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一種分離純化磷脂型DHA的柱層析法

文檔序號:39728266發(fā)布日期:2024-10-22 13:31閱讀:2來源:國知局
一種分離純化磷脂型DHA的柱層析法

本發(fā)明涉及分離純化,具體涉及一種分離純化磷脂型dha的柱層析法。


背景技術(shù):

1、磷脂型dha(phospholipids-docosahexaenoic?acid,pls-dha)以磷脂構(gòu)型存在的二十二碳六烯酸(docosahexaenoic?acid,dha),同時兼具了磷脂與dha的雙重優(yōu)勢。dha的主要存在型式有四種,分別是磷脂型dha、甘油三酯型dha(triglycerides-docosahexaenoic?acid,tag-dha)、乙酯型dha(ethyl?esters-docosahexaenoic?acid,ee-dha)、游離型dha(free?fatty?acids-docosahexaenoic,ffa-dha)。磷脂型dha相較于其它類型的dha更容易被多種器官細胞吸收,能夠進行抗炎、免疫等作用。根據(jù)現(xiàn)在的研究發(fā)現(xiàn)磷脂型dha對于母嬰健康有重要作用,對于嬰兒的智力也發(fā)揮一定作用;具有免疫、抗炎的作用,對于腸道菌群失調(diào)的改善以及腦內(nèi)損傷患者的修復、治愈有良好的作用;磷脂型dha具有更高的營養(yǎng)價值,在體內(nèi)的運輸方式是主動運輸,更有利于人體的吸收;其天然存在于海洋磷蝦、魚類等海洋生物中,但是天然的磷脂型dha的量有限,因此尋求人工合成的方法制備磷脂型dha。微生物發(fā)酵、化學合成、酶催化合成等人工合成的方法被人們所關(guān)注,其中酶催化合成法具有更高的反應效率、條件溫和、綠色環(huán)保等優(yōu)勢,而得到了關(guān)注。但其得到的磷脂型dha的純度有限。

2、目前國內(nèi)外有關(guān)磷脂型dha的分離純化的方法主要有:溶劑處理法、薄層層析法、超臨界流體萃取法。溶劑處理法是利用有機溶劑與磷脂型dha的極性的原理萃取磷脂型dha,磷脂能夠溶于正己烷、氯仿等低極性溶劑中,而幾乎不溶于丙酮。但是溶劑處理法中得到的磷脂純度不高,得到的丙酮不溶物中還是會有少量油脂附著在磷脂型dha表面。薄層層析法(tlc)是通過樣品中各個組分與吸附劑的作用力的大小不同,在展開劑中的比移值rf不同,從而實現(xiàn)將各個組分分離。tlc法能實現(xiàn)不同磷脂組分的分離分析,具有方便快捷、直觀靈敏等優(yōu)點,但由于上樣量較少,主要適用于實驗室中進行低上樣量級的分離分析實驗。超臨界流體萃取法利用物質(zhì)各組分在超臨界流體中溶解度的不同實現(xiàn)各組分的分離。超臨界流體萃取法對于設備要求較高,生產(chǎn)成本大。


技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為解決上述問題,本發(fā)明提供一種分離純化磷脂型dha的柱層析法,該方法能夠得到收率較高、dha提取率較高的磷脂型dha,能夠為未來工業(yè)化生產(chǎn)高純磷脂型dha提供技術(shù)支持。

2、本發(fā)明提出了一種分離純化磷脂型dha的柱層析法,其包括:

3、以由磷脂酰膽堿pc和藻油dha經(jīng)固定化脂肪酶b催化合成的產(chǎn)物磷脂為進樣原料,以硅膠作為固定相,使用氯仿:甲醇的混合溶液作為洗脫劑進行洗脫,收集洗脫有磷脂酰膽堿和副產(chǎn)物溶血磷脂酰膽堿的級分,去除溶劑后,得到磷脂型dha。

4、根據(jù)本發(fā)明的一種分離純化磷脂型dha的柱層析法,該方法在硅膠柱層析中使用的流動相采用氯仿/甲醇體系,分離效果好,工藝簡單,得到的pc純度為98.85%,pc收率為88.89%,pc中dha含量為25.20%,磷脂型dha的提取率為71.77%,能夠為以后工業(yè)化分離純化高純度的磷脂型dha奠定基礎。

