本發(fā)明涉及動(dòng)物食品加工領(lǐng)域，更具體地，涉及具有dpp-iv抑制和抗氧化功能的牦牛骨蛋白肽及制備方法。

背景技術(shù)：

降血糖功能因子是指能降低糖尿病患者血糖濃度以及改善其癥狀的生物活性成分。目前研究較多的天然產(chǎn)物類降糖因子、礦物質(zhì)類降糖因子、維生素類降糖因子，其作用機(jī)理各不相同。天然產(chǎn)物類降糖因子按化學(xué)結(jié)構(gòu)可分為黃酮類、

活性多糖類、生物堿類、皂甙類、萜類、多肽類等。自人工合成胰島素以來，磺脲類藥物、雙胍類、胰島素增敏劑、糖抑制劑等各種口服或注射的藥物相繼問世，然而化學(xué)藥物常產(chǎn)生一定的毒副作用，天然降血糖成分具有作用溫和而持久，性質(zhì)穩(wěn)定，幾乎無毒性反應(yīng)，還可多種降糖成分并存，綜合起作用等優(yōu)點(diǎn)，備受患者以及和醫(yī)學(xué)界的青睞，也成為了降血糖功能因子的主要研究方向。

關(guān)于降血糖功能蛋白肽的開發(fā)有:專利cn201410129977.3公開了一種利用蠶蛹制備降血糖肽的方法，即在ph值為3.8-4.2下，向脫脂干蠶蛹粉的水溶液中加入酸性蛋白酶酶解，經(jīng)脫色、超濾、濃縮以及真空冷凍干燥后即得具有降血糖功能的肽粉；又如，專利cn201610134873.0公開了一種牡丹籽降血糖肽，該發(fā)明利用超聲波輔助生物酶法降解牡丹籽蛋白，將其切成多種不同分子量多肽，然后使用超濾、離子交換、葡聚糖凝膠和高效液相色譜進(jìn)行分離純化，獲得大量的牡丹籽降血糖肽。

目前，基于腸促胰素的治療包括胰升血糖素樣肽l類似物及二肽基肽酶(dpp-iv)抑制劑成為糖尿病新藥研究的熱點(diǎn)，而相當(dāng)于glp-l類似物，dpp-iv抑制劑具有可口服使用，已成為糖尿病新藥研究的一個(gè)熱點(diǎn)。國內(nèi)外越來越多的人致力于化學(xué)合成的dpp-iv抑制劑，如已進(jìn)入市場的西他列汀，如專利cn201480012769.3公開了一種新型dpp-iv抑制劑，該發(fā)明包括具有β受體阻斷劑活性的二肽基肽酶iv(dpp-iv)的新型抑制劑，該抑制劑由特定化合物及其藥用鹽構(gòu)成，等。由于存在化學(xué)藥品長期服用是否會(huì)產(chǎn)生副作用的爭議，因此，如果能從天然藥物或天然食物中獲取具有dpp-iv抑制活性的功能物質(zhì)，將對人類健康產(chǎn)生重大的影響。

近幾年來，從食物來源中尋找具有dpp-iv抑制活性的小分子活性肽已成為研究熱點(diǎn)。如，專利cn201410498361.3公開了一種源于鹿蛋白的dpp-iv抑制肽gpgspggpl，其氨基酸序列為gly-pro-gly-ser-pro-gly-gly-pro-leu。多肽gpgspggpl具有dpp-iv抑制活性及降血糖活性；又如，專利cn201410455009.1公開一種豆渣蛋白質(zhì)的提取方法及其用于制備dpp-iv抑制肽的方法，該方法中不需要添加任何酸液或堿液，避免了對環(huán)境的污染；又如，專利cn201510622792.2公開了一種具有ace和dpp-iv抑制活性的多肽及其應(yīng)用，該發(fā)明中的多肽從酸奶中提取，氨基酸序列為phe-val-ala-pro-glu-val-phe，該多肽不僅具有血管緊張素轉(zhuǎn)換酶ace抑制活性還具有dpp-iv抑制活性，可用于降血壓、降血糖等疾病的保健品和藥物先導(dǎo)化合物。

