本發(fā)明屬于固定化酶制備技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種基于自誘導(dǎo)仿生鈦化固定化蛋白酶的方法。

背景技術(shù)：

酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì),其催化作用具有高選擇性、高催化活性、反應(yīng)條件溫和、環(huán)保無(wú)污染等特點(diǎn)。但游離狀態(tài)的酶對(duì)熱、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高離子強(qiáng)度、有機(jī)溶劑等穩(wěn)定性較差,易失活,并且反應(yīng)后混入催化產(chǎn)物等物質(zhì),純化困難,不能重復(fù)使用。為了克服這些問(wèn)題,酶固定化技術(shù)于應(yīng)運(yùn)而生。

傳統(tǒng)的固定化方法有：吸附法、交聯(lián)法、共價(jià)結(jié)合法、包埋法等，吸附法、交聯(lián)法、共價(jià)結(jié)合法等均具有不同程度的缺陷，如：酶與載體的結(jié)合力弱、反應(yīng)條件較激烈酶活回收率降低較大、酶易失活；與之相比，包埋法具有所需反應(yīng)條件溫和、酶分子不易泄漏、對(duì)生物活性單元失活作用小及可固定高濃度的生物活性單元等優(yōu)點(diǎn)，得到的固定化酶的穩(wěn)定性得以提高。包埋法所具有得較普遍的適用性，使其近年來(lái)得到了廣泛的關(guān)注。

在傳統(tǒng)固定化酶方法的基礎(chǔ)上,著力研究性能優(yōu)異的載體材料,已成為固定化酶技術(shù)目前最為活躍的研究方向之一。隨著材料仿生學(xué)的不斷發(fā)展，固定化酶領(lǐng)域的研究人員將仿生的思想，特別是結(jié)構(gòu)仿生和過(guò)程仿生的思想引入到固定化酶載體這種特殊材料的設(shè)計(jì)和制備中，開(kāi)發(fā)出了新型的固定化酶載體。

仿生礦化就是將生物礦化的機(jī)理引入無(wú)機(jī)材料的合成，以有機(jī)物組裝體為模板，去控制無(wú)機(jī)物形成，制具有特殊備組裝方式和多級(jí)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的有機(jī)無(wú)機(jī)復(fù)合體，使材料具有優(yōu)異的物理化學(xué)性能。在進(jìn)行仿生礦化的過(guò)程中，無(wú)需特殊化學(xué)試劑、反應(yīng)可在數(shù)分鐘內(nèi)完成、反應(yīng)條件溫和(室溫、常壓、中性ph)、仿生礦化過(guò)程所形成的無(wú)機(jī)載體具有納米尺寸、多孔結(jié)構(gòu)、載體物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定且形態(tài)可控等優(yōu)點(diǎn)，基本上全面克服了傳統(tǒng)溶膠凝膠法制備無(wú)機(jī)材料的缺點(diǎn)。

目前利用仿生礦化進(jìn)行酶固定化的一般方法是利用精蛋白、細(xì)胞色素c等堿性蛋白作為誘導(dǎo)劑。由于固定化體系中加入了額外的蛋白質(zhì)誘導(dǎo)劑，該方法不宜進(jìn)行蛋白質(zhì)水解酶類的固定化。本發(fā)明利用木瓜蛋白酶對(duì)仿生鈦化的誘導(dǎo)作用實(shí)現(xiàn)仿生礦化固定化，固定化體系中無(wú)需加入額外的蛋白質(zhì)誘導(dǎo)劑，克服了上述方法的不足。目前利用自誘導(dǎo)仿生鈦化固定化木瓜蛋白酶的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服傳統(tǒng)固定化方法的缺陷，提供一種基于自誘導(dǎo)仿生鈦化固定化木瓜蛋白酶的方法。

具體步驟為：

室溫下，在固定化反應(yīng)器中加入5～10ml濃度為0.1～0.3mol/l的鈦前驅(qū)體溶液，再向固定化反應(yīng)器中加入20～25ml用ph6.0～8.0、濃度0.02mol/l～0.12mol/l的磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液配制的濃度為12mg/ml～22mg/ml游離蛋白酶溶液，使鈦前驅(qū)體溶液與蛋白酶溶液的體積比為1:2～1:3；輕輕攪拌5min，5000rpm冷凍離心10min，收集沉淀。蒸餾水洗滌沉淀3次后，冷凍干燥，得到固定化酶。

所述游離蛋白酶為木瓜蛋白酶。

上述的鈦前驅(qū)體溶液為二羥基雙(乳酸銨)鈦(iv)(ti-baldh)水溶液。

上述的鈦前驅(qū)體溶液與蛋白酶溶液的體積比為1:2～1:3。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和效果在于：游離酶的固定化過(guò)程簡(jiǎn)單，條件溫和，時(shí)間縮短，生物相容性好，能耗降低；固定化酶的酶活回收率和包埋率較高；固定化的酶穩(wěn)定性好。本發(fā)明方法制備固定化蛋白酶的工藝簡(jiǎn)單，載體價(jià)廉易得，成本較低，有利于大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。

