本發(fā)明涉及醫(yī)藥，具體涉及一種外泌體富集多肽，以及使用該多肽進行外源靶點負載的基因工程化外泌體及其制備方法，和使用該負載外源靶點的外泌體的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、外泌體(exosome，exo)是細胞分泌的囊泡類小體，直徑為30nm～150nm，具有典型的脂質(zhì)雙分子層膜結(jié)構(gòu)，存在于細胞培養(yǎng)上清液、血漿、血清、唾液、尿液以及羊水等各種生物體液中，在機體多種生理和病理過程中發(fā)揮重要作用，是近些年來生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點。有研究表明外泌體在-80℃保存2年仍能保持其生物學(xué)功能。此外，外泌體由于其天然來源于細胞的膜結(jié)構(gòu)，易于穿過血腦屏障，具有潛在的治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的能力。

2、近年來，越來越多的研究表明外泌體可作為細胞間重要的信息傳遞系統(tǒng)參與機體免疫調(diào)節(jié)過程。外泌體可通過與靶細胞的胞膜直接融合，釋放mrna、microrna進入細胞質(zhì)，或是通過內(nèi)吞作用被靶細胞攝取以及識別細胞表面的特異性受體調(diào)節(jié)免疫。

3、使用生物工程技術(shù)能夠改善外泌體的性能，比如通過基因工程將引導(dǎo)蛋白或多肽的基因序列與所選擇的外泌體膜蛋白的基因序列融合，對外泌體進行表面工程化修飾，增強外泌體對器官或組織的靶向性或提高靶細胞攝取外泌體的能力；在外泌體膜上或內(nèi)部高表達某些功能性核酸或蛋白，可以有效轉(zhuǎn)運mrna、microrna及蛋白質(zhì)等生物活性物質(zhì)，提高外泌體對特定疾病的治療效果。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明涉及一種能在外泌體上富集的多肽，其與前列腺素f2受體負調(diào)節(jié)因子(ptgfrn)具有同源性。所述多肽能在外泌體膜上高度富集，將外源性蛋白與該多肽融合表達后，外源性蛋白可高度富集于外泌體的膜外表面或膜內(nèi)腔，并行使該外源性蛋白的生物學(xué)功能。

2、本發(fā)明的第一個方面是提供一種多肽，其具有21～66個氨基酸，并至少包含如seqid?no:19所示的氨基酸序列。seq?id?no:19如下所示：lligvglstvigllscligyc。所述多肽可以高度富集于外泌體膜上，在外泌體膜上形成一次跨膜結(jié)構(gòu)，其中n端為膜外端，c端為膜內(nèi)端。將外源性蛋白通過基因工程的方法連接到所述多肽的n端和/或c端，可以實現(xiàn)將外源性蛋白富集表達于外泌體的膜外表面和/或膜內(nèi)腔，賦予所述外泌體由外源性蛋白帶來的生物學(xué)功能。

3、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述多肽具有與seq?id?no:1所示的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或約100％同一性的氨基酸序列。在本發(fā)明的一個實施方式中，所述多肽具有如seq?id?no:1所示的氨基酸序列。seq?idno:1如下所示skpvfitvkmdvlnafkyplligvglstvigllscligycsshwcckkevqetrrerrrlmsmemd。

4、本發(fā)明的第二個方面是提供一種融合蛋白，所述融合蛋白包含本發(fā)明的第一個方面所述的多肽以及至少一個外源蛋白。

5、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述至少一個外源蛋白連接于所述多肽的n端，經(jīng)由所述多肽，外源蛋白表達于外泌體的膜外表面，所述至少一個外源蛋白相同或不同。

6、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述至少一個外源蛋白連接于所述多肽的c端，經(jīng)由所述多肽，外源蛋白表達于外泌體的膜內(nèi)，所述至少一個外源蛋白相同或不同。

7、在本發(fā)明的一些實施方式中，至少一個第一外源蛋白和至少一個第二外源蛋白分別連接于所述多肽的n端和c端，經(jīng)由所述多肽，所述第一外源蛋白和第二外源蛋白中連接于所述多肽n端的被表達于外泌體的膜外表面，連接于所述多肽c端的被表達于外泌體的膜內(nèi)腔。所述第一外源蛋白和第二外源蛋白相同或不同。

