本發(fā)明公開了一種厭氧氨氧化菌干粉菌劑制備與保藏的方法，屬于含氮廢水生物處理技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及到一種在高溫烘干環(huán)境下為菌種提供保護機制的保護劑。

背景技術(shù)：

厭氧氨氧化是以NH₄⁺-N為電子供體、NO₂^--N為電子受體生成N₂的微生物反應。該技術(shù)與傳統(tǒng)的硝化反硝化脫氮技術(shù)相比，不需有機碳源，節(jié)省碳源100％、節(jié)省63％曝氣量、剩余污泥產(chǎn)量減少80％，不需額外投加堿度，，被國內(nèi)外公認為是一種可持續(xù)的污水生物脫氮技術(shù)。但因其倍增時間長(約10.5天)，增長緩慢，純種培養(yǎng)難以進行，導致應用于實際廢水處理啟動周期過長，世界第一個工業(yè)化厭氧氨氧化工藝處理氨氮廢水裝置用時3.5年之久，因此培養(yǎng)保藏厭氧氨氧化菌，建立菌種儲庫，為污水處理應用提供足夠量的菌種成為工業(yè)化規(guī)模應用的關(guān)鍵^[1]。[1]褚美紅，姬玉欣，葉小青等.厭氧氨氧化菌種的低溫保藏條件.杭州師范大學學報(自然科學版).2014(02):164-167.

菌種保藏的方法很多，常見的有液體石蠟法、沙土保藏法、液氮法、冷藏法、冷凍法、凍干法及凝膠包埋法等。其原理主要是根據(jù)微生物的生理生化特點，人為創(chuàng)造低溫、干燥或缺氧條件，抑制微生物的代謝作用，使其生命活動降至最低程度或處于休眠狀態(tài)，使菌株很少發(fā)生突變，以達到保持純種的目的^[2]。[2]付美紅，王耀耀，朱妍妍等.微生物菌種的保藏方法.河北化工.2010(4)：33-34.

當前，厭氧氨氧化菌種保藏的方法集中于冷藏法、冷凍法及凍干法，同時添加低溫保護劑(如二甲亞砜、海藻糖、甘油、葡萄糖、聚乙烯醇、海藻酸鈉等)、保藏基質(zhì)(NH₄⁺-N、NO₂^--N等)或緩沖液(鉬酸鹽、NO₃^--N等)，實驗證明對厭氧氨氧化菌種保藏起到一定的積極作用。但冷藏法保藏效果較差，菌體死亡率較高；冷凍法、凍干法設(shè)備成本高且操作繁瑣，同時不利于大規(guī)模的工業(yè)化應用。而高溫烘干法可節(jié)約設(shè)備及時間成本，與此同時方便菌種的運輸，但目前尚無相關(guān)文獻報道。

厭氧氨氧化菌對環(huán)境條件苛刻的本性決定了需要尋求一種長遠高效的保藏方法。在進行干法保藏時，需考慮干燥溫度、干燥時間、保護劑、保藏溫度及活性恢復措施對厭氧氨氧化菌保藏效果的影響。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對目前厭氧氨氧化保藏技術(shù)的不足，提出了一種真空烘干法進行厭氧氨氧化菌干法保藏的優(yōu)化方法。該方法操作簡便，耗時短，能夠?qū)崿F(xiàn)厭氧氨氧化菌短期保藏及工業(yè)化應用的目標。

本發(fā)明的技術(shù)方案：

一種厭氧氨氧化菌干粉菌劑制備與保藏的方法，步驟如下：

(1)將待保藏的厭氧氨氧化菌混培物取出，離心，棄去上清液；再加入0.01M磷酸鹽緩沖溶液、渦旋器渦旋混勻，離心去除上清液，重復三次，得到厭氧氨氧化菌沉淀物；

(2)將步驟(1)得到的厭氧氨氧化菌沉淀物與質(zhì)量分數(shù)為1～3％的海藻酸鈉溶液按照質(zhì)量體積比5:8混合，混合過程進行氮氣吹掃；

(3)將步驟(2)得到的混合物置于真空干燥箱中，抽真空至壓力至25KPa以下，溫度為50～70℃，烘干，得到含水率為15～30％的厭氧氨氧化菌干粉菌劑；

(4)干燥結(jié)束后，將厭氧氨氧化菌干粉菌劑進行真空封口，置于4℃環(huán)境下避光保存?zhèn)溆谩?/p>

步驟(2)的混合過程避光處理。

本發(fā)明的有益效果：

1.海藻酸鈉作為烘干保護劑減少了厭氧氨氧化菌在50～70℃環(huán)境下的細胞損壞，有效降低了其死亡率，流式細胞儀測試結(jié)果顯示其存活率在保存初期(10～15天)在95％以上；

