本發(fā)明涉及食品安全免疫檢測
技術領域：
，具體地，涉及一種抗二乙氧基硫代磷酸酯類有機磷農藥的fab抗體及制備方法和應用。
背景技術：
：我國是農業(yè)大國，同時也是農藥生產與使用大國。有機磷是當今農藥中主要類別之一，其應用幾乎遍及了整個農藥領域。當今，市面上有機磷農藥商品不勝枚舉，特別在殺蟲劑方面，有機磷類農藥的使用量也是長年鰲居首位。然而，農藥是一把“雙刃劍”。全世界因有機磷農藥急性中毒引起的死亡每年超過20萬人，而由于長期低劑量接觸有機磷農藥而引起的腫瘤、生殖毒性及神經毒性等潛在中毒人數無法估計。盡管一些高毒的有機磷農藥(如對硫磷等)的使用已經被明令禁止，但是在農產品及環(huán)境中仍有殘留，此外，一些中低毒的有機磷農藥(如三唑磷、毒死蜱和治螟磷等)作為高毒農藥替代品正在農業(yè)生產中廣泛應用。近幾年衛(wèi)生部對市面所售葉類蔬菜進行衛(wèi)生監(jiān)督抽查，結果顯示，有機磷等禁用農藥仍然是葉類蔬菜抽檢不合格的主要原因。農藥殘留問題不僅僅危害到國內民眾的健康，還會影響我國在國際貿易中的地位和形象。在國際市場上，日趨嚴格的農藥殘留標準已成為發(fā)達國家或農產品進口國重要的技術貿易壁壘手段，然而，在我國趨于惡化的農產品農藥殘留問題已成為制約農產品貿易的首要因素之一，據統計，因有機磷農藥多殘留問題每年給我國的農產品貿易都帶來了巨額的經濟損失。為保證居民健康訴求，避免農藥殘留技術壁壘對我國農產品出口的影響，加強對此類農藥的檢測十分必要。目前國內外檢測有機磷農藥的常用方法主要集中在儀器方法如高效液相色譜-質譜聯用等方法以及酶抑制法，這些方法樣品預處理要求高、步驟復雜、操作需專業(yè)人員、檢測費用高、所依賴儀器昂貴復雜、費時費力，很難適應許多場合快速檢測的需要，在應用上不能廣泛推廣。而酶抑制法技術具有快速、簡便、低成本等特點，特別適合現場大批樣品的篩選檢測，易于推廣普及。但是穩(wěn)定性較差、性能差異性較大的酶制劑導致其準確度和可靠性均不太理想，無法滿足日趨嚴格的殘留限量標準?；诳乖?抗體特異性結合的免疫分析法具有樣品前處理簡便、操作簡單、快速、靈敏、高通量等特點，被譽為是21世紀最具競爭和挑戰(zhàn)的快速檢測技術，在食品安全領域具有廣闊的應用前景。隨著人們對抗體基因結構與功能的深入了解和分子生物學技術的發(fā)展及向各學科滲透，小分子有害物的特異性抗體制備正在朝著第三代抗體——基因工程抗體的方向發(fā)展。基因工程抗體最顯著的優(yōu)勢之一在于其分子量小，易于獲得抗體蛋白及其編碼序列，因此可以在分子水平對其進行進化改造，實現抗體性能的可控性?；蚬こ炭贵w技術，是將對免疫球蛋白基因結構與功能的認識與dna重組技術有機結合，在基因水平上對免疫球蛋白分子的基因片段進行重組后，轉入真核或原核表達系統中表達，形成基因工程重組抗體。應用dna重組和蛋白質工程技術可以按人們的意愿在基因水平上對抗體分子進行切割、拼接或修飾，重新組裝成新型抗體分子，并可賦予抗體分子新的生物學活性。fab片段是將重鏈fd(vh+ch1)段基因與完整的輕鏈基因5’端接上細菌的信號序列，所表達的蛋白在細菌信號肽的引導下可分泌到周質腔，信號肽被信號肽酶所裂解，生成的fd段和輕鏈在周質腔中完成立體折疊和鏈內鏈間二硫鍵形成異二聚體，成為有功能的fab。這種小分子抗體具有抗體的活性，而大小為完整抗體的三分之一。目前，還沒有針對二乙氧基硫代磷酸酯類有機磷農藥(dpps)的fab抗體。技術實現要素：本發(fā)明的目的是為了克服現有技術的上述不足，提供一種抗二乙氧基硫代磷酸酯類有機磷農藥的fab抗體。本發(fā)明的另一個目的是提供一種抗二乙氧基硫代磷酸酯類有機磷農藥的fab抗體的制備方法。本發(fā)明的在一個目的是提供一種抗二乙氧基硫代磷酸酯類有機磷農藥的fab抗體的應用。