8、根據(jù)本發(fā)明，所述外源蛋白可以選自具有生物學(xué)活性的任意蛋白，包括但不限于：抗體或其片段、酶、配體、受體或其片段等，例如il-10、na-1、atad1等。在本發(fā)明的一個實施例中，所述外源蛋白是il-10，優(yōu)選，兩個il-10通過連接子結(jié)構(gòu)串聯(lián)形成二聚體連接在所述多肽的n端。在本發(fā)明的一個實施方式中，所述連接子的氨基酸序列為gsggsggsggsggsg，使用該連接子將兩個il-10串聯(lián)連接形成二聚體。在本發(fā)明的一個實施方式中，il-10的氨基酸序列如seq?id?no.5所示。在本發(fā)明的一個實施例中，所述外源蛋白是na-1和atad1，優(yōu)選，3個na-1串聯(lián)連接在所述多肽的n端，刪除信號肽的atad1連接在所述多肽的c端。在本發(fā)明的一個實施方式中，3個串聯(lián)的na-1的氨基酸序列如seq?id?no.11所示，刪除信號肽的atad1的氨基酸序列如seq?id?no.13所示。

9、根據(jù)本發(fā)明，所述外源性蛋白可以直接與所述多肽連接，或者，通過連接子與所述多肽連接。所述連接子可以是本領(lǐng)域常用的接頭多肽序列，包括但不限于gs連接序列，ddk連接序列，或者這些連接序列的組合。在本發(fā)明的一個實施方式中，所述連接子的氨基酸序列包括g4s，例如為g4s-g4s。在本發(fā)明的另一個實施方式中，所述連接子的氨基酸序列為ggggsdykddddkggggs。

10、本發(fā)明還提供了一種核酸，所述核酸編碼本發(fā)明的第一個方面所述的多肽或本發(fā)明的第二個方面所述的融合蛋白。

11、本發(fā)明還提供了一種表達載體，所述表達載體包含上文所述的核酸。在一些實施方案中，載體是質(zhì)粒載體或病毒載體。在一些實施方案中，病毒載體包括但不限于慢病毒表達載體(例如plvx-ires-zsgreeen1、plvx-ires-puromycin、plvx-p2a/t2a-zsgreeen1、plvx-p2a/t2a-puromycin等。

12、本發(fā)明還提供了一種宿主細胞，所述宿主細胞包含上文所述的表達載體或其基因組中整合了上文所述的核酸。在一些實施方案中，所述宿主細胞是真核細胞。在一些實施方案中，所述宿主細胞是哺乳動物細胞。在一些實施方案中，所述哺乳動物細胞是中國倉鼠卵巢(cho)細胞。在一些實施方案中，所述哺乳動物細胞是人體細胞。在一些實施方案中，所述哺乳動物細胞是293t細胞。在一些實施方案中，所述宿主細胞是正常體細胞或/和干細胞，包括但不限于血管內(nèi)皮細胞、樹突狀細胞、t細胞(例如foxp3+treg細胞)、神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞、胚胎干細胞、成體干細胞(例如造血干細胞，神經(jīng)干細胞，來源于骨髓、臍帶、脂肪、臍帶血、羊膜、(胎盤)絨毛膜、牙髓、胸腺、滑膜等的間充質(zhì)干細胞等)等。

13、本發(fā)明的第三個方面是提供一種工程化外泌體，所述外泌體包含本發(fā)明第一個方面所述的多肽或本發(fā)明第二個方面所述的融合蛋白。

14、根據(jù)本發(fā)明，所述工程化外泌體包含所述多肽，所述多肽在所述外泌體的膜上形成一次跨膜結(jié)構(gòu)，其中n端為膜外端，c端為膜內(nèi)端。

15、根據(jù)本發(fā)明，所述工程化外泌體包含所述融合蛋白，所述融合蛋白包含所述多肽，且在所述多肽的n端和/或c端進一步連接有至少一個外源蛋白。所述外源蛋白直接或者通過連接子與所述多肽連接，從而使得外源蛋白被表達于所述外泌體的膜外表面和/或膜內(nèi)腔。