目前，以牦牛骨為原料制備具有dpp-iv抑制活性的肽未見相關(guān)研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種具有dpp-iv抑制活性和抗氧化功能的牦牛骨蛋白肽及其制備方法和應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明一方面提供了一種具有dpp-iv抑制活性和抗氧化功能的牦牛骨蛋白肽，該牦牛骨蛋白肽使用牦牛骨蛋白經(jīng)過復(fù)合蛋白酶分步酶解的酶解物制得；其中，復(fù)合蛋白酶為堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶。

使用上述方法得到的牦牛骨蛋白肽具有較好的dpp-iv抑制活性和抗氧化功能，dpp-iv抑制活性(ic50值)小于0.55g/ml。

為了提高得到的牦牛蛋白肽的抑制活性，在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，牦牛骨蛋白肽的制備方法包括如下步驟：

1)牦牛骨蛋白液的制備；

2)將步驟1)制得的牦牛骨蛋白液經(jīng)過復(fù)合蛋白酶分步酶解；

3)將步驟2)酶解后的產(chǎn)物除雜、膜分離、凝膠分離以及反相hplc分離，濃縮，冷凍干燥后即得。

該制備方法中不添加任何酸和堿。

為了得到100％牦牛骨蛋白肽，使用上述3種復(fù)合蛋白酶的分步酶解優(yōu)選可以包括以下步驟：

調(diào)節(jié)牦牛骨蛋白液中蛋白含量為6-9wt％，按照牦牛骨蛋白液中蛋白重量0.4～1.0％的重量百分比加入復(fù)合蛋白酶進(jìn)行分步酶解。

分步酶解進(jìn)一步優(yōu)選為：

第一步酶解反應(yīng)：向蛋白重量6-9wt％的牦牛骨蛋白液中加入0.2～0.5wt％第一復(fù)合蛋白酶，在45～60℃條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)0.5～1.5h，其中，第一復(fù)合蛋白酶為堿性蛋白酶和中性蛋白酶；

第二步酶解反應(yīng)：向第一步酶解反應(yīng)產(chǎn)物中加入0.2～0.5wt％第二復(fù)合蛋白酶，在45～55℃條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)1.0～2.0h，其中，第二復(fù)合蛋白酶為胰蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶。

在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，第一復(fù)合蛋白酶中堿性蛋白酶和中性蛋白酶的質(zhì)量比為1～2:1。

在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，第二復(fù)合蛋白酶中胰蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶的質(zhì)量比為1:1～2。

在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，步驟1)中還包括制得的牦牛骨蛋白液經(jīng)頻率為50-80kh的超聲波超聲處理15-25分鐘。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，利用特定頻率超聲波技術(shù)處理的牦牛骨蛋白液，可以明顯改善牦牛骨蛋白對酶的敏感性，降低酶的使用量。

在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，步驟2)中除雜具體為：

在90～95℃下保溫10～20分鐘，冷卻至室溫，加入酶解液重量0.2-0.6％的活性炭于酶解液中，通過硅藻土進(jìn)行分離，收集分離液。

在該優(yōu)選實(shí)施方式中，通過使用活性炭除雜，使得蛋白肽具有良好的風(fēng)味和色澤，能廣泛應(yīng)用于特需食品、藥物以及營養(yǎng)食品中。

為了使得到的牦牛骨蛋白液的抑制效果更好，步驟3)中膜分離可以具體為：

將除雜后的產(chǎn)物通過兩步超濾方法進(jìn)行處理，先后利用孔徑為10000道爾頓的膜和孔徑為5000道爾頓的膜進(jìn)行超濾。

進(jìn)一步地，可以利用孔徑為10000道爾頓的陶瓷膜超濾，先將分子量小于10000道爾頓的蛋白和多肽分離出來，再用孔徑為5000道爾頓的膜將分子量小于5000道爾頓的蛋白肽分離出來。

在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，步驟3)中凝膠分離和反相hplc可以為：

將膜分離后的產(chǎn)物經(jīng)過sephadexg-15凝膠分離，洗脫液為去離子水，洗脫峰在280nm下進(jìn)行檢測，收集第1個(gè)洗脫峰；通過濃縮、冷凍干燥，得到牦牛骨蛋白肽粗品；再用rp-hplc反相高效液相色譜進(jìn)行1次分離，收集經(jīng)過rp-hplc反相高效液相色譜分離中9-13分中的肽洗脫液。