2.利用凍干法進行干粉制備時干燥時間較長，一般為24～48h，而此方法在最優(yōu)溫度下干燥時間僅僅為5～7h。

3.在將保存一個月后的干粉投入反應器中進行實驗時，在為期30天的連續(xù)實驗結(jié)束時，厭氧氨氧化反應器的比厭氧氨氧化活性(SAA)可從啟動時的0％提高到40％，相較于新鮮的菌液而言。這對于30天的啟動時間而言，活性恢復效果達到了較好的效果。

附圖說明

圖1為不同烘干溫度下下菌種的烘干時間及存活率，其中海藻酸鈉濃度為2％(質(zhì)量分數(shù))，使用儀器為流式細胞儀。

圖2為2％海藻酸鈉作為保護劑的連續(xù)實驗三氮濃度變化圖，其中烘干溫度為60℃。

圖3為2％海藻酸鈉作為保護劑的連續(xù)實驗NO₂^--N_r/NH₄⁺-N_r化學計量比變化圖，其中烘干溫度為60℃。

圖4為2％海藻酸鈉作為保護劑的連續(xù)實驗NO₃^--N_p/NH₄⁺-N_r化學計量比變化圖，其中烘干溫度為60℃。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的突出特點和顯著進步作進一步闡明，僅在于說明本發(fā)明而決不局限于以下實例。采用本發(fā)明制備厭氧氨氧化菌干粉菌劑并對其保藏效果進行測試。

實施例1：不同烘干溫度下菌種的烘干時間及存活率

反應條件：在不同溫度下(40℃,45℃,50℃,55℃,60℃,65℃)制得厭氧氨氧化菌并記錄烘干時間，在4℃避光保藏10天后上流式細胞儀檢測存活率。

結(jié)果如圖1所示，隨著干燥溫度的升高，烘干時間從20h降低到4h；與此同時存活率也呈下降趨勢，從99.8％下降到95.5％，但是在60℃時出現(xiàn)極值點。

整體來看，海藻酸鈉作為保護劑對于厭氧氨氧化菌在高溫環(huán)境下烘干起到很好的保護作用。在40℃下烘干存活率最高，但是烘干時間過長?？紤]到改變溫度對菌種存活率影響不大，為其工業(yè)化應用應盡可能縮短烘干時間，故選取60℃作為溫度優(yōu)化條件。

實施例2：干粉復壯活性測試

反應條件：將在60℃條件下制得的干粉真空密封避光保藏一個月后取出，用磷酸鹽緩沖溶液洗凈海藻酸鈉殘留后投入到250ml模擬反應器中。反應器采用磁力攪拌器進行攪拌，每天充氮氣以除去反應器內(nèi)進入的氧氣以保證厭氧環(huán)境，外部用遮光布避光。

進出水三氮濃度變化如圖2所示，在反應前3天為菌體水解期，主要特征為部分菌體自溶，導致出水氨氮濃度高于進水氨氮濃度。這是由于在保藏期間有部分菌體死亡，投入水中后釋放出部分氨氮。而此時出水亞硝氮和硝氮濃度卻接近于0，因此，該階段的厭氧氨氧化作用十分微弱，而利用亞硝酸和硝酸作為電子受體的反硝化反應將二者消耗殆盡，占主導地位。

在反應的第4-15天為活性遲滯期，主要特征為菌體逐漸停止自溶，氨氮與亞硝氮開始同時消失，厭氧氨氧化反應初顯。在該階段，氨氮去除率從10％上升到45％，亞硝氮去除率呈現(xiàn)出先下降后上升的趨勢，而硝氮有所生成。由圖3和圖4可得，在此階段NO₂^--N_r/NH₄⁺-N_r和NO₃^--N_p/NH₄⁺-N_r仍偏離理論值1.32 和0.26。在活性遲滯階段，不適合無機環(huán)境的菌體隨出水洗出反應器，由菌體自溶增加的氨氮和有機物含量逐步減少，使得反硝化作用減弱。

在啟動后期，氨氮去除率和亞硝氮去除率逐步提高，最終二者的去除率接近90％。而由圖3和圖4可見N_r/NH₄⁺-N_r和NO₃^--N_p/NH₄⁺-N_r分別為(0.96±0.02)和(0.24±0.01)。后者已接近理論值，而前者與理論值1.32仍有一定差距，說明反硝化作用仍然存在，但厭氧氨氧化作用的比例在逐漸增大，占據(jù)了主導地位，這也預示著成功對保藏菌種進行了復壯。

另外，本發(fā)明對反應器啟動前及啟動結(jié)束時厭氧氨氧化菌干粉的比厭氧氨氧化活性SAA進行了測定。結(jié)果顯示，在反應器運行一個月后，厭氧氨氧化菌的SAA由0kgN·kgVS^-1·d^-1升至(0.27±0.04)kgN·kgVS^-1·d^-1，而新鮮菌液所測得的SAA為0.68±0.03)kgN·kgVS^-1·d^-1，在啟動30天后活性已恢復到原來的40％，說明將海藻酸鈉作為保護劑并進行真空烘干4℃恒溫保藏是厭氧氨氧化菌干法保藏的一種創(chuàng)新又有效的方法。