16、根據(jù)本發(fā)明，所述連接子可以是本領(lǐng)域常用的接頭多肽序列，包括但不限于gs連接序列，ddk連接序列，或者這些連接序列的組合。在本發(fā)明的一個實施方式中，所述連接子的氨基酸序列包含g4s，例如為g4s-g4s。在本發(fā)明的另一個實施方式中，所述連接子的氨基酸序列為ggggsdykddddkggggs。

17、根據(jù)本發(fā)明，所述外源蛋白可以選自具有生物學(xué)活性的任意蛋白，包括但不限于：抗體或其片段、酶、配體、受體或其片段等，例如il-10、na-1、atad1等。在本發(fā)明的一個實施例中，所述外源蛋白是il-10，優(yōu)選，兩個il-10通過連接子結(jié)構(gòu)串聯(lián)形成二聚體。在本發(fā)明的一個實施例中，所述外源蛋白是na-1和atad1。

18、在本發(fā)明的一個實施方式中，所述工程化外泌體包含本發(fā)明第二個方面所述的融合蛋白，所述融合蛋白包含所述多肽和外源蛋白，所述外源蛋白為il-10；所述多肽在所述外泌體的膜上形成一次跨膜結(jié)構(gòu)，其中n端為膜外端，c端為膜內(nèi)端，所述多肽的n端通過連接子連接il-10。根據(jù)本發(fā)明，所述il-10可以是一個或兩個以上，當有兩個以上的il-10時，il-10之間也通過連接子進行串聯(lián)連接。在本發(fā)明的一個實施方式中，所述連接子的氨基酸序列為gsggsggsggsggsg，使用該連接子將兩個il-10串聯(lián)連接形成二聚體。在本發(fā)明的一個實施方式中，連接il-10和所述多肽的連接子的氨基酸序列為g4s-g4s。在本發(fā)明的一個實施方式中，il-10的氨基酸序列如seq?id?no.5所示。

19、在本發(fā)明的一個實施方式中，所述工程化外泌體包含本發(fā)明第二個方面所述的融合蛋白，所述融合蛋白包含所述多肽和外源蛋白，所述外源蛋白為na-1和atad1，所述多肽在所述外泌體的膜上形成一次跨膜結(jié)構(gòu)，其中n端為膜外端，c端為膜內(nèi)端，所述多肽的n端通過連接子連接na-1，所述多肽的c端直接連接atad1。在本發(fā)明的一個實施方式中，所述連接子的氨基酸序列為ggggsdykddddkggggs。在本發(fā)明的一個實施方式中，3個na-1串聯(lián)連接在所述多肽的n端，刪除信號肽的atad1連接在所述多肽的c端。在本發(fā)明的一個實施方式中，3個串聯(lián)的na-1的氨基酸序列如seq?id?no.11所示，刪除信號肽的atad1的氨基酸序列如seq?id?no.13所示。

20、本發(fā)明的第四個方面是提供所述工程化外泌體在制備藥物中的應(yīng)用。

21、在本發(fā)明的一個實施方式中，所述工程化外泌體包含本發(fā)明第一個方面所述的多肽，所述多肽在所述外泌體的膜上形成一次跨膜結(jié)構(gòu)，其中n端為膜外端，c端為膜內(nèi)端，所述多肽的n端或c端直接或通過連接子連接外源蛋白，所述外源蛋白選自具有生物學(xué)活性的任意蛋白，包括：抗體或其片段、酶、配體、受體或其片段。

22、優(yōu)選的，所述外源蛋白為il-10，所述藥物可用于治療或改善炎性反應(yīng)。所述的炎性反應(yīng)包括但不限于自身免疫性炎性反應(yīng)(例如潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病等)，由病原體感染導(dǎo)致的炎性反應(yīng)(例如病原體感染導(dǎo)致的肺部損傷)。所述治療包括但不限于降低炎癥反應(yīng)時組織或血液中的gm-csf、tnf-α、ccl2、ccl3、il-2、il-6、il-1β和/或cxcl10，尤其是降低tnf-α、ccl2和/或ccl3的水平。

23、優(yōu)選的，所述外源蛋白為na-1和atad1，所述多肽的n端通過連接子連接na-1，所述多肽的c端直接連接atad1。所述藥物可用于神經(jīng)營養(yǎng)、神經(jīng)保護和/或治療神經(jīng)損傷。

