本發(fā)明涉及微生物分離鑒定技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種諾麗內(nèi)生真菌的分離鑒定方法。

背景技術(shù)：

植物內(nèi)生真菌(endophyticfungi)是指那些生活在地上部分且活的植物組織體內(nèi)，但不引起宿主植物患病的一類有益真菌。因此，植物內(nèi)生真菌是植物體內(nèi)微生態(tài)系統(tǒng)中的天然組成成分，其長(zhǎng)期生活在植物體內(nèi)這種特殊環(huán)境中，不會(huì)導(dǎo)致植物患病，反而與宿主植物協(xié)同進(jìn)化，并在演化過(guò)程中逐漸形成互惠共生的關(guān)系。藥用植物內(nèi)生真菌的次生代謝產(chǎn)物十分豐富，具有抗菌、抗腫瘤、抗病毒、殺蟲、調(diào)節(jié)免疫及促進(jìn)植物生長(zhǎng)等生物活性，是篩選生物活性成分或先導(dǎo)化合物的有效途徑之一，在工業(yè)發(fā)酵、生物制藥、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

諾麗(morindacitrifolialinn.)是茜草科巴戟天屬的植物，在熱帶地區(qū)有著悠久的食用歷史，最早可追溯到317世紀(jì)晚期。1943年，美國(guó)政府將諾麗果認(rèn)定為可食用植物資源；2003年，歐盟委員會(huì)提名諾麗果汁為一種新資源食品；2010年5月，中國(guó)衛(wèi)生部批準(zhǔn)諾麗果漿為新資源食品?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)和生物學(xué)研究證明，諾麗果和果汁對(duì)某些疾病具有一定的治療和輔助治療作用，如抗腫瘤、提高免疫力、抗氧化、護(hù)肝、抗菌消炎、改善糖尿病、抗血脂、降血壓、改善痛風(fēng)等。近幾年來(lái)，隨著研究的不斷深入和新功能的不斷發(fā)現(xiàn)，諾麗果已經(jīng)成為世界藥用植物和保健飲料的新寵。

諾麗因其卓有特效的抗癌效果而屢遭砍伐及毀滅性利用，加上種群分布的局限性，使得該植物種質(zhì)資源并不豐富，甚至于處于瀕危滅絕的邊緣。由于內(nèi)生真菌具有產(chǎn)生和寄主植物一樣的次生代謝產(chǎn)物和活性成分，且分離純化的內(nèi)生真菌能通過(guò)發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)相應(yīng)的活性物質(zhì)，內(nèi)生真菌的藥用價(jià)值已成為國(guó)際熱點(diǎn)，需最大可能地保留內(nèi)生真菌不被殺滅。目前內(nèi)生真菌常采用組織分離法分離，其缺陷有：(1)表面過(guò)分消毒，殺死部分內(nèi)生真菌；(2)表面消毒不充分，表面菌污染；(3)生長(zhǎng)快的內(nèi)生真菌覆蓋一些生長(zhǎng)緩慢的真菌；(4)所用培養(yǎng)基不能確保所有內(nèi)生真菌都生長(zhǎng)。諾麗內(nèi)生真菌的藥用潛力并沒(méi)有實(shí)現(xiàn)較大程度的挖掘。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種諾麗內(nèi)生真菌的分離鑒定方法。本發(fā)明提供的方法能夠?qū)崿F(xiàn)諾麗內(nèi)生真菌的有效分離和鑒定，為抗癌、抗炎藥物研發(fā)提供新思路。

本發(fā)明提供了一種諾麗內(nèi)生真菌的分離鑒定方法，包括以下步驟：

1)對(duì)諾麗果和葉進(jìn)行表面消毒；

2)將諾麗果和葉的內(nèi)部組織置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，25±1℃黑暗條件下培養(yǎng)8～10天；

3)將步驟2)培養(yǎng)得到的菌株進(jìn)行傳代培養(yǎng)，通過(guò)4～5次連續(xù)的菌絲尖端轉(zhuǎn)移進(jìn)行純化，得到諾麗內(nèi)生真菌；

4)對(duì)步驟3)得到的諾麗內(nèi)生真菌進(jìn)行its測(cè)序鑒定。

優(yōu)選的是，所述步驟1)中的諾麗果和葉為八成熟。

優(yōu)選的是，所述步驟1)的表面消毒包括次氯酸鈉溶液消毒和乙醇溶液消毒。

優(yōu)選的是，所述次氯酸鈉溶液中次氯酸鈉的質(zhì)量濃度為2.6～3.5％，所述乙醇溶液中乙醇的質(zhì)量濃度為75％。

優(yōu)選的是，次氯酸鈉溶液消毒的時(shí)間為60～300s，乙醇溶液消毒的時(shí)間為30～180s。

優(yōu)選的是，所述步驟1)的表面消毒后還包括：采用無(wú)菌水對(duì)諾麗果和葉清洗2～4次。

優(yōu)選的是，步驟2)得到的諾麗果和葉的邊緣部分采用組織印跡法進(jìn)行無(wú)菌檢測(cè)。

優(yōu)選的是，所述步驟3)得到的諾麗內(nèi)生真菌后還包括：將諾麗內(nèi)生真菌在馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，所述培養(yǎng)條件為25±1℃，20rpm進(jìn)行液體暗培養(yǎng)。

優(yōu)選的是，所述步驟4)的its測(cè)序鑒定基于核糖體its區(qū)域的its1f和its4基因序列。

優(yōu)選的是，所述its測(cè)序鑒定用引物如seqidno：1和seqidno：2所示。

本發(fā)明提供了一種諾麗內(nèi)生真菌的分離鑒定方法，實(shí)現(xiàn)了內(nèi)生真菌的有效分離、純化和鑒定。本發(fā)明提供的植物樣品表面消毒方法既能保證充分消毒，達(dá)到有效去除表面污染菌的目的，又能避免過(guò)度的表面消毒，將部分內(nèi)生真菌殺死，克服了現(xiàn)有植物內(nèi)生真菌分離方法存在的某些菌種丟失的缺陷。通過(guò)多次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，25±1℃既有利于內(nèi)生真菌的生長(zhǎng)又抑制內(nèi)生細(xì)菌的萌發(fā)，黑暗條件是模擬傳統(tǒng)發(fā)酵和植物自然生長(zhǎng)的條件，有利于內(nèi)生真菌的生長(zhǎng)，本發(fā)明采用25±1℃黑暗條件下培養(yǎng)8～10天。核糖體itsrdna區(qū)域與rdna的其他基因區(qū)相比，具有最佳的變異度和分辨率，能將諾麗內(nèi)生真菌進(jìn)行分子識(shí)別并鑒別到種的水平。我國(guó)許多珍稀植物資源不斷減少，甚至瀕臨滅絕。本發(fā)明提供的內(nèi)生真菌分離方法，能夠有效分離植物內(nèi)生真菌，通過(guò)發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)相應(yīng)的活性物質(zhì)，這對(duì)植物資源的保護(hù)和可持續(xù)利用具有重要的價(jià)值。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1提供的諾麗果和葉的內(nèi)生真菌的itsrdnapcr擴(kuò)增片段的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1提供的諾麗果和葉中分離得到的內(nèi)生真菌培養(yǎng)圖片。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供了一種諾麗內(nèi)生真菌的分離鑒定方法，包括以下步驟：