將得到的肽洗脫液濃縮，冷凍干燥，即可得到本發(fā)明最優(yōu)選的牦牛骨蛋白肽。

在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，使用上述方法制備得到的具有dpp-iv抑制和抗氧化功能的牦牛骨蛋白肽包括具有如下氨基酸序列的多肽：

val-leu-gly-leu-val-arg(vlglva，如seqidno.1所示)。

在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，使用上述方法制備得到的具有dpp-iv抑制和抗氧化功能的牦牛骨蛋白肽包括具有如下氨基酸序列的多肽：

leu-ala-leu-leu-glu-ala-arg(lallgaa，如seqidno.2所示)

在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，使用上述方法制備得到的具有dpp-iv抑制和抗氧化功能的牦牛骨蛋白肽包括具有如下氨基酸序列的多肽：

leu-glu-tyr-leu-glu-glu-lys(lgtlggl，如seqidno.3所示)

含有上述3種多肽中任一種的牦牛骨蛋白肽具有較好的dpp-iv抑制活性和抗氧化功能，dpp-iv抑制活性(ic50值)小于0.55g/ml。

在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，牦牛骨蛋白肽中活性成分包括上述3種多肽，進(jìn)一步優(yōu)選地，活性成分為上述3種多肽的組合，進(jìn)一步優(yōu)選地，上述3種肽的組合的含量在45％以上。

本發(fā)明的牦牛骨蛋白肽可以為粉末狀。

為了使整個(gè)加工過程更加簡單且不用添加酸或堿進(jìn)行ph的調(diào)整，步驟1)中的牦牛骨蛋白液是以牦牛骨為原料，經(jīng)高溫蒸煮和去脂得到的。

即本發(fā)明還提供了上述牦牛骨蛋白肽的制備方法，包括以下步驟：

1)以牦牛骨為原料，經(jīng)高溫蒸煮和去脂得到牦牛骨蛋白液；

2)將步驟1)制得的牦牛骨蛋白液經(jīng)過復(fù)合蛋白酶分步酶解；

3)將步驟2)酶解后的產(chǎn)物除雜、膜分離、凝膠分離以及反相hplc分離，濃縮，冷凍干燥后即得。

其中，步驟2)和步驟3)的進(jìn)一步優(yōu)選方案參照上述內(nèi)容。

在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，步驟1)中牦牛骨蛋白液的制備具體可以為：

選用冷凍鮮牦牛骨，用符合飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的清潔水清洗,牦牛骨清洗后用牛骨粉碎將牦牛骨打成骨粒，加入牦牛骨顆?？偭?.0～3.0倍的水在121-131℃條件下處理2-5小時(shí)，然后通過離心過濾得到去骨渣的牦牛骨高溫蒸煮液，冷卻到15-30℃，通過分液罐去脂，得到牦牛骨蛋白液。

為了保持較好的功能特性，較易實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，牦牛骨蛋白肽的制備方法具體可以為：

1)選用冷凍鮮牦牛骨，用符合飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的清潔水清洗,牦牛骨清洗后用牛骨粉碎將牦牛骨打成骨粒，加入牦牛骨顆?？偭?.0～3.0倍的水在121-131℃條件下處理2-5小時(shí)，然后通過離心過濾得到去骨渣的牦牛骨高溫蒸煮液，冷卻到15-30℃，通過分液罐去脂，得到牦牛骨蛋白液；

將得到的牦牛骨蛋白液，溫度調(diào)整到65-75℃，利用超聲波發(fā)生器經(jīng)超聲波(頻率為50-80kh)處理15-25分鐘，改變牦牛骨膠原蛋白的組織結(jié)構(gòu)；

2)調(diào)節(jié)牦牛骨蛋白液中蛋白含量為6-9％，按照牦牛骨蛋白液中蛋白重量0.4～1.0％的重量百分比加入復(fù)合蛋白酶進(jìn)行分步酶解，