24、本發(fā)明的第五個方面是提供所述工程化外泌體的制備方法，包括：

25、1)構(gòu)建表達載體，所述表達載體包含編碼所述多肽或所述融合蛋白的核苷酸序列；

26、2)將所述表達載體轉(zhuǎn)染宿主細胞；

27、3)分離和收集轉(zhuǎn)染后的細胞的外泌體。

28、根據(jù)本發(fā)明，所述宿主細胞可以是人或哺乳動物的細胞。所述哺乳動物，包括但不限于牛、羊、馬、豬等有蹄類，兔、大鼠、小鼠、豚鼠等嚙齒類，猴、猩猩等靈長類，貓、狗等。

29、所述宿主細胞可以是正常體細胞或/和干細胞，包括但不限于血管內(nèi)皮細胞、樹突狀細胞、t細胞(例如foxp3+treg細胞)、神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞、胚胎干細胞、成體干細胞(例如造血干細胞，神經(jīng)干細胞，來源于骨髓、臍帶、脂肪、臍帶血、羊膜、(胎盤)絨毛膜、牙髓、胸腺、滑膜等的間充質(zhì)干細胞等)等。

30、還可以利用誘導(dǎo)性多能干細胞(induced?pluripotent?stem?cells，ipscs)技術(shù)通過導(dǎo)入特定的基因(如oct4、sox2、klf4、c-myc等)將終末分化的體細胞重編程為多能性干細胞，以ipscs為宿主細胞得到來源于ipscs的外泌體，在本發(fā)明中將ipscs的外泌體簡寫為“ipsc-exos”。利用ipsc技術(shù)，可以用病人自己的體細胞制備專有的誘導(dǎo)性多能干細胞，再由患者的專有誘導(dǎo)性多能干細胞獲得外泌體，用于患者自身，可以大大降低免疫排斥反應(yīng)發(fā)生的可能性。

31、所述宿主細胞還可以通過生物工程技術(shù)改造，以高表達其他的某個或某些蛋白質(zhì)、rna，或/和，低表達其他的另一個或另一些蛋白質(zhì)、rna，以實現(xiàn)來源于被改造細胞的外泌體中所述的蛋白質(zhì)含量增高或/和降低，以達到更優(yōu)的治療目的或活性。可以采用本領(lǐng)域已知的生物工程技術(shù)，例如，將攜帶目標蛋白質(zhì)dna的載體或mrna轉(zhuǎn)染細胞，在細胞中實現(xiàn)目標蛋白質(zhì)表達量的提高。將攜帶目標基因的sirna或shrna的載體轉(zhuǎn)染細胞，在細胞中實現(xiàn)沉默目標基因表達，以降低相應(yīng)蛋白質(zhì)的表達量。

32、所述表達載體可以是本領(lǐng)域常用的表達載體，包括但不限于慢病毒表達載體(例如plvx-ires-zsgreeen1、plvx-ires-puromycin、plvx-p2a/t2a-zsgreeen1、plvx-p2a/t2a-puromycin等)。

33、外泌體可以通過體外培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的細胞，經(jīng)細胞自分泌的方式，從細胞培養(yǎng)液中分離制備得到。每類細胞的培養(yǎng)可以采用本領(lǐng)域已知的方法和培養(yǎng)基進行。例如：人皮膚成纖維細胞培養(yǎng)基可以是dmem+15％fbs+neaa，臍帶間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基可以是dmem+10％fbs，神經(jīng)元細胞培養(yǎng)基可以是b27+neurobasal+glutamax。

34、為了提高細胞培養(yǎng)物中外泌體的產(chǎn)量，可以根據(jù)被培養(yǎng)細胞的特點，調(diào)整其培養(yǎng)基中化學(xué)物質(zhì)的含量，例如：保留培養(yǎng)基中細胞生長必需的化學(xué)物質(zhì)，去除或降低培養(yǎng)中細胞生長非必需化學(xué)物質(zhì)或其含量，使細胞處于“饑餓”狀態(tài)，以達到提高培養(yǎng)物中外泌體產(chǎn)量的效果。例如，對于培養(yǎng)干細胞以獲得干細胞外泌體為例，可以在干細胞的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，例如dmem，f12或者dmem/f12的基礎(chǔ)上，添加l-抗壞血酸或其鹽、硒或其鹽、胰島素等，誘導(dǎo)干細胞大量分泌外泌體。例如中國專利申請cn112920991a中記載的外泌體分泌誘導(dǎo)劑，該專利申請的全文引入本技術(shù)。