1)對(duì)諾麗果和葉進(jìn)行表面消毒；

2)將諾麗果和葉的內(nèi)部組織置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，25±1℃黑暗條件下培養(yǎng)8～10天；

3)將步驟2)培養(yǎng)得到的菌株進(jìn)行傳代培養(yǎng)，通過(guò)4～5次連續(xù)的菌絲尖端轉(zhuǎn)移進(jìn)行純化，得到諾麗內(nèi)生真菌；

4)對(duì)步驟3)得到的諾麗內(nèi)生真菌進(jìn)行its測(cè)序鑒定。

本發(fā)明對(duì)諾麗果和葉進(jìn)行表面消毒。在本發(fā)明中，優(yōu)選選取健康、八成熟的諾麗果和葉。在本發(fā)明中，所述諾麗果和葉優(yōu)選在用無(wú)菌水沖洗后進(jìn)行保存?zhèn)溆?，所述保存的溫度?yōu)選為4℃。

在本發(fā)明中，所述表面消毒包括次氯酸鈉溶液消毒和乙醇溶液消毒。在本發(fā)明中，所述次氯酸鈉溶液中次氯酸鈉的質(zhì)量濃度為2.6～3.5％，所述乙醇溶液中乙醇的質(zhì)量濃度為75％。

在本發(fā)明中，次氯酸鈉溶液消毒的時(shí)間為60～300s，乙醇溶液消毒的時(shí)間為30～180s。本發(fā)明優(yōu)選采用次氯酸鈉溶液和乙醇溶液進(jìn)行消毒，所述次氯酸鈉溶液的處理時(shí)間優(yōu)選獨(dú)立地選自60s、120s、180s、240s或300s；所述乙醇溶液的處理時(shí)間優(yōu)選獨(dú)立地選自30s、60s、90s、120s、150s或180s；即本發(fā)明優(yōu)選從上述30個(gè)組合中選取任意一種組合進(jìn)行諾麗果和葉的消毒，具體組合方式如下：次氯酸鈉溶液浸泡時(shí)間+乙醇溶液消毒時(shí)間：60s+30s、60s+60s、60s+90s、60s+120s、60s+150s、60s+180s；120s+30s、120s+60s、120s+90s、120s+120s、120s+150s、120s+180s；180s+30s、180s+60s、180s+90s、180s+120s、180s+150s、180s+180s；240s+30s、240s+60s、240s+90s、240s+120s、240s+150s、240s+180s；300s+30s、300s+60s、300s+90s、300s+120s、300s+150s、300s+180s。本發(fā)明優(yōu)選選取次氯酸鈉溶液浸泡時(shí)間+乙醇溶液消毒時(shí)間120s+30s、120s+60s、180s+30s、180s+60s、240s+30s、240s+60s、300s+30s、300s+60s進(jìn)行消毒，最優(yōu)選采用次氯酸鈉溶液浸泡時(shí)間+乙醇溶液消毒時(shí)間80s+180s、240s+150s、240s+180s、300s+90s、300s+120s、300s+150s、300s+180s進(jìn)行消毒。

在本發(fā)明中，所述表面消毒后，優(yōu)選采用無(wú)菌水對(duì)諾麗果和葉清洗2～4次，更優(yōu)選為3次。本發(fā)明在清洗后，優(yōu)選吸干水分，本發(fā)明對(duì)所述吸干的方法沒(méi)有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)水分吸干方法即可，如采用無(wú)菌濾紙吸干水分。

得到表面消毒后的諾麗果和葉，本發(fā)明將諾麗果和葉的內(nèi)部組織置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，25±1℃黑暗條件下培養(yǎng)8～10天。本發(fā)明優(yōu)選通過(guò)去除諾麗果和葉的邊緣部分以獲得諾麗果和葉的內(nèi)部組織，本發(fā)明對(duì)所述去除的方法沒(méi)有特殊的限定，具體的，本發(fā)明優(yōu)選采用滅菌手術(shù)刀去除諾麗果和葉的邊緣部分0.5～0.8cm。本發(fā)明得到諾麗果和葉的邊緣部分后，優(yōu)選對(duì)邊緣部分進(jìn)行無(wú)菌檢測(cè)。在本發(fā)明中，所述無(wú)菌檢測(cè)的方法優(yōu)選采用組織印跡法：將諾麗果和葉的邊緣部分置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(pda)固體培養(yǎng)基平板上，輕輕滾動(dòng)或緊貼培養(yǎng)基放置2min，接著移去諾麗果和葉的邊緣部分，在25±1℃、黑暗條件下恒溫培養(yǎng)8～10天，無(wú)雜菌長(zhǎng)出即說(shuō)明消毒后的果塊或葉塊表面無(wú)菌，驗(yàn)證表面無(wú)菌后，本發(fā)明將無(wú)菌的內(nèi)部組織進(jìn)行后續(xù)的處理。本發(fā)明采用組織塊印記法作對(duì)照，確保分離鑒定的是諾麗果和葉的內(nèi)生真菌，具有操作簡(jiǎn)單快捷、成本較低的優(yōu)勢(shì)。

本發(fā)明得到諾麗果和葉的內(nèi)部組織后，優(yōu)選將果內(nèi)部或中心部分切分成1cm×1cm大小的組織塊，葉內(nèi)部或中心部分切分成0.5cm×0.5cm大小的組織塊，本發(fā)明將組織塊置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上25℃黑暗條件下培養(yǎng)8～10天。本發(fā)明對(duì)所述pda培養(yǎng)基的制備方法沒(méi)有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的pda培養(yǎng)基即可，具體的，所述馬鈴薯葡萄糖瓊脂(pda)固體培養(yǎng)基的成分為：馬鈴薯浸粉3g、葡萄糖20g、瓊脂粉15g、氯霉素0.1g，每1000ml蒸餾水中加pda38g；使用前pda固體培養(yǎng)基在121℃、0.1mpa下滅菌20min。

本發(fā)明將上述培養(yǎng)得到的菌株分別傳代培養(yǎng)，通過(guò)4～5次連續(xù)的菌絲尖端轉(zhuǎn)移進(jìn)行純化，得到諾麗內(nèi)生真菌。在本發(fā)明中，所述諾麗內(nèi)生真菌在馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基(pdb)中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，所述傳代培養(yǎng)條件為25±1℃，20rpm進(jìn)行液體暗培養(yǎng)。本發(fā)明對(duì)所述pdb培養(yǎng)基的制備方法沒(méi)有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的pdb培養(yǎng)基即可，具體的，所述馬鈴薯葡萄糖肉湯(pdb)液體培養(yǎng)基的成分為：馬鈴薯浸粉5g、葡萄糖15g、蛋白胨10g、氯化鈉5g，每1000ml蒸餾水中加pdb35g；使用前pdb液體培養(yǎng)基在121℃、0.1mpa下滅菌20min。