第一步利用0.2～0.5％第一復(fù)合蛋白酶(堿性蛋白酶和中性蛋白酶組成，它們之間的質(zhì)量比為1～2：1)，在45～60℃條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)0.5～1.5h；

然后進(jìn)行第二步利用0.2～0.5％第二復(fù)合蛋白酶(胰蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶組成，它們之間的質(zhì)量比為1：1～2)，在45～55℃條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)1.0～2.0h；

3)在90～95℃下保溫10～20分鐘，冷卻至室溫，加入酶解液重量0.2-0.6％的活性炭于酶解液中，通過硅藻土進(jìn)行分離，收集分離液；

膜分離：將上述步驟所得的分離液通過兩步超濾方法進(jìn)行處理，利用孔徑為10000道爾頓的陶瓷膜超濾，先將分子量小于10000道爾頓的蛋白和多肽分離出來，再用孔徑為5000道爾頓的膜將分子量小于5000道爾頓的蛋白肽分離出來；

凝膠分離以及反相hplc分離：取分子量為小于5000的蛋白肽液，再經(jīng)過sephadexg-15凝膠分離，洗脫液為去離子水，洗脫峰在280nm下進(jìn)行檢測，收集第1個(gè)洗脫峰；通過濃縮、冷凍干燥，得到牦牛骨蛋白肽；再用rp-hplc反相高效液相色譜進(jìn)行1次分離，收集經(jīng)過rp-hplc反相高效液相色譜分離中9-13分中的肽洗脫液；

將上述步驟得到的肽溶液通過濃縮、冷凍干燥，得到牦牛骨蛋白肽粉。

由上述制備方法得到牦牛骨蛋白肽分子量低于1000的肽的比例為85％以上，在具有抑制dpp-iv活性的同時(shí)，也還具有較好的抗氧化能力，在20μg/ml的條件下，其清除dpph自由基能力達(dá)到88％以上，還原力達(dá)到0.88以上。

本發(fā)明還提供了上述牦牛骨蛋白肽以及上述制備牛骨蛋白肽的方法在制備預(yù)防或治療受益于dpp-iv抑制和/或抗氧化的疾病的藥物或食品中的應(yīng)用。

本發(fā)明的牦牛蛋白肽可以作為藥物，或是膳食補(bǔ)充劑，或作為食品基料加入到普通食品如飲料、乳制品等中，本發(fā)明的藥物或食品可用于治療糖尿病、神經(jīng)疾病、炎癥性疾病如關(guān)節(jié)炎、高血壓、心腦血管等能夠用dpp-iv抑制劑和抗氧化劑治療的其他疾病。

本發(fā)明的牦牛骨蛋白肽具有優(yōu)異的dpp-iv抑制和抗氧化功能，dpp-iv抑制活性(ic50值)小于0.55mg/ml；本發(fā)明開發(fā)的牦牛骨蛋白肽制備方法簡單，整個(gè)加工過程中沒有添加酸或堿進(jìn)行ph的調(diào)整，產(chǎn)品保持較好的功能特性，較易實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)；本發(fā)明開發(fā)的產(chǎn)品安全，本發(fā)明采用多種食品級復(fù)合蛋白酶(堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶)，經(jīng)在溫和條件下，經(jīng)過適度酶解獲得特定分子量的肽組成的牦牛骨蛋白肽，不加任何添加劑，為100％牦牛骨蛋白肽。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。

若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)技術(shù)手段。若未特別指明，實(shí)施例中所用的試劑為市售。

實(shí)施例1：具有dpp-ⅳ抑制和抗氧化功能的牦牛骨蛋白肽的制備

(1)選用冷凍鮮牦牛骨100克，用符合飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的清潔水清洗,牦牛骨清洗后用牛骨粉碎機(jī)將牦牛骨打成骨粒，加入牦牛骨顆粒總量2倍的水在121℃條件下處理5小時(shí)，通過離心過濾得到去骨渣的牦牛骨蒸煮液，冷卻到20℃，通過分液罐去脂，得到牦牛骨蛋白液。