5、可選地,在色譜柱填料為25g硅膠、硅膠目數(shù)為300-400目、上樣量為0.3g-2g、洗脫液為氯仿:甲醇=1:2-1:5、上樣濃度為50mg/ml-150mg/ml的條件下進行硅膠柱色譜純化。

6、進一步,在色譜柱填料為25g硅膠、硅膠目數(shù)為300-400目、上樣量為0.6g、洗脫液為氯仿:甲醇=1:4、上樣濃度為100mg/ml的條件下進行硅膠柱色譜純化。

7、可選地,收集洗脫有磷脂酰膽堿和副產(chǎn)物溶血磷脂酰膽堿的級分為收集前60ml-195ml洗脫液。

8、可選地,所述進料原料中dha的含量為31.2%,pc的含量為74.79%。

9、可選地,將磷脂酰膽堿pc與藻油dha按照質(zhì)量比1:8加入到三角瓶中,并添加正己烷,加入固定化脂肪酶b和分子篩,充入n2后,50℃、200rpm的條件下反應72h,得到反應產(chǎn)物;

10、通過抽濾將所述反應產(chǎn)物中的分子篩和固定化脂肪酶去除,收集濾液后50℃下旋蒸脫溶,加入4倍體積的冷丙酮,得到丙酮不溶物,在4℃、6000rpm條件下離心10min,傾倒上層液體,用n2吹干殘存丙酮,得到所述進料原料。

11、進一步,所述磷脂酰膽堿與所述正己烷的比例為1:50m/v;所述固定化脂肪酶b的加入量為25%的總底物質(zhì)量;所述所述磷脂酰膽堿與所述正己烷的比例為0.02g/ml。

12、本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點將在下面的描述中部分給出,部分將從下面的描述中變得明顯,或通過本發(fā)明的實踐了解到。



技術(shù)特征:

1.一種分離純化磷脂型dha的柱層析法,其特征在于,包括:

2.如權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,在色譜柱填料為25g硅膠、硅膠目數(shù)為300-400目、上樣量為0.3g-2g、洗脫液為氯仿:甲醇=1:2-1:5、上樣濃度為50mg/ml-150mg/ml的條件下進行硅膠柱色譜純化。

3.如權(quán)利要求2所述的方法,其特征在于,在色譜柱填料為25g硅膠、硅膠目數(shù)為300-400目、上樣量為0.6g、洗脫液為氯仿:甲醇=1:4、上樣濃度為100mg/ml的條件下進行硅膠柱色譜純化。

4.如權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,收集洗脫有磷脂酰膽堿和副產(chǎn)物溶血磷脂酰膽堿的級分為收集前60ml-195ml洗脫液。

5.如權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,所述進料原料中dha的含量為31.2%,pc的含量為74.79%。

6.如權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,將磷脂酰膽堿pc與藻油dha按照質(zhì)量比1:8加入到三角瓶中,并添加正己烷,加入固定化脂肪酶b和分子篩,充入n2后,50℃、200rpm的條件下反應72h,得到反應產(chǎn)物;

7.如權(quán)利要求6所述的方法,其特征在于,所述磷脂酰膽堿與所述正己烷的比例為1:50m/v;所述固定化脂肪酶b的加入量為25%的總底物質(zhì)量;所述所述磷脂酰膽堿與所述正己烷的比例為0.02g/ml。


技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種分離純化磷脂型DHA的柱層析法,包括:以由磷脂酰膽堿PC和藻油DHA經(jīng)固定化脂肪酶B催化合成的產(chǎn)物磷脂為進樣原料,以硅膠作為固定相,使用氯仿:甲醇的混合溶液作為洗脫劑進行洗脫,收集洗脫有磷脂酰膽堿和副產(chǎn)物溶血磷脂酰膽堿的級分,去除溶劑后,得到磷脂型DHA。該方法能夠得到收率較高、DHA提取率較高的磷脂型DHA,能夠為未來工業(yè)化生產(chǎn)高純磷脂型DHA提供技術(shù)支持。

技術(shù)研發(fā)人員:凌雪萍,張雨欣,盧英華,齊書華
受保護的技術(shù)使用者:廈門大學
技術(shù)研發(fā)日:
技術(shù)公布日:2024/10/21
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