得到諾麗內(nèi)生真菌后，本發(fā)明對(duì)諾麗內(nèi)生真菌進(jìn)行its測(cè)序鑒定。本發(fā)明的測(cè)序鑒定為對(duì)諾麗內(nèi)生真菌進(jìn)行進(jìn)一步分類。在本發(fā)明中，所述its測(cè)序鑒定基于核糖體its區(qū)域的its1f和its4基因序列。在本發(fā)明中，所述its測(cè)序鑒定用引物如seqidno：1和seqidno：2所示。所述引物的具體序列為its4：5’-tcctccgcttattgatatgc-3’(seqidno：1)；its1f：5’-cttggtcatttagaggaagtaa-3’(seqidno：2)。本發(fā)明所述引物擴(kuò)增得到的序列片段大小分別為700bp和500～700bp，條帶需單一明亮。本發(fā)明引物擴(kuò)增出的序列經(jīng)測(cè)序后語(yǔ)ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行blast比對(duì)，進(jìn)行菌種的鑒定。本發(fā)明對(duì)所述pcr的擴(kuò)增條件沒(méi)有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的基因擴(kuò)增方法條件即可。本發(fā)明優(yōu)選選取諾麗內(nèi)生真菌的基因組dna為模板進(jìn)行擴(kuò)增，本發(fā)明對(duì)所述基因組的提取方法沒(méi)有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的市售真菌基因組dna提取試劑盒進(jìn)行提取即可。

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明所述的一種諾麗內(nèi)生真菌的分離鑒定方法做進(jìn)一步詳細(xì)的介紹，本發(fā)明的技術(shù)方案包括但不限于以下實(shí)施例。

實(shí)施例1

本發(fā)明在2016年3月至2016年12月從中國(guó)海南省?？谑?北緯20°03′35"，東經(jīng)110°19′44"，海拔9m)、萬(wàn)寧市(北緯18°45′24"，東經(jīng)110°72′06"，海拔33m)、瓊海市(北緯19°16′56"，東經(jīng)110°37′46"，海拔10m)、三亞市(北緯18°20′38"，東經(jīng)109°34′41"，海拔35m)、臨高市(北緯19°54′58"，東經(jīng)109°38′46"，海拔76m)、儋州市(北緯19°30′38"，東經(jīng)109°34′21"，海拔158m)六個(gè)市縣獲得。

本發(fā)明諾麗(morindacitrifolialinn.)內(nèi)生真菌的具體分離純化操作步驟如下：

(1)諾麗果和葉的準(zhǔn)備：采集諾麗健康、八成熟的果和葉，無(wú)菌水沖洗后,即得待分離內(nèi)生真菌的植物樣品,將其存放無(wú)菌袋中于4℃保存。

(2)植物樣品的表面消毒與無(wú)菌檢測(cè)：將所述植物樣品用純凈水洗凈,分別依次以2.6％-3.5％次氯酸鈉+75％酒精按照不同的消毒時(shí)間做30個(gè)組合進(jìn)行表面消毒，具體方案如下：次氯酸鈉浸泡時(shí)間+酒精消毒時(shí)間60s+30s、60s+60s、60s+90s、60s+120s、60s+150s、60s+180s；120s+30s、120s+60s、120s+90s、120s+120s、120s+150s、120s+180s；180s+30s、180s+60s、180s+90s、180s+120s、180s+150s、180s+180s；240s+30s、240s+60s、240s+90s、240s+120s、240s+150s、240s+180s；300s+30s、300s+60s、300s+90s、300s+120s、300s+150s、300s+180s。然后無(wú)菌水洗滌3次，無(wú)菌濾紙吸干水分。用滅過(guò)菌的手術(shù)刀將果和葉邊緣部分去除，果內(nèi)部或中心部分切分成1cm×1cm大小的組織塊，葉內(nèi)部或中心部分切分成0.5cm×0.5cm大小的組織塊。部分果塊或葉塊放在滅過(guò)菌的馬鈴薯葡萄糖瓊脂(pda)固體培養(yǎng)基平板上，25±1℃、黑暗條件下恒溫培養(yǎng)8～10天。

將另一部分果塊和葉塊進(jìn)行無(wú)菌檢測(cè)：采用組織印跡法，將果塊或葉塊置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(pda)固體培養(yǎng)基平板上，輕輕滾動(dòng)或緊貼培養(yǎng)基放置2min，接著移去果塊或葉塊，在25±1℃、黑暗條件下恒溫培養(yǎng)8-10天，無(wú)雜菌長(zhǎng)出即說(shuō)明消毒后的果塊或葉塊表面無(wú)菌。

所述馬鈴薯葡萄糖瓊脂(pda)固體培養(yǎng)基的成分為：馬鈴薯浸粉3g、葡萄糖20g、瓊脂粉15g、氯霉素0.1g，每1000ml蒸餾水中加pda38g；使用前pda固體培養(yǎng)基在121℃、0.1mpa下滅菌20min。

(3)內(nèi)生真菌的分離純化培養(yǎng)：當(dāng)步驟(2)的馬鈴薯葡萄糖瓊脂(pda)固體培養(yǎng)基平板上的諾麗果塊或葉塊周圍長(zhǎng)出菌絲時(shí)，采用尖端菌絲挑取法，把培養(yǎng)得到的菌絲尖端部分，移至新的pda平板培養(yǎng)基上，25±1℃黑暗條件下培養(yǎng)8-10天長(zhǎng)出完整菌落；重復(fù)上述步驟4-5次直至得到純菌落，即得植物內(nèi)生真菌，挑取純菌落內(nèi)生真菌的尖端部分移至pda斜面培養(yǎng)基上，25±1℃、黑暗條件下培養(yǎng)8-10天，于4℃保存；

真菌基因組dna提?。簩⒈４娴闹Z麗果和葉內(nèi)生真菌活化培養(yǎng)后，接種到馬鈴薯葡萄糖肉湯(pdb)液體培養(yǎng)基中，放入恒溫?fù)u床在25±1℃、50rpm/min、黑暗條件下液體培養(yǎng)5天。根據(jù)其形態(tài)特征將其初步分為酵母菌和霉菌，采用真菌基因組dna提取試劑盒的使用方法，提取內(nèi)生真菌的dna。

具體步驟如下：1.對(duì)于酵母菌，取1～2ml培養(yǎng)好的菌液，離心收集，棄上液。加入200μl溶液a，加入20μlrnasea，再加入100mg玻璃珠，在高速振蕩器上振蕩，約5-10min。

1.霉菌(孢子也可相同處理)：取1-2ml培養(yǎng)好的菌液，離心收集，棄上液加200μl溶液a，用玻璃研磨器適當(dāng)研磨分散菌絲，加入200μl溶液a，再加入100mg玻璃珠，在高速振蕩器上振蕩約30min。

2.加入20μl的蛋白酶k(10mg/ml)，充分混勻，55℃水浴消化30min，消化期間可顛倒離心管混勻數(shù)次。12000rpm離心2min。將上清液轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中。如有沉淀，可再次離心。