35、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述細胞是人間充質(zhì)干細胞或esc(胚胎干細胞)或ipsc。由所述細胞獲得外泌體的制備方法可以為：在相應(yīng)細胞的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入l-抗壞血酸或其鹽、硒或其鹽、以及胰島素，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基ph為7.0-7.5，得到能獲得高產(chǎn)量外泌體的細胞培養(yǎng)基，采用所述細胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)人間充質(zhì)干細胞或esc(胚胎干細胞)或ipsc，獲取細胞培養(yǎng)上清，從中分離得到相應(yīng)細胞的外泌體。所述獲取細胞培養(yǎng)上清的操作，可以在培養(yǎng)結(jié)束前，間隔適當時間重復(fù)進行，例如培養(yǎng)期間每天獲取細胞培養(yǎng)上清。可采用本領(lǐng)域常用的ph調(diào)節(jié)劑對培養(yǎng)基ph進行調(diào)節(jié)，包括但不限于碳酸鹽或碳酸氫鹽，例如na2co3、k2co3、nahco3、khco3等。在本發(fā)明的一個實施方式中，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入濃度為30-100mg/l的l-抗壞血酸或其鹽、濃度為5-50μg/l的硒或其鹽、濃度為10-30mg/l的胰島素，并調(diào)節(jié)培養(yǎng)基ph為7.0-7.5。在本發(fā)明的一個實施方式中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基是dmem。在本發(fā)明的另一個實施方式中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基是dmem/f12。

36、在本發(fā)明的一個具體實施方式中，所述細胞是ipsc(例如可以是從人外周血細胞誘導(dǎo)而來的ipsc)，以dmem/f12為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入濃度為50-75mg/l的l-抗壞血酸或其鹽(例如l-抗壞血酸二磷酸鎂鹽)、濃度為10-20μg/l的硒或其鹽(例如鈉硒)、濃度為15-25mg/l的胰島素，調(diào)節(jié)ph為7.0-7.5，得到能獲得高產(chǎn)量外泌體的細胞培養(yǎng)基，用所述細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)ipsc，從培養(yǎng)開始后的15～30小時開始，至培養(yǎng)結(jié)束，每間隔20～25小時，獲取細胞培養(yǎng)上清，從中分離得到外泌體。

37、本發(fā)明的第六個方面是提供一種藥物組合物，所述藥物組合物包含本發(fā)明第三個方面所述的工程化外泌體。

38、根據(jù)本發(fā)明，所述藥物組合物，還包含藥學(xué)上可接受的賦形劑。所述藥物組合物可以采用本領(lǐng)域已知的各種制劑形式，例如：液體制劑(包括但不限于混懸液)、固體制劑(包括但不限于片劑、粉針劑等)、半固體制劑(包括但不限于膏劑)。在本發(fā)明的一種實施方式中，所述藥物組合物是混懸液，含有所述工程化外泌體和緩沖液，所述緩沖液可以是本領(lǐng)域常用的緩沖液，包括但不限于pbs緩沖液，dpbs緩沖液，tris緩沖液，hepes緩沖液，磷酸鈉，檸檬酸鈉，琥珀酸鈉，組氨酸(或組氨酸-hcl)，蘋果酸鈉，碳酸鈉等。在本發(fā)明的一種實施方式中，所述藥物組合物是凍干制劑，含有所述工程化外泌體和冷凍保護劑，所述冷凍保護劑可以是本領(lǐng)域常用的冷凍保護劑，包括但不限于甘露醇，蔗糖，海藻糖，乳糖，甘油，右旋糖等。對于凍干制劑，可以在使用前添加注射用水或緩沖液復(fù)建成混懸液。

39、根據(jù)本發(fā)明，所述藥物組合物中，所述工程化外泌體的含量可以為100～50000μg，例如200～40000μg，350～35000μg。當所述藥物組合物為混懸液時，所述工程化外泌體的濃度可以為0.01-20μg/ml，例如0.01-10μg/ml，0.1-5μg/ml等。