附圖說(shuō)明

附圖1為溫度對(duì)木瓜蛋白酶熱穩(wěn)定性的影響。

附圖2為固定化木瓜蛋白酶(a)、木瓜蛋白酶(b)和二氧化鈦(c)的ftir譜圖。

附圖3為堿催化(a)、精蛋白誘導(dǎo)(b)和木瓜蛋白酶誘導(dǎo)(c)生成氧化鈦的sem照片。

附圖4為堿催化(a)、精蛋白誘導(dǎo)(b)和木瓜蛋白酶誘導(dǎo)(b)生成氧化鈦的eds能譜。

具體實(shí)施方式

以下將通過(guò)具體的實(shí)施例進(jìn)一步闡明本說(shuō)明，但本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列的具體實(shí)施方式。

實(shí)施例1

室溫下，在固定化反應(yīng)器中加入7.5ml0.25mol/lti-baldh溶液，再向固定化反應(yīng)器中加入22.5ml用ph7.5、濃度為0.06mol/l磷酸鹽緩沖液配制的濃度為18mg/ml游離木瓜蛋白酶溶液，使ti-baldh溶液與木瓜蛋白酶溶液的體積比為1:3；輕輕攪拌5min，5000rpm冷凍離心10min，收集沉淀。蒸餾水洗滌沉淀3次，收集洗液、合并上清液，然后將沉淀冷凍干燥24h，所得的固定化酶酶活回收率為51.76％，木瓜蛋白酶包埋率為78.67％。

實(shí)施例2

取20mg實(shí)施例1中所獲的固定化木瓜蛋白酶及游離蛋白酶在55℃水浴中保溫，每1h取樣品加入最適ph的磷酸鹽緩沖液后，與酪蛋白于37℃水浴中振蕩反應(yīng)10min，測(cè)定殘留酶活力，以未經(jīng)保溫處理的樣品酶活力為100％，其它折算為相對(duì)酶活，考察固定化木瓜蛋白酶的溫度穩(wěn)定性。附圖1是在ph7.5下，與55℃水浴下孵化5h的游離和固定化木瓜蛋白酶的相對(duì)酶活。由圖可見(jiàn)，游離酶孵化在55℃水浴中1h后能夠保持80％以上的相對(duì)酶活，但是隨著孵化時(shí)間的延長(zhǎng)，游離木瓜蛋白酶的相對(duì)活性下降迅速，在孵化5h后僅保持最初酶活的39％。而在相同條件的固定化酶卻能夠保持較高的酶活力，在55℃水浴中孵化5h后仍維持著高達(dá)90％以上的活性。結(jié)果顯示，木瓜蛋白酶在自誘導(dǎo)仿生鈦化固定化后的溫度穩(wěn)定性得到了顯著性提高。

實(shí)施例3

實(shí)施例1中所獲的固定化木瓜蛋白酶，樣品研細(xì)后，溴化鉀壓片，采用傅立葉紅外光譜儀測(cè)定其紅外光譜，并與木瓜蛋白酶和氨水催化合成tio2的紅外光譜進(jìn)行比較，附圖2所示。從圖中可見(jiàn)，與譜線b對(duì)比，譜線a出現(xiàn)多個(gè)特征基團(tuán)的吸收峰。其中，1372cm^-1為ti-o-ti反對(duì)稱伸縮振動(dòng)吸收峰；1116cm^-1為ti-o-h伸縮振動(dòng)吸收峰；668cm^-1為ti-o-ti對(duì)稱伸縮振動(dòng)吸收峰；537cm^-1為ti-o-ti彎曲振動(dòng)吸收峰，進(jìn)一步證明了tio2的生成。此外，1652和1516cm^-1處出現(xiàn)的吸收峰歸屬于蛋白中酰胺基團(tuán)(酰胺ⅰ帶和ⅱ帶)的振動(dòng)吸收；2872cm^-1歸屬于蛋白中的烷基；3274cm^-1為蛋白中酰胺基團(tuán)的n-h的振動(dòng)吸收峰，進(jìn)一步證明了生成的沉淀粒子中有木瓜蛋白酶的存在，即木瓜蛋白酶被包埋在tio2粒子中。

實(shí)施例4

實(shí)施例1中所獲的固定化木瓜蛋白酶，樣品研細(xì)后，采用掃描電子顯微鏡(sem)表征包埋菠蘿蛋白酶的氧化鋯的形貌和尺寸，sem附帶的x射線能譜儀(eds)分析產(chǎn)物的元素組成。利用5ml氨水和5mlti-baldh在100℃水浴下反應(yīng)1.5h以及室溫下將精蛋白溶液加入到鈦前驅(qū)體溶液中混合產(chǎn)生的沉淀作為對(duì)照。sem譜圖和eds能譜分別如附圖3和附圖4所示。如附圖3所示，氨水催化制備的氧化鈦(a)和精蛋白誘導(dǎo)合成的氧化鈦(b)均為不規(guī)則的塊狀顆粒，而木瓜蛋白酶誘導(dǎo)生成的氧化鈦(c)呈層狀的團(tuán)聚體。eds能譜如附圖4所示，氨水催化制備的氧化鈦(a)中只檢出氧和鈦元素，而精蛋白誘導(dǎo)合成的氧化鈦(b)和木瓜蛋白酶誘導(dǎo)生成的氧化鈦(c)中除了氧、鈦元素，還檢出了與蛋白質(zhì)相關(guān)的碳、氮、磷、硫等元素，證明了蛋白質(zhì)的模板作用。