(2)將(1)得到的牦牛骨蛋白液，溫度調(diào)整到65℃，利用超聲波發(fā)生器經(jīng)超聲波(頻率為80kh)處理15分鐘。

(3)調(diào)節(jié)牦牛骨蛋白液中蛋白含量為8％，按照牦牛骨蛋白液中蛋白重量0.8％的重量百分比加入復(fù)合蛋白酶進(jìn)行分步酶解，第一步利用0.4％第一復(fù)合蛋白酶(堿性蛋白酶和中性蛋白酶的質(zhì)量比為1：1)，在50℃條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)1.5h；然后進(jìn)行第二步利用0.4％第二復(fù)合蛋白酶(胰蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶的質(zhì)量比為1：2)，在55℃條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)1.0h；在95℃下保溫10分鐘，冷卻至室溫，加入酶解液重量0.2％的活性炭于酶解液中，通過硅藻土進(jìn)行分離，收集分離液；

(4)將步驟(3)所得的分離液利用孔徑為10000道爾頓的陶瓷膜超濾，先將分子量小于10000的蛋白和多肽分離出來，再用孔徑為5000道爾頓的膜將分子量小于5000道爾頓的蛋白肽分離出來。

(5)取分子量為小于5000的蛋白肽液，再經(jīng)過sephadexg-15凝膠分離，洗脫液為去離子水，洗脫峰在280nm下進(jìn)行檢測，收集第1個(gè)洗脫峰；通過濃縮、冷凍干燥，得到經(jīng)過凝膠分離的牦牛骨蛋白肽；再用rp-hplc反相高效液相色譜進(jìn)行1次分離，取9-11分收集的肽溶液；

(6)將步驟(5)得到的肽溶液通過濃縮、冷凍干燥，得到具有dpp-ⅳ抑制和抗氧化功能的骨膠原蛋白肽粉。通過lc-ms/ms對骨膠原蛋白肽的主要成分進(jìn)行測定，其氨基酸序列為val-leu-gly-leu-val-arg，leu-ala-leu-leu-glu-ala-arg，leu-glu-tyr-leu-glu-glu-lys。上述肽的含量共為45.3％。經(jīng)檢測，該蛋白肽中生物活性最高的三種肽分別為上述三種肽。

實(shí)施例2：具有dpp-ⅳ抑制和抗氧化功能的牦牛骨蛋白肽的制備

(1)選用冷凍鮮牦牛骨500克，用符合飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的清潔水清洗,牦牛骨清洗后用牛骨粉碎機(jī)將牦牛骨打成骨粒，加入牦牛骨顆?？偭?.5倍的水在130℃條件下處理3小時(shí)，通過離心過濾得到去骨渣的牦牛骨蒸煮液，冷卻到30℃，通過分液罐去脂，得到牦牛骨蛋白液。

(2)將(1)得到的牦牛骨蛋白液，溫度調(diào)整到70℃，利用超聲波發(fā)生器經(jīng)超聲波(頻率為70kh)處理20分鐘。

(3)調(diào)節(jié)牦牛骨蛋白液中蛋白含量為9％，按照牦牛骨蛋白液中蛋白重量1.0％的重量百分比加入復(fù)合蛋白酶進(jìn)行分步酶解，第一步利用0.4％第一復(fù)合蛋白酶(堿性蛋白酶和中性蛋白酶的質(zhì)量比為1：1)，在50℃條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)1.5h；然后進(jìn)行第二步利用0.6％第二復(fù)合蛋白酶(胰蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶的質(zhì)量比為1：1)，在50℃條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)1.0h；在95℃下保溫10分鐘，冷卻至室溫，加入酶解液重量0.4％的活性炭于酶解液中，通過硅藻土進(jìn)行分離，收集分離液；

(4)將步驟(3)所得的分離液利用孔徑為10000道爾頓的陶瓷膜超濾，先將分子量小于10000的蛋白和多肽分離出來，再用孔徑為5000道爾頓的膜將分子量小于5000道爾頓的蛋白肽分離出來。

(5)取分子量為小于5000的蛋白肽液，再經(jīng)過sephadexg-15凝膠分離，洗脫液為去離子水，洗脫峰在280nm下進(jìn)行檢測，收集第1個(gè)洗脫峰；通過濃縮、冷凍干燥，得到經(jīng)過凝膠分離的牦牛骨蛋白肽；再用rp-hplc反相高效液相色譜進(jìn)行1次分離，取10-13分收集的肽溶液；