為了實現上述目的，本發(fā)明是通過以下技術方案予以實現的：一種抗二乙氧基硫代磷酸酯類有機磷農藥的fab抗體，包括輕鏈和重鏈，所述重鏈具有seqidno:1所示的氨基酸序列，或具有seqidno:1所示序列經缺失、取代或添加一個或多個氨基酸但與seqidno:1所示序列具有相同功能的氨基酸序列；所述輕鏈具有seqidno:2所示的氨基酸序列，或具有seqidno:2所示序列經缺失、取代或添加一個或多個氨基酸但與seqidno:2所示序列具有相同功能的氨基酸序列。一種抗二乙氧基硫代磷酸酯類有機磷農藥的fab抗體，包括輕鏈和重鏈，所述重鏈具有seqidno:3所示的核苷酸序列，或具有seqidno:3所示序列經缺失、取代或添加一個或多個核苷酸但與seqidno:3所示序列具有相同功能的核苷酸序列；所述輕鏈具有seqidno:4所示的核苷酸序列，或具有seqidno:4所示的序列經缺失、取代或添加一個或多個核苷酸但與seqidno:4所示序列具有相同功能的核苷酸序列。一種抗二乙氧基硫代磷酸酯類有機磷農藥的fab抗體的制備方法，包括如下步驟：將seqidno:3所示的重鏈和seqidno:4所示的輕鏈與載體質粒連接并進行鑒定之后，轉化受體菌株，篩選陽性重組受體菌株，經表達優(yōu)化后，獲得抗二乙氧基硫代磷酸酯類有機磷農藥的fab抗體。作為優(yōu)選實施方案，所述載體質粒為pcomb3xss質粒，所述受體菌株為大腸桿菌top10f’。更優(yōu)選地，所述陽性重組大腸桿菌top10f’的表達優(yōu)化條件為iptg誘導濃度為0.1～0.2mm，表達溫度為18～20℃，表達時間為10～14h。最優(yōu)選地，所述陽性重組大腸桿菌xl1-blue的表達優(yōu)化條件為iptg誘導濃度為0.1mm，表達溫度為18℃，表達時間為12h。最優(yōu)選地，一種抗二乙氧基硫代磷酸酯類有機磷農藥的fab抗體的制備方法，包括如下步驟：如上所述的抗二乙氧基硫代磷酸酯類有機磷農藥的fab抗體在檢測二乙氧基硫代磷酸酯類有機磷農藥中的應用。本發(fā)明提供的fab抗體可以用于檢測所有含有二乙氧基硫代磷酸醋共有結構的有機磷農藥，優(yōu)選地，所述二乙氧基硫代磷酸酯類有機磷農藥為蠅毒磷、對硫磷、除線磷、辛硫磷、喹硫磷、三唑磷、伏殺硫磷、甲拌磷、毒死蜱、乙基溴硫磷、治螟磷、氯唑磷、二嗪磷或乙基嘧啶磷中的一種或多種。優(yōu)選地，所述檢測的具體技術手段可以是酶聯免疫分析法或其他分析方法。與現有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果：本發(fā)明制備的基因工程抗體是針對抗dpps的單克隆抗體的抗原結合片斷；本發(fā)明建立的elisa檢測方法是的基于fab基因工程抗體的同時檢測dpps多殘留的elisa檢測方法，可實施大量樣品的快速檢測篩選，降低成本。本發(fā)明的fab抗體保持了親本抗體的抗原親和活性和特異性的功能性抗體片段，具有較高穩(wěn)定性和靈敏度，可通過基因工程技術體外表達得到，可在細菌中很經濟的大規(guī)模生產，避免單克隆細胞陽性丟失風險。附圖說明圖1為pcomb3xss-fab噬粒載體構建示意圖。圖2為pcomb3xss噬粒載體圖。圖3為icelisa測定fab抗體標準曲線。圖4為fab抗體三維同源建模模型圖。具體實施方式下面結合說明書附圖和具體實施例對本發(fā)明作出進一步地詳細闡述，所述實施例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。下述實施例中所使用的試驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，為可從商業(yè)途徑得到的試劑和材料。實施例1fab重組質粒的構建篩選與鑒定1.1總mrna提取s1.與rna實驗操作相關的pcr管，離心管，槍頭，鑷子等耗材及器具就先用0.1％depc溶液完全浸泡，次日倒盡depc溶液，高壓滅菌備用；s2.將培養(yǎng)好約1×107雜交瘤細胞12c2((xuetal.analyticalchemistry,2010,82,9314-9321)懸浮后加入到15ml離心管中，1000r/min離心沉淀細胞，棄上清液，用槍頭盡量吸盡殘液；s3.