3.在上清液中加入200μl溶液b，充分混勻。如出現(xiàn)白色沉淀，可放55℃水浴5min，沉淀即會(huì)消失，不影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。如溶液未變清亮，說(shuō)明樣品消化不徹底，可能導(dǎo)致提取的dna量少及不純，還可能導(dǎo)致上柱后堵塞柱子，增加消化時(shí)間。

4.再加入200μl無(wú)水乙醇，充分混勻，此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀，不影響dna的提取，將溶液和絮狀沉淀都加入吸附柱，放置2min。

5.12000rpm離心1min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。

6.向吸附柱中加入600μl漂洗液(使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇)，12000rpm離心1min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中，重復(fù)一次。

7.12000rpm離心2min，將吸附柱置于室溫或50℃恒溫箱放置數(shù)分鐘，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，否則漂洗液中的乙醇會(huì)影響后續(xù)的實(shí)驗(yàn)，如酶切、pcr擴(kuò)增等。

8.將吸附柱放入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜中央懸空滴加50-200μl經(jīng)65℃水浴預(yù)熱的洗脫液，室溫放置5min，12000rpm離心1min。

9.離心所得的洗脫液再加入吸附柱中，室溫放置2min，12000rpm離心2min，即可得到高質(zhì)量的基因組dna。

以上真菌基因組dna的提取步驟均在室溫下進(jìn)行。

所述馬鈴薯葡萄糖肉湯(pdb)液體培養(yǎng)基的成分為：馬鈴薯浸粉5g、葡萄糖15g、蛋白胨10g、氯化鈉5g，每1000ml蒸餾水中加pdb35g，使用前pdb液體培養(yǎng)基在121℃、0.1mpa下滅菌20min。

對(duì)上述提取的基因組dna，采用通用引物對(duì)its4和its1f進(jìn)行pcr擴(kuò)增。

pcr擴(kuò)增體系：無(wú)菌水9.5μl、2·pcrmix12.5μl、引物ⅰ(its4)1.0μl，引物ⅱ(its1f)1.0μl，dna模板1.0μl，共25μl。(its4：5’-tcctccgcttattgatatgc-3’；its1f；5’-cttggtcatttagaggaagtaa-3’)。

pcr反應(yīng)程序：94℃預(yù)變形5min，94℃變性40s，55℃退火40s，72℃延伸55s，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min，4℃保存，引物序列由海南光威科技有限公司合成。

對(duì)pcr產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)：擴(kuò)增產(chǎn)物在1.2％瓊脂糖凝膠上電泳，并拍照保存。

序列測(cè)定：將pcr擴(kuò)增產(chǎn)物送至北京六合華大基因科技有限公司廣州分公司進(jìn)行測(cè)序，并將序列在ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行blast比對(duì)。

本發(fā)明在2016年3月-2016年12月采集海南省六個(gè)市(縣)的諾麗果和葉，在時(shí)間和地理位置上均豐富了內(nèi)生真菌的種類。

本發(fā)明對(duì)諾麗果和葉采用不同的表面消毒處理，既能確保充分消毒，達(dá)到有效去除表面污染菌的目的，又能避免過(guò)度的表面消毒，將部分內(nèi)生真菌殺死，克服了現(xiàn)有植物內(nèi)生真菌分離方法存在的某些菌種丟失的缺陷。試驗(yàn)結(jié)果表明：1、2.6％次氯酸鈉+75％酒精在以下8組合消毒時(shí)間處理中除菌效果良好(120s+30s、120s+60s、180s+30s、180s+60s、240s+30s、240s+60s、300s+30s、300s+60s)；2、2.6％次氯酸鈉+75％酒精在以下7組合消毒時(shí)間中沒(méi)有菌落長(zhǎng)出(80s+180s、240s+150s、240s+180s、300s+90s、300s+120s、300s+150s、300s+180s)。

本發(fā)明所描述的分離得到諾麗內(nèi)生真菌共有41株，經(jīng)分子生物學(xué)its基因序列分析。pcr擴(kuò)增得到itsrdna的序列片段條帶大小分別為700bp和500-700bp，條帶均單一明亮(圖1)。登錄ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)將諾麗內(nèi)生真菌已擴(kuò)增的dna序列用blast進(jìn)行序列比對(duì)，分別屬于擔(dān)子菌門(basidiomycota)、子囊菌門(ascomycota)兩個(gè)類群，包括刺盤孢屬(colletotrichum)、間座殼屬(diaporthe)、炭團(tuán)菌屬(hypoxylon)、枝孢屬(cladosporium)、鐮刀菌屬(fusarium)、葉點(diǎn)霉屬(phyllosticta)、赤霉屬(gibberella)、金擔(dān)子菌屬(aureobasidium)、薔薇色酵母屬(rhodotorula)、隱球菌屬(cryptococcus)、曲霉屬(aspergillus)11個(gè)屬，26種(如表1所示)。上述26種諾麗內(nèi)生真菌itsrrna測(cè)序結(jié)果序列如seqidno.3～seqidno.28所示。