(6)將步驟(5)得到的肽溶液通過濃縮、冷凍干燥，得到具有dpp-ⅳ抑制和抗氧化功能的骨膠原蛋白肽粉。通過lc-ms/ms對骨膠原蛋白肽的主要成分進(jìn)行測定，其氨基酸序列為val-leu-gly-leu-val-arg，leu-ala-leu-leu-glu-ala-arg，leu-glu-tyr-leu-glu-glu-lys的肽的含量為48％。經(jīng)檢測，該蛋白肽中生物活性最高的三種肽分別為上述三種肽。

實(shí)施例3：具有dpp-ⅳ抑制和抗氧化功能的牦牛骨蛋白肽的制備

(1)選用冷凍鮮牦牛骨1000克，用符合飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的清潔水清洗,牦牛骨清洗后用牛骨粉碎機(jī)將牦牛骨打成骨粒，加入牦牛骨顆?？偭?.0倍的水在125℃條件下處理3小時(shí)，然后通過離心過濾得到去骨渣的牦牛骨高溫蒸煮液，冷卻到25℃，通過分液罐去脂，得到牦牛骨蛋白液。

(2)將(1)得到的牦牛骨蛋白液，溫度調(diào)整到75℃，利用超聲波發(fā)生器經(jīng)超聲波(頻率為60kh)處理25分鐘。

(3)調(diào)節(jié)牦牛骨蛋白液中蛋白含量為9％，按照牦牛骨蛋白液中蛋白重量0.6％的重量百分比加入復(fù)合蛋白酶進(jìn)行分步酶解，第一步利用0.3％第一復(fù)合蛋白酶(堿性蛋白酶和中性蛋白酶組成，它們之間的質(zhì)量比為2：1)，在60℃條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)1.0h；然后進(jìn)行第二步利用0.3％第二復(fù)合蛋白酶(胰蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶組成，它們之間的質(zhì)量比為1：1)，在50℃條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)2.0h；在90℃下保溫20分鐘，冷卻至室溫，加入酶解液重量0.6％的活性炭于酶解液中，通過硅藻土進(jìn)行分離，收集分離液；

(4)將步驟(3)所得的分離液通過兩步超濾方法進(jìn)行處理，利用孔徑為10000道爾頓的陶瓷膜超濾，先將分子量小于10000的蛋白和多肽分離出來，再用孔徑為5000道爾頓的膜將分子量小于5000道爾頓的蛋白肽分離出來。

(5)取分子量為小于5000的蛋白肽液，再經(jīng)過sephadexg-15凝膠分離，洗脫液為去離子水，洗脫峰在280nm下進(jìn)行檢測，收集第1個(gè)洗脫峰；通過濃縮、冷凍干燥，得到經(jīng)過凝膠分離的牦牛骨蛋白肽；再用rp-hplc反相高效液相色譜進(jìn)行1次分離，取9-12分收集的肽溶液；

(6)將步驟(5)得到的肽溶液通過濃縮、冷凍干燥，得到具有dpp-ⅳ抑制和抗氧化功能的骨膠原蛋白肽粉。通過lc-ms/ms對骨膠原蛋白肽的主要成分進(jìn)行測定，其氨基酸序列為val-leu-gly-leu-val-arg，leu-ala-leu-leu-glu-ala-arg，leu-glu-tyr-leu-glu-glu-lys的肽的含量為46％。經(jīng)檢測，該蛋白肽中生物活性最高的三種肽分別為上述三種肽。

實(shí)驗(yàn)例1：牦牛骨蛋白肽dpp-ⅳ抑制能力的測定試驗(yàn)

試驗(yàn)樣品：樣品1、2、3分別為實(shí)施例1、實(shí)施例2、實(shí)施例3制備的牦牛骨蛋白肽，樣品4為實(shí)施例1的牦牛骨蛋白液經(jīng)過冷凍干燥達(dá)到的牦牛骨蛋白粉。