40、根據(jù)本發(fā)明，所述工程化外泌體或包含所述工程化外泌體的藥物組合物的給藥方式可以采用本領(lǐng)域中已知的各種給藥方式進行給藥，例如口服、鼻腔給藥、皮下注射、外用或靜脈注射給藥等。

41、本發(fā)明的第七個方面是提供一種疾病治療方法，給予有治療需要的患者有效量的本發(fā)明第三方面所述的工程化外泌體，或者本發(fā)明第六方面所述的藥物組合物。

42、在本發(fā)明的一個實施方式中，所述工程化外泌體包含本發(fā)明第二個方面所述的融合蛋白。所述融合蛋白包含所述多肽以及外源性蛋白。所述多肽在所述外泌體的膜上形成一次跨膜結(jié)構(gòu)，其中n端為膜外端，c端為膜內(nèi)端。所述外源性蛋白為il-10。所述多肽的n端通過連接子連接il-10。所述疾病是炎性反應(yīng)。所述的炎性反應(yīng)包括但不限于自身免疫性炎性反應(yīng)(例如潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病等)，由病原體感染導(dǎo)致的炎性反應(yīng)(例如病原體感染導(dǎo)致的肺部損傷)，所示治療包括但不限于降低炎癥反應(yīng)時組織或血液中的gm-csf、tnf-α、ccl2、ccl3、il-2、il-6、il-1β和/或cxcl10，尤其是降低tnf-α、ccl2和/或ccl3的水平。

43、在本發(fā)明的一個實施方式中，所述工程化外泌體的膜上表達本發(fā)明第二個方面所述的融合蛋白。所述融合蛋白包含所述多肽以及外源性蛋白。所述多肽在所述外泌體的膜上形成一次跨膜結(jié)構(gòu)，其中n端為膜外端，c端為膜內(nèi)端。所述外源性蛋白為na-1和atad1。所述多肽的n端通過連接子連接na-1，所述多肽的c端連接atad1。所述疾病是神經(jīng)損傷。

44、本發(fā)明的多肽能夠富集于外泌體膜上，且能攜帶各類長短不同的外源性蛋白，使其富集于外泌體膜外表面或膜內(nèi)腔。

45、在本發(fā)明中，可以采用本領(lǐng)域的各種外泌體分離方法，從細胞培養(yǎng)液中分離獲得外泌體。

46、外泌體可通過差速超速離心在不同離心力下沉淀樣品中不同的雜質(zhì)組分,并在100000×g～200000×g的轉(zhuǎn)速下獲取較純的外泌體，是目前最常用的外泌體分離和濃縮方法。該方法可通過結(jié)合0.22μm或0.45μm孔徑濾膜進行超濾來提高產(chǎn)物純度減少外泌體的聚集。

47、外泌體作為細胞外囊泡的一個亞群，直徑集中于30～150nm，還可以基于粒徑大小分離外泌體，方法有超濾法、尺寸排除色譜法、靜水過濾透析法和非對稱場流分離法等。

48、還可以采用商業(yè)化外泌體提取試劑盒如exo-spintm、exoquicktm、invitrogentm等產(chǎn)品來分離外泌體。

49、提取后的外泌體可以懸浮于緩沖液中，例如磷酸鹽緩沖液，在-80℃～4℃下冷凍保存。也可以在添加冷凍保護劑的情況下經(jīng)凍干以凍干形式保存，冷凍保護劑例如海藻糖等。

50、術(shù)語定義：

51、“和/或”將被視為具有或不具有另一個的兩個指定特征或組件中的每一個的具體公開。因此，在諸如“a和/或b”之類的短語中使用的術(shù)語“和/或”旨在包括“a和b”、“a或b”、“a”(單獨)和“b”(單獨)。同樣地，在諸如“a、b和/或c”的短語中使用的術(shù)語“和/或”旨在涵蓋以下方面中的每一個：a、b和c；a、b或c；a或c；a或b；b或c；a和c；a和b；b和c；a(單獨)；b(單獨)；和c(單獨)。