加入2mltrizol，用槍頭反復抽吸，混勻細胞，室溫下放置5min；s4.將此溶液各1ml分裝在兩個1.5ml無rnaase的離心管中，分別加入200μl氯仿，劇烈振蕩15s，室溫放置3min后，4℃，12000r/min離心15min；s5.小心吸取上層透明溶液(含rna)到兩個新的1.5ml無rnaase的離心管中(約500μl)，分別加入500μl異丙醇，渦旋混勻，4℃，12000r/min離心15min；s6.棄上清，在吸水紙上扣干殘留液體，加入1ml75％的乙醇，渦將白色沉淀懸浮，4℃下7500r/min離心5min，棄上清，在吸水紙上扣干殘留液體，并用移液槍盡量吸干管底液體，空氣中揮干殘留乙醇；s7.用rnaase水30～50μl溶解rna沉淀，取1μl稀釋到1ml，于核酸蛋白分析儀上測定rna含量與純度。1.2cdna第一鏈合成：cdna試劑盒購自香港萊德爾公司，參照試劑盒說明書進行。取總rna約10μg，70℃加熱5min以除去二級結構，立即置于冰上，于2min內準備好反應體系。將所有溶液混勻，短暫離心后，25℃退火10min，42℃,20min(反轉錄合成cdna第一鏈)，95℃,5min(反轉錄酶滅活)，反應產物置于冰上。1.3κ鏈(輕鏈)、fd段(重鏈)基因序列pcr擴增及鑒定引物序列見表1，其中上游引物mκ51、mκ52、mκ53三條引物混合與下游引物mκ3配對用于擴增抗體κ鏈基因，分別含有限制性酶切位點saci、xbai。上游引物mh5、下游引物mh3兩條引物配對用于擴增抗體fd段基因，分別含有限制性酶切位點xhoi、spei。pcr反應體系見表2，pcr反應條件：94℃變性5min，進行以下循環(huán)：94℃,50s，55℃,50s，72℃,50s，共30個循環(huán)，最后72℃延伸8min。反應完畢后，取反應產物5μl進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測。擴增后的pcr產物用pcr清潔試劑盒(北京天根生物技術有限公司)進行切膠純化。純化后的κ鏈、fd段基因目的片段用peasy-bluntsimplecloningkit試劑盒(北京全式金生物有限公司)進行t載體連接以及轉化。挑取單克隆陽性轉化菌落進行培養(yǎng)、質粒提取并進行雙酶切和測序鑒定。表1為pcr擴增所用兼并引物表2為κ鏈、fd段基因序列擴增pcr反應體系cdna第一鏈反應物(約10μg)2μl10×pcrbuffer2μldntp(2.5mmol/l)1.2μlmgcl2(25mmol/l)1.2μlmκ5/mh5混合引物(10μmol/l)0.6μlmκ3/mh3引物(10μmol/l)0.6μlrtaq酶(20u/μl)0.4μl無菌純水12μl總體積20l1.3pcomb3xss重組質粒的構建pcomb3xss重組質粒的構建如圖1所示，κ鏈、fd段序列以及pcomb3xss(圖2)質粒進行雙酶切，反應體系見表3～5。反應條件：37℃反應3小時或4℃反應過夜。酶切后的κ鏈、fd段片段與pcomb3xss載體的進行連接，反應體系見表6，反應條件：22℃反應1小時或4℃反應過夜。表3為κ鏈雙酶切體系peasy-t3-κ質粒(約200ng)8μl10×buffer5μlsaci2μlxbai2μl無菌純水33μl總體積50μl表4為fd段雙酶切體系peasy-t3-κ質粒(約200ng)8μl10×buffer5μlspei2μlxhoi2μl無菌純水33μl總體積50μl表5為pcomb3xss雙酶切體系pcomb3xss質粒(約200ng)8μl10×buffer5μlspei2μlsaci2μl無菌純水33μl總體積50μl表6為pcomb3xss連接體系雙酶切κ鏈/fd段純化產物(60ng)4μl預雙酶切pcomb3xss(100ng)4μl10×buffer1μlt4連接酶1μl總體積10μl1.4κ鏈、fd段雙酶切片段與pcomb3xss載體連接產物的轉化將5μl的連接產物加入到50μl以上制備好的xl1-blue感受態(tài)細胞中，輕輕旋轉以混勻內容物，置于冰上。