按照如下方法進(jìn)行：

將樣品用100mmol/l的tris-hcl(ph8.0)緩沖液稀釋至合適的濃度，吸取25μl樣品稀釋液與25μl底物(濃度為1.6mmol/l)混合，加入到96孔酶標(biāo)板中。在37℃下孵育10min后，加入50μldpp-iv酶液(酶活力為8u/l)，混勻后在37℃下精確孵育60min，立即加入100μl1mol/l的醋酸-醋酸鈉(ph4.0)緩沖液終止反應(yīng)，于405nm下測吸光值a，并根據(jù)下列公式計(jì)算樣品的dpp-iv抑制率。

dpp-iv抑制率％＝{1-(a樣品-a樣品空白對照)/(a陰性對照-a陰性空白對照)}×100

a樣品：為樣品反應(yīng)液在405nm處的吸光值a；

a樣品空白對照：以tris-hcl緩沖液代替dpp-iv酶液作為樣品空白對照的吸光值a；

a陰性對照：以tris-hcl緩沖液代替樣品作為陰性對照的吸光值；

a陰性空白對照：以tris-hcl緩沖液代替dpp-iv酶液和樣品作為陰性空白對照的吸光值

dpp-iv抑制的ic50值測定：

測定樣品在不同濃度下的dpp-iv抑制率，以多肽濃度的對數(shù)值與抑制率做回歸曲線，得到回歸方程，由此計(jì)算ic50，即50％的dpp-iv酶活性抑制是肽的濃度。

結(jié)果：見表1。本發(fā)明牦牛骨蛋白肽具有很好的dpp-iv抑制能力，dpp-iv抑制活性(ic50值)低于0.55mg/ml，顯著低于同類復(fù)合蛋白肽的ic50值，具有很好的dpp-iv抑制能力。

表1本發(fā)明牦牛骨蛋白肽的dpp-iv抑制能力

實(shí)驗(yàn)例2：本發(fā)明牦牛骨蛋白肽抗氧化活性的測定試驗(yàn)

試驗(yàn)樣品：樣品1、2、3分別為實(shí)施例1、實(shí)施例2、實(shí)施例3制備的牦牛骨蛋白肽，樣品4為實(shí)施例1的牦牛骨蛋白液經(jīng)過冷凍干燥達(dá)到的牦牛骨蛋白粉。

按照如下方法進(jìn)行：

(1)清除dpph自由基能力：取20μg/ml的抗氧化活性肽1.5ml，加入99.5％乙醇1.5ml和0.02％dpph乙醇溶液0.675ml混合，振蕩混勻，室溫下避光水浴30min，然后在517nm下檢測體系吸光值。吸光值越低，體系的清除dpph自由基能力越強(qiáng)。空白對照即是將樣品溶液1.5ml換成去離子水1.5ml。

dpph自由基清除能力％＝((空白吸光值-樣品吸光值)/空白吸光值)×100

(2)還原力測定：取20μg/ml的抗氧化活性肽1ml，加入0.2m磷酸緩沖液(ph6.6)2.5ml和1％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的鐵氰化鉀溶液2.5ml，混勻，然后在50℃水浴加熱20min。取出迅速冷卻，加入10％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))三氯乙酸(tca)溶液2.5ml，混合均勻，然后在3000g下離心10min。取上清液2.5ml，加入去離子水2.5ml和1％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))三氯化鐵溶液0.5ml，充分混勻，在室溫下反應(yīng)10min，用700nm波長測定吸光度。還原力即可用700nm波長處吸光值表示。

從表2可以看出，本發(fā)明牦牛骨蛋白肽分子量低于1000的肽達(dá)到85％以上，具有較好的抗氧化能力，在20μg/ml的條件下，其清除dpph自由基能力達(dá)到88％以上，還原力達(dá)到0.88以上，也是一種較好的抗氧化肽。

表2本發(fā)明牦牛骨蛋白肽的抗氧化活性試驗(yàn)結(jié)果

最后，本發(fā)明的方法僅為較佳的實(shí)施方案，并非用于限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

序列表

<110>青海國肽生物科技有限公司

<120>具有dpp-iv抑制活性的牦牛骨蛋白肽及制備方法

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