52、“包括”和“包含”具有相同的含義，旨在是開放的并且允許但不要求包括額外的元件或步驟。當在本文中使用術(shù)語“包括”或“包含”時，因此也包括和公開了術(shù)語“由......組成”和/或“基本上由……組成”。

53、同源性：如本文所用，術(shù)語“同源性”是指聚合物分子之間的總體相關(guān)性，例如，在核酸分子(例如dna分子和/或rna分子)之間和/或在多肽分子之間。通常，術(shù)語“同源性”意味著兩個分子之間的進化關(guān)系。因此，兩個同源的分子將具有共同的進化祖先。在本公開的背景下，術(shù)語同源性包括同一性和相似性。

54、在一些實施方案中，如果分子中至少25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的單體是相同的(完全相同的單體)或相似(保守置換)，聚合物分子被認為是彼此“同源的”。術(shù)語“同源的”必然是指至少兩個序列(多核苷酸或多肽序列)之間的比較。

55、同一性：如本文所用，術(shù)語“同一性”是指聚合物分子之間，例如多核苷酸分子(例如dna分子和/或rna分子)之間和/或多肽分子之間的整體單體保守性。例如，可以通過以進行最佳比較目的比對兩個序列來進行兩個多核苷酸序列的百分同一性的計算(例如，可以在第一和第二核酸序列之一或兩個中引入空位用于最佳比對和非相同的序列可以對于比較目的放棄。在某些實施方案中，為了比較目的而比對的序列的長度是參考序列長度的至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％或100％。然后比較相應(yīng)核苷酸位置的核苷酸。當?shù)谝恍蛄兄械奈恢帽慌c第二序列中的相應(yīng)位置相同的核苷酸占據(jù)時，那么分子在該位置是相同的。兩個序列之間的百分同一性是序列共有的相同位置的數(shù)目的函數(shù)，考慮到需要引入以實現(xiàn)兩個序列的最佳比對的空位的數(shù)量和每個空位的長度。可以使用數(shù)學(xué)算法完成序列的比較和兩個序列之間的百分同一性的確定。當比較dna和rna時，胸腺嘧啶(t)和尿嘧啶(u)可被認為是等同的。

56、合適的軟件程序可從各種來源獲得，并用于蛋白質(zhì)和核苷酸序列兩者的比對。例如，bl2seq，needle，stretcher，water或matcher等。序列比對可以使用本領(lǐng)域已知的方法進行，例如mafft，clustal(clustalw，clustal?x或clustal?omega)，muscle等。

57、“藥學(xué)上可接受的賦形劑”是指除本文所述外泌體之外的任何成分，并且在患者中具有基本上無毒和非炎性的性質(zhì)，包括但不限于任何和所有溶劑、分散介質(zhì)或其他液體載體、分散或懸浮助劑、稀釋劑、等滲劑、防腐劑、著色劑、甜味劑或調(diào)味劑、穩(wěn)定劑、抗氧化劑、抗微生物劑或抗真菌劑、摩爾滲透壓濃度調(diào)節(jié)劑、ph調(diào)節(jié)劑、緩沖劑、螯合劑、冷凍保護劑和/或填充劑，如適合于所需的特定劑型的。用于配制藥物組合物的各種賦形劑和用于制備組合物的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。示例性抗微生物劑或抗真菌劑包括但不限于苯扎氯銨，芐索氯銨，對羥基苯甲酸甲酯，對羥基苯甲酸乙酯，對羥基苯甲酸丙酯，對羥基苯甲酸丁酯，苯甲酸，羥基苯甲酸，苯甲酸鉀或苯甲酸鈉，山梨酸鉀或鈉，丙酸鈉，山梨酸等，以及它們的組合。示例性防腐劑包括但不限于，維生素a，維生素c，維生素e，β-胡蘿卜素，檸檬酸，抗壞血酸等，以及它們的組合?？刂苝h的示例性緩沖液可包括但不限于磷酸鈉，檸檬酸鈉，琥珀酸鈉，組氨酸(或組氨酸-hcl)，蘋果酸鈉，碳酸鈉等，和/或其組合。示例性的冷凍保護劑包括但不限于甘露醇，蔗糖，海藻糖，乳糖，甘油，右旋糖等，以及它們的組合。