本發(fā)明從諾麗(morindacitrifolialinn.)果和葉中分離得到的內(nèi)生真菌特征如下：

m22.菌體黑色，質(zhì)地濕潤(rùn)，有色素產(chǎn)生，滲透到培養(yǎng)基中，表面有突起，邊緣不整齊。

m30.菌體黑色，質(zhì)地濕潤(rùn)，表面平整，邊緣整齊。

m45.淡褐色菌絲，質(zhì)地濕潤(rùn)，產(chǎn)生褐色色素，表面平整，邊緣整齊。

m53.白色菌絲，質(zhì)地濕潤(rùn)，表面有液體生成，產(chǎn)生黑色色素，滲透到培養(yǎng)基中，邊緣呈羽毛狀。

m44.白色菌絲，質(zhì)地干燥，表面平整，邊緣不整齊。

m18.棕色孢子，質(zhì)地干燥，白色菌絲，表面平整，邊緣整齊。

m49.菌體褐色，質(zhì)地濕潤(rùn)，有色素產(chǎn)生，滲透到培養(yǎng)基中，表面有突起，邊緣不整齊。

m52.白色菌絲，質(zhì)地濕潤(rùn)，表面有液體生成，產(chǎn)生黑色色素，滲透到培養(yǎng)基中，邊緣不整齊。

m48.菌體黑色，質(zhì)地干燥，有色素產(chǎn)生，滲透到培養(yǎng)基中，表面有突起，邊緣不整齊。

m51.白色菌絲，質(zhì)地濕潤(rùn)，菌絲呈放射狀，滲透到培養(yǎng)基中，表面平整，邊緣不整齊。

m1.白色菌絲，質(zhì)地干燥，呈蓬松狀，表面有黑色孢子，表面凸起，邊緣不整齊。

m2.褐色孢子，質(zhì)地干燥，白色菌絲，背面有褶皺，表面凸起，邊緣不整齊。

m4.白色菌絲，質(zhì)地干燥，呈蓬松狀，表面有褐色孢子，表面凸起，邊緣不整齊。

m8.白色菌絲，質(zhì)地干燥，呈蓬松狀，表面有黑色孢子，背面有褶皺，邊緣不整齊。

m17.白色菌絲上，黑色孢子，質(zhì)地干燥，表面凸起，邊緣不整齊。

m12.褐色孢子，白色菌絲，質(zhì)地干燥，表面凸起，邊緣不整齊。

m15.棕色孢子，白色菌絲，質(zhì)地干燥，表面平整，邊緣整齊。

m16.黑色孢子，白色菌絲，質(zhì)地干燥，表面平整，邊緣不整齊，干燥。

m40.黑色孢子，菌絲淡黃色，質(zhì)地干燥，表面平整，邊緣整齊。

m37.桿狀褐色孢子，白色菌絲，質(zhì)地干燥，背面有褶皺，邊緣不整齊。

j24.菌體透明色，質(zhì)地濕潤(rùn)，表面平整，邊緣整齊。

j22.菌體乳白色，質(zhì)地粘稠，不透明，表面凸起，邊緣不整齊。

j12.菌體紅色，質(zhì)地粘稠，不透明，表面凸起，邊緣整齊。

j13.菌體粉紅色，質(zhì)地粘稠，不透明，表面平整，邊緣整齊。

j26.菌體粉紅色，質(zhì)地粘稠，不透明，表面凸起，邊緣整齊。

j32.菌體淡黃色，質(zhì)地濕潤(rùn)，不透明，表面平整，邊緣整齊。

表1：諾麗(morindacitrifolialinn.)果和葉中分離得到的內(nèi)生真菌

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。

sequencelisting

<110>2017

海南大學(xué)

<120>一種諾麗內(nèi)生真菌的分離鑒定方法

<130>2017

<160>28

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

tcctccgcttattgatatgc20

<210>2

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

cttggtcatttagaggaagtaa22

<210>3

<211>552

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

gggggtttcgagtaccgctcttataccctttgtgacataccccaaacgttgcctcggcgg60

gcagccggagcccagctccgtcgcccggagccgccgtctcggcgcgccccacccgccggc120

ggaccaccaaactctatttaaacgacgtctcttctgagtggcacaagcaaataatcaaaa180

cttttaacaacggatctcttggttctggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataag240

taatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgcccgcca300

gcattctggcgggcatgcctgttcgagcgtcatttcaaccctcaagcaccgcttggcgtt360

ggggccctacggcttccgtaggccccgaaatacagtggcggaccctcccggagcctcctt420

tgcgtagtaacataccacctcgcactgggatccggagggactcctgccgtaaaacccccc480

aattttccaaaggttgacctcggatcaggtaggaatacccgctgaacttaagcatatcaa540

taagcggaggaa552

<210>4

<211>595

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

ttattaattgggtaccgctccttataaccctttgtgacataccccaaacgttgcctcggc60

gggcagccggagcccagctccgtcgcccggagccgccgtctcggcgcgccccacccgccg120

gcggaccaccaaactctatttaaacgacgtctcttctgagtggcacaagcaaataatcaa180

aacttttaacaacggatctcttggttctggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgata240

agtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgcccgc300

cagcattctggcgggcatgcctgttcgagcgtcatttcaaccctcaagcaccgcttggcg360

ttggggccctacggcttccgtaggccccgaaattcagtggcggaccctcccggatcctcc420

tttgcgtagaaacatagcacctcgcactgggatccggatggactcctgccgtaaaaccct480

ccaattgggcaaaggaagaactcgtatcaggtagcaatacccgttgaacttagccttacc540

tcggaaccggaagaaaaacccggttaaattttttctttcttttaagtggaggaag595

<210>5

<211>592

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

gaattggcatctacctgatccgaggtcaattttcagaagttgggggtttaacggcagggc60

accgccagggccttccagaacgagatataactactacgctcggggtcctagcgagctcgc120

cactagatttcagggcctgccctcgctagaaggcagtgccccatcaccaagccaggcttg180

agggttgaaatgacgctcgaacaggcatgccctccggaataccagagggcgcaatgtgcg240

ttcaaagattcgatgattcactgaattctgcaattcacattacttatcgcatttcgctgc300

gttcttcatcgatgccagaaccaagagatccgttgttgaaagttttgattcatttatgtt360

ttttactccaagattcactaaagaaacgagatgttaattggccactggcttcctgctccc420

tgtttcccggaaatctttgggccagatcgctaggacgccgagagtaaaaataatatctcg480

atctggaaggcggtgtcggggccctgccgataaacctccaacttctgaaactttgaccgc540

tgatcaagtgggaaccccggcgaactttaacttctccatatggaggaggaaa592

<210>6

<211>604

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

agaggaagtaaaagtcgtaacaaggtctccgttggtgaaccagcggagggatcattgctg60

gaacgcgcttcggcgcacccagaaaccctttgtgaacttatacctattgttgcctcggcg120

caggccggcctcttcactgaggccccctggaaacagggagcagcccgccggcggccaacc180

aaactcttgtttctatagtgaatctctgagtaaaaaaacataaatgaatcaaaactttca240

acaacggatctcttggttctggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgt300

gaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgccctctggtattc360

cggagggcatgcctgttcgagcgtcatttcaaccctcaagcctggcttggtgatggggca420

ctgcctgtaatagggcaggccctgaaatctagtggcgagctcgccaggaccccgagcgta480

gtagttatatctcgctctggaaggccctggcggtgccctgccgttaaacccccaacttct540

gaaaatttgacctcggatcaggtaggaatacccgctgaacttaagcatatcaataagcgg600

agga604

<210>7

<211>591

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

tgaccggcatgctacctaatccgaggtcaccattaaaatagggggtgttttatggctagc60

aactataaccactacaagaagcgagagagagttactacgcttagagtgtgctataactcc120

gccactaactttaaggaactacgctataataggtcgtagagtcccaacgctaaacaaccg180

aggcttaagggttgaaatgacgctcgaataggcatgcccactagaatactaatgggcgca240

atgtgcgttcaaagattcgatgattcactgaattctgcaattcacattacttatcgcatt300

tcgctgcgttcttcatcgatgccagaaccaagagatccgttgttgaaagttttaacttat360

ttagttataaagttcagagatacagtataaaacagagttggtaggtcctctggcgagctt420

ggaatgtgttcccgggtagctacagggtagctatagggtagcataactcgccgaggcaac480

agtggtaagttcacaaagggttgggagttttggataactcagtaatgatccctccgctgg540

ttcaccaacggagaccttgttacgacttttacttcctctaaatgaccaaga591

<210>8

<211>531

<212>dna

<213>人工序列

<400>8

agtcagcgacccgtagtgaccggtttcaccgggatgttctaaccctttgttgtccgactc60

tgttgcctccggggcgaccctgccttcgggcgggggctccgggtggacacttcaaactct120

tgcgtaactttgcagtctgagtaaacttaattaataaattaaaacttttaacaacggatc180

tcttggttctggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcaga240

attcagtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgccccctggtattccggggggcat300

gcctgttcgagcgtcatttcaccactcaagcctcgcttggtattgggcaacgcggtccgc360

cgcgtgcctcaaatcgaccggctgggtcttctgtcccctaagcgttgtggaaactattcg420

ctaaagggtgctcgggaggctacgccgtaaaacaaccccatttctaaggttgacctcgga480

tcaggtagggatacccgctgaacttaagcatatcataaggggggaagaact531

<210>9

<211>561

<212>dna

<213>人工序列

<400>9

aaccgggctcctacctgatccgaggtcaccttagaaatggggttgttttacggcgtagcc60

tcccgagcaccctttagcgaatagtttccacaacgcttaggggacagaagacccagccgg120

tcgatttgaggcacgcggcggaccgcgttgcccaataccaagcgaggcttgagtggtgaa180

atgacgctcgaacaggcatgccccccggaataccagggggcgcaatgtgcgttcaaagat240

tcgatgattcactgaattctgcaattcacattacttatcgcatttcgctgcgttcttcat300

cgatgccagaaccaagagatccgttgttaaaagttttaatttattaattaagtttactca360

gactgcaaagttacgcaagagtttgaagtgtccacccggagcccccgcccgaaggcaggg420

tcgccccggaggcaacagagtcggacaacaaagggttatgaacatcccggtggtaaaccg480

gggtcacttgtaatgatccctccgcaggttcacctacggagaccttgttacgacttttac540

ttcctctaatttgacccaaga561

<210>10

<211>550

<212>dna

<213>人工序列

<400>10

gcggggatttctactgatccgaggtcacattcagaagttgggggtttaacggcttggccg60

cgccgcgtaccagttgcgagggttttactactacgcaatggaagctgcagcgagaccgcc120

actagatttcggggccggcttgccgcaagggctcgccgatccccaacaccaaacccgagg180

gcttgagggttgaaatgacgctcgaacaggcatgcccgccagaatactggcgggcgcaat240

gtgcgttcaaagattcgatgattcactgaattctgcaattcacattacttatcgaatttt300

gctgcgttcttcatcaatgccagaaccaaaagatccgttgttgaaaggtttaatttattt360

atggttttactcagaagatacatatagaaaccgagtgaagggggcctctggctgcttatt420

ccgttccccgggagcgggatgctttcccaagcccttttttgccactttccctcgcaccct480

gccttggggggtctgcacagggagcatacagtgggctttggagtcggatggattgttcga540

ttttaacttt550

<210>11

<211>635

<212>dna

<213>人工序列

<400>11

agtgggcttctacctgatccgaggtcaccttggaaaatagaccgaaggtcgattgtccgg60

cggccgtcgcccagcactccaaagcgagatattttactactacgctcgaggctaggacgc120

cgtcgccgaggtcttcaaggcacgtccggcagcggacgttgcccaataccaagcagagct180

tgagggttgaaatgacgctcgaacaggcatgccctccggaataccagagggcgcaatgtg240

cgttcaaagattcgatgattcactgaattctgcaattcacattacttatcgcatttcgct300

gcgttcttcatcgatgccagaaccaagagatccgttgttgaaagttttaatcaattaaat360

gatatatcaggacttcacaaaatgaattcttgagttttgtatactggcgggcacttagcc420

aggcgtcctggccagttaaggctgggggcgccggccgcctgggtcggaaccaggtcgacc480

cgccaaagcaacatagtgagtacacaagggtgagaaggtcatttcggcgttgtagcgcct540

actctggaacctttcaatagaagttattacatttcagtaatgatccttccgcaggttcac600

ctacggaaaccttgttacgacttttacttcctcaa635

<210>12

<211>568

<212>dna

<213>人工序列

<400>12

gcccgggctttctacctgatccgaggtcacattcagaagttgggggtttaacggcttggc60

cgcgccgcgtaccagttgcgagggttttactactacgcaatggaagctgcagcgagaccg120

ccactagatttcggggccggcttgccgcaagggctcgccgatccccaacaccaaacccga180

gggcttgagggttgaaatgacgctcgaacaggcatgcccgccagaatactggcgggcgca240

atgtgcgttcaaagattcgatgattcactgaattctgcaattcacattacttatcgcatt300

ttgctgcgttcttcatcgatgccagaaccaagagatccgttgttgaaagttttgatttat360

ttatggttttactcagaagttacatatagaaacagagtttaggggtcctctggcgggccg420

tcccgttttaccgggagcgggctgatccgccgaggcaacaattggtatgttcacaggggt480

ttgggagttgtaaactcggtaatgatccctccgctggttcaccaacggagaccttgttac540

gacttttacttcctctaaatgaccaaga568

<210>13

<211>575

<212>dna

<213>人工序列

<400>13

cggctacgagtcggggtctttgggccaacctcccatccgtgtctattataccctgttgct60

tcggcgggcccgccgcttgtcggccgccgggggggcgcctttgccccccgggcccgtgcc120

cgccggagaccccaacacgaacactgtctgaaagcgtgcagtctgagttgattgaatgca180

atcagttaaaactttcaacaatggatctcttggttccggcatcgatgaagaacgcagcga240

aatgcgataactaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgagtctttgaacgcacat300

tgcgccccctggtattccggggggcatgcctgtccgagcgtcattgctgccctcaagccc360

ggcttgtgtgttgggtcgccgtccccctctccggggggacgggcccgaaaggcagcggcg420

gcaccgcgtccgatcctcgagcgtatggggctttgtcacatgctctgtaagattggccgg480

cgcctgccgacgttttccaaccattttttccaggttgacctcggatcaggtagggatacc540

cgctgaacttaagcatatcaataagcggaggaatc575

<210>14

<211>590

<212>dna

<213>人工序列

<400>14

ggaagtaaaagtcgtaacaaggtttccgtaggtgaacctgcggaaggatcattaccgagt60

gctgggtccttcggggcccaacctcccacccgtgcttaccgtaccctgttgcttcggcgg120

gcccgccttcgggcggcccggggcctgcccccgggaccgcgcccgccggagaccccaatg180

gaacactgtctgaaagcgtgcagtctgagtcgattgataccaatcagtcaaaactttcaa240

caatggatctcttggttccggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataactaatgtg300

aattgcagaattcagtgaatcatcgagtctttgaacgcacattgcgccccctggtattcc360

ggggggcatgcctgtccgagcgtcatttctcccctccagccccgctggttgttgggccgc420

gcccccccgggggcgggcctcgagagaaacggcggcaccgtccggtcctcgagcgtatgg480

ggctctgtcacccgctctatgggcccggccggggcttgcctcgacccccaatcttctcag540

attgacctcggatcaggtagggatacccgctgaacttaagcatatcaata590

<210>15

<211>618

<212>dna

<213>人工序列

<400>15

tagaggaagtaaaagtcgtaacaaggtttccgtaggtgaacctgcggaaggatcattacc60

gagtgcgggtcctttgggcccaacctcccatccgtgtctattataccctgttgcttcggc120

gggcccgccgcttgtcggccgccgggggggcgcctttgccccccgggcccgtgcccgccg180

gagaccccaacacgaacactgtctgaaagcgtgcagtctgagttgattgaatgcaatcag240

ttaaaactttcaacaatggatctcttggttccggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgc300

gataactaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgagtctttgaacgcacattgcgc360

cccctggtattccggggggcatgcctgtccgagcgtcattgctgccctcaagcccggctt420

gtgtgttgggtcgccgtccccctctccggggggacgggcccgaaaggcagcggcggcacc480

gcgtccgatcctcgagcgtatggggctttgtcacatgctctgtaggattggccggcgcct540

gccgacgttttccaaccattttttccaggttgacctcggatcaggtagggatacccgctg600

aacttaagcatatcaata618

<210>16

<211>626

<212>dna

<213>人工序列

<400>16

gaggaagtaaaagtcgtaacaaggtttccgtaggtgaacctgcggaaggatcattaccga60

gtgcgggtcctttgggcccaacctcccatccgtgtctattgtaccctgttgcttcggcgg120

gcccgccgcttgtcggccgccgggggggcgcctctgccccccgggcccgtgcccgccgga180

gaccccaacacgaacactgtctgaaagcgtgcagtctgagttgattgaatgcaatcagtt240

aaaactttcaacaatggatctcttggttccggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcga300

taactaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgagtctttgaacgcacattgcgccc360

cctggtattccggggggcatgcctgtccgagcgtcattgctgccctcaagcccggcttgt420

gtgttgggtcgccgtccccctctccggggggacgggcccgaaaggcagcggcggcaccgc480

gtccgatcctcgagcgtatggggctttgtcacatgctctgtaggattggccggcgcctgc540

cgacgttttccaaccattctttccaggttgacctcggatcaggtagggatacccgctgaa600

cttaagcatatcaataaggcggagga626

<210>17

<211>624

<212>dna

<213>人工序列

<400>17

ggaagtaaaagtcgtaacaaggtttccgtaggtgaacctgcggaaggatcattaccgagt60

gcgggtcctttgggcccaacctcccatccgtgtctattataccctgttgcttcggcgggc120

ccgccgcttgtcggccgccgggggggcgcctttgccccccgggcccgtgcccgccggaga180

ccccaacacgaacactgtctgaaagcgtgcagtctgagttgattgaatgcaatcagttaa240

aactttcaacaatggatctcttggttccggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgata300

actaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgagtctttgaacgcacattgcgccccc360

tggtattccggggggcatgcctgtccgagcgtcattgctgccctcaagcccggcttgtgt420

gttgggtcgccgtccccctctccggggggacgggcccgaaaggcagcggcggcaccgcgt480

ccgatcctcgagcgtatggggctttgtcacatgctctgtaggattggccggcgcctgccg540

acgttttccaaccattttttccaggttgacctcggatcaggtagggatacccgctgaact600

taagcatatcaataaggcggagga624

<210>18

<211>584

<212>dna

<213>人工序列

<400>18

aatgggcagctacctgatccgaggtcatctgagaagattgggggtcgaggcaagccccgg60

ccgggcccatagagcgggtgacagagccccatacgctcgaggaccggacggtgccgccgt120

ttctctcgaggcccgcccccgggggggcgcggcccaacaaccagcggggctggaggggag180

aaatgacgctcggacaggcatgccccccggaataccagggggcgcaatgtgcgttcaaag240

actcgatgattcactgaattctgcaattcacattagttatcgcatttcgctgcgttcttc300

atcgatgccggaaccaagagatccattgttgaaagttttgactgattggtatcaatcgac360

tcagactgcacgctttcagacagtgttccattggggtctccggcgggcgcggtcccgggg420

gcaggccccgggccgcccgaaggcgggcccgccgaagcaacagggtacggtaagcacggg480

tgggaggttgggccccgaaggacccagcactcggtaatgatccttccgcaggttcaccta540

cggaaaccttgttacgacttttacttcctctaaaatgaccaaga584

<210>19

<211>557

<212>dna

<213>人工序列

<400>19

gggatttcttgtgctgtacgatctggtcttcggggccacctcccacccgtgcttaccgta60

ccctgttgcttcggcgggcccgccttcgggcggcccggggcctgcccccgggaccgcgcc120

cgccggagaccccaatggaacactgtctgaaagcgtgcagtctgagtcgattgataccaa180

tcagtcaaaactttcaacaatggatctcttggttccggcatcgatgaagaacgcagcgaa240

atgcgataactaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgagtctttgaacgcacatt300

gcgccccctggtattccggggggcatgcctgtccgagcgtcatttctcccctccagcccc360

gctggttgttgggccgcgcccccccgggggcgggcctcgagagaaacggcggcaccgtcc420

ggtcctcgagcgtatggggctctgtcacccgctctatgggcccggccggggcttgcctcg480

acccccaatcttctcagattgacctcggatcaggtagggatacccgctgaacttaagcat540

atcaataagcggaggaa557

<210>20

<211>573

<212>dna

<213>人工序列

<400>20

gggggtacgattgcggtctttgggccacctcccatccgtgtctattataccctgttgctt60

cggcgggcccgccgcttgtcggccgccgggggggcgcctttgccccccgggcccgtgccc120

gccggagaccccaacacgaacactgtctgaaagcgtgcagtctgagttgattgaatgcaa180

tcagttaaaactttcaacaatggatctcttggttccggcatcgatgaagaacgcagcgaa240

atgcgataactaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgagtctttgaacgcacatt300

gcgccccctggtattccggggggcatgcctgtccgagcgtcattgctgccctcaagcccg360

gcttgtgtgttgggtcgccgtccccctctccggggggacgggcccgaaaggcagcggcgg420

caccgcgtccgatcctcgagcgtatggggctttgtcacatgctctgtaggattggccggc480

gcctgccgacgttttccaaccattttttccaggttgacctcggatcaggtagggataccc540

gctgaacttaagcatatcaataagccggaggaa573

<210>21

<211>549

<212>dna

<213>人工序列

<400>21

ctgcggcgagtgctggtcttcggggccaacctcccacccgtgcttaccgtaccctgttgc60

ttcggcgggcccgccttcgggcggcccggggcctgcccccgggaccgcgcccgccggaga120

ccccaatggaacactgtctgaaagcgtgcagtctgagtcgattgataccaatcagtcaaa180

actttcaacaatggatctcttggttccggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataa240

ctaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgagtctttgaacgcacattgcgccccct300

ggtattccggggggcatgcctgtccgagcgtcatttctcccctccagccccgctggttgt360

tgggccgcgcccccccgggggcgggcctcgagagaaacggcggcaccgtccggtcctcga420

gcgtatggggctctgtcacccgctctatgggcccggccggggcttgcctcgacccccaat480

cttctcagattgacctcggatcaggtagggatacccgctgaacttaagcatatcaataag540

cgggaggaa549

<210>22

<211>582

<212>dna

<213>人工序列

<400>22

gcgaatgcgagtgcggttgatcggtctttgggcccacctcccatccgtgtctattatacc60

ctgttgcttcggcgggcccgccgcttgtcggccgccgggggggcgcctttgccccccggg120

cccgtgcccgccggagaccccaacacgaacactgtctgaaagcgtgcagtctgagttgat180

tgaatgcaatcagttaaaactttcaacaatggatctcttggttccggcatcgatgaagaa240

cgcagcgaaatgcgataactaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgagtctttga300

