μl、50ng/μl、10ng/μl、5ng/μl、1ng/μl、0.5ng/μl、0.1ng/μl，按照步驟3的pcr反應(yīng)體系與條件進(jìn)行擴(kuò)增，評(píng)價(jià)該方法的敏感性；

24、步驟6、臨床樣品檢測(cè)方法的可行性驗(yàn)證：

25、將隨機(jī)地點(diǎn)采集以及人工感染試驗(yàn)采集的棘球絳蟲終末宿主(犬、狐、貓)糞便樣本按照步驟3的pcr反應(yīng)體系與條件進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果與鏡檢、elisa檢測(cè)結(jié)果比較，評(píng)價(jià)該方法用于臨床樣本檢測(cè)的可行性。

26、本發(fā)明提供了一種用于同時(shí)檢測(cè)細(xì)粒棘球絳蟲和多房棘球絳蟲的雙重pcr檢測(cè)引物，其序列為：

27、細(xì)粒棘球絳蟲的特異性引物：

28、seq?id?no:1?5’-gtggtgggttgtaaaccctttg-3’；

29、seq?id?no:2?5’-ccgagacgacaccaacgtaa-3’；

30、多房棘球絳蟲的特異性引物：

31、seq?id?no:3?5’-ggctgccactgtccttactt-3’；

32、seq?id?no:4?5’-ctagtgccaccctcagttgg-3’；

33、細(xì)粒棘球絳蟲目的片段的核苷酸序列如seq?id?no:5所示，多房棘球絳蟲目的片段的核苷酸序列如seq?id?no:6所示。

34、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

35、本發(fā)明通過對(duì)細(xì)粒棘球絳蟲、多房棘球絳蟲線粒體基因組dna比較分析，針對(duì)保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物，組成雙重pcr用于同時(shí)檢測(cè)并區(qū)分兩型棘球絳蟲，該方法操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)成本低廉、特異性和敏感性高、結(jié)果直觀、風(fēng)險(xiǎn)性低，可用于單一蟲體鑒定或在終末宿主(犬、狐、貓)的感染性檢測(cè)，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定、elisa、real-time?pcr檢測(cè)方法的不足。