acgcacattgcgccccctggtattccggggggcatgcctgtccgagcgtcattgctgccc360

tcaagcccggcttgtgtgttgggtcgccgtccccctctccggggggacgggcccgaaagg420

cagcggcggcaccgcgtccgatcctcgagcgtatggggctttgtcacatgctctgtagga480

ttggccggcgcctgccgacgttttccaaccattttttccaggttgacctcggatcaggta540

gggatacccgctgaacttaagcatatcataagccggaagaaa582

<210>23

<211>588

<212>dna

<213>人工序列

<400>23

cggggatctacctgatccgaggtcacctagaaaaataaaggtttcagtcggcagaagtcc60

tctcctttgacagacgttcgaataaattctactacgcctaaagccggtgaggcctcgccg120

aggtctttaaggcgcgcccaactaaggacggcacccaataccaagcatagcttgagtggt180

gtaatgacgctcgaacaggcatgcccctcggaataccaaggggcgcaatgtgcgttcaaa240

gattcgatgattcactgaattctgcaattcacattacttatcgcatttcgctgcgttctt300

catcgatgcgagaaccaagagatccgttgttgaaagttttgatttattcaaaattttaac360

tcagacgaccggtttaataacaagagtttggtttaactctggcgggcgctcgcctgggac420

gaatccccagcggctcgagaccgagcggtcccgccaaagcaacaaggtagttttaacaac480

aaagggttggaggtcgggcgctgagcacccttactctttaatgatccttccgcaggttca540

cctacggaaaccttgttacgacttttacttcctcaatttgacccaaga588

<210>24

<211>567

<212>dna

<213>人工序列

<400>24

tcttggtcatttagaggaagtaaaagtcgtaacaaggtttccgtaggtgaacctgcggaa60

ggatcattattgattggtcgaaagaccttatcagattctaccacctctgtgaaccgttga120

cctccgggttaataatcaaacatcagtgtaacgaacgtaagagtatcttaacgaaacaaa180

actttcaacaacggatctcttggctctcgcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataa240

gtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcaccttgcgcctttt300

ggtattccgaaaggcatgcctgtttcagtgtcatgaaatctcaatctaatatgttttctg360

aacatgttaggcttggacttgggcgtctgccagtgatggctcgcctcaaatgacttagtg420

gaacatcccacatcagtgttagacgtaataagtttcgtctctccttgtggtgatgactgc480

tcagaacctgccatcgcgcatcttttgactttgacctgaaatcaggtagggctacccgct540

gaacttaagcatatcaataagcggagg567

<210>25

<211>627

<212>dna

<213>人工序列

<400>25

ccggacctcctggatttgaggtcaaatcttaaatgtggacttctgattagaaacttcctt60

taacctaacccggatctagtccgaagactagaattcctcaacgaatagactattacgcca120

agtcaatcctaaagttcgattgcggatgctaatgcattacgaacgagctagaacgtaaag180

gccagcagcgctcacaatccaaacacctcttcgatcactaagaaagaggagggttgaagt240

attcctgacactcacacaggcatgctccacggaataccatggagcgcaaggtgcgttcaa300

agattcgatgattcactgaattctgcaattcacattacttatcgcatttcgctgcgttct360

tcatcgatgcgagagccaagagatccgttgttgaaagttttgttttgttataaaattaaa420

tacattcatagactttgtgtttataagtgaataggaattcgctcttgcgagctactatcc480

caaacaaatgcacaggggtagaaagtgagagttcggactccaagttaaattggacgccct540

atgttctctaatgatgcttatgaaggttgagctacccataccatgttacgactattactt600

gctctcattgatcaagaggaggatggt627

<210>26

<211>632

<212>dna

<213>人工序列

<400>26

cacggtgtccttcctggattttaagatctaatcttaaatgtagacattctgattagaagc60

ttcctttaacctaacccggctctaatccgaagactagaattcctcagcgaatagtctatt120

acgccaagtcaatccgaaagttcgattgcggatgctaatgcattacgaacgagctagacc180

gtaaaggccagcagcgctcagaatccaaacacctcttcgatcactaagaaagaggagggt240

tgaagtattcatgacactcaaacaggcatgctccacggaataccatggagcgcaaggtgc300

gttcaaagattcgatgattcactgaattctgcaattcacattacttatcgcatttcgctg360

cgttcttcatcgatgcgagagccaagagatccgttgttgaaagttttgttttgttataaa420

attaaatacattcatagactttgtgtttataagtgaataggaattcgctcttgcgagcta480

ctatcccaaacaaatgcacagggttagaaagtgagagttcggactccaagttaaattgga540

cgtcctatgttcactaatgatccttccgcaggttcacctacggagaccttgttacgactt600

ttacttcctcctaatgacgagggggagggaaa632

<210>27

<211>632

<212>dna

<213>人工序列

<400>27

tactggctcccctacctgatcctgaggtctactcttaaatgtggacgatgactagattgg60

aagcttcctttagtccgacccggctctagtaatagtactagcaattcctcaaccgaatag120

actattagccctgattttccgaaagttcgattgcggatgctaatgcattacgaacgagct180

aatagaggaacggccgacagcgctcaaaatccgcacacctcttcactcaagggaaagagg240

agggttgaagattcatgacactctgaaggcatgctccacggaataccatggatttcaagg300

tgcgttcaaagattcgatgattcactgaattctgctgttcacattacttatcgcatttcg360

ctgcgttcttcatcaatgcgagagccaagagatccgttgttgaaagttttattttgttat420

aaaattaaatacattcatagactttgtgtttataagtgaataggagttcgacgactaggt480

cgactactatcccaaacgagtgcacagggttagaaagtgagagttcggactccaagttaa540

gttggacgtcctatgttcactaatgatccttccgcaggttcacctacggaaaccttgtta600

cgacttttacttcctctaaatgaccaagaggg632

<210>28

<211>621

<212>dna

<213>人工序列

<400>28

gatgggttctactgatttgaggtctaatcgtaaatgtggacttctgattagaacttcctt60

tacctaacccggctctagtccgaagactagaattcctcaacgaatagactattacgccca120

gtcaatccgaaagttcgattgcggatgctaatgcattacgaacgagctagaacgtatagg180

cggacggcgctctcaaaccccacacctctctgctccctagaataaagagggggggaaaga240

ttcttgacacactcaaagatgcgcgcacctcggaacctcgtgtagcgcggggcgcgttca300

tacattctgatactctgtgatctccgctacacattttgtttatcgtttttctgtgttctc360

ttcctccacgccagaccgcagatatcctgttgagagttttgttttgtgatataattatat420

atattctcagactttgtgtgtatatatgtgaaggaaatctctcttgcgagctacactact480

atcccaatgcactgggttaggttataaggtgacagactccactccaaattggacggcaca540

tgttatgtactgatccttcccttcgttcagctacggaaaccttgttacgacttttacttc600

ctctcatcgaactgaccaaga621