將管放入預冷至0℃的電擊杯中，放置于預冷電擊儀內，啟動電穿孔開關，結束后將感受態(tài)細胞吸出。加入1ml2×yt培養(yǎng)基中，37℃，250r/min振蕩培養(yǎng)45min；取100μl菌液涂布于lb-ag平板上，37℃靜置培養(yǎng)過夜。1.5pcomb3xss重組質粒的phage-elisa篩選式(i)展示半抗原結構(專利公開號cn101475587a)，通過活潑酯法偶聯到ova，形成包被原。半抗原-ova包被抗原用包被液稀釋至1μg/ml，100μl/孔加入到酶標板上，4℃孵育過夜。棄孔中溶液，用pbst洗滌2次，將封閉液150μl/孔加入到酶標板上，37℃孵育3h。棄孔中溶液，37℃烘干后，4℃避光保存，用于phage-elisa篩選。酶切鑒定含κ鏈與fd段兩個插入片段的單菌落，以1ml含0.1μg/mlamp的2×yt培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，加入30μl5×1010pfu/ml輔助噬菌體vcsm13，30℃，250r/min振蕩培養(yǎng)12h。取誘導菌液，50μl/孔加到酶標板上，3個平行，加入50μl/孔0.01mpbs。同時以包被了ova蛋白的酶標板作為空白對照。37℃溫育1h，pbst(0.01mpbs含有0.5％吐溫-20)洗滌4次，加入100μl抗m13抗體-hrp二抗(用pbst1:5000稀釋)，37℃溫育1h，pbst洗滌4次，加入100μl的tmb底物液，37℃反應15min至出現明顯藍色，加入50μl終止液終止反應，用酶標儀測定od450nm。以a450nm值大于陰性對照3倍以上判定為陽性。獲得的陽性克隆后，進行過夜培養(yǎng)，抽提的質粒為陽性pcomb3xss-重組質粒。實施例2fab抗體基因序列測定及同源建模取經phage-elisa篩選陽性驗證的大腸桿菌菌株進行序列測定，測序引物為通用引物ompa和gback。fab抗體重鏈可變區(qū)氨基酸序列見seqidno：1所示的氨基酸序列；輕鏈可變區(qū)氨基酸序列seqidno：2所示的氨基酸序列。fab抗體重鏈可變區(qū)核苷酸序列見seqidno：3所示的氨基酸序列；輕鏈可變區(qū)核苷酸序列seqidno：4所示的氨基酸序列。重鏈采用同源性為90.54，coverage為99％的蛋白質(pdbid:1wc7)為模板，輕鏈采用同源性為96.73，coverage為100％的蛋白質(pdbid:1wej)為模板。fab三維圖形如圖4所示。實施例3fab可溶性表達本發(fā)明所采用的pcomb3xss噬粒載體是含有噬菌體基因間隔區(qū)的質粒載體，它綜合了噬菌體和質粒載體的優(yōu)點，噬粒在多克隆位點與gⅲ之間有一個琥珀酸終止子(amberstopcodon)，當重組噬菌體pcomb3xss-fab轉化抑制型大腸桿菌xl1-blue時，琥珀酸終止子被通讀成谷氨酸，結果抗體融合蛋白會表達在噬菌體的表面，即噬菌體表面展示。當pcomb3xss-fab轉化非抑制型的大腸桿菌top10f’，琥珀酸終止子被辨認為終止密碼子，通過乳糖類似物iptg的誘導，抗體表達后分泌到胞漿中，成為可溶性分子。將陽性pcomb3xss重組質粒轉化大腸桿菌top10f’，其步驟如下：s1.從-70℃冰箱取出凍存的top10f’感受態(tài)細胞(50μl)，冰上融化，加在1.5ml離心管中，輕輕混勻，冰上靜置30min，然后42℃水浴熱擊90s，于冰上放置1～2min。s2.隨后加入950μl2×yt培養(yǎng)基，置于37℃搖床中，200r/min振蕩培養(yǎng)1h，使細菌復蘇并表達質粒編碼的抗生素抗性標記基因。s3.取適量菌液涂布于含有amp的lb平板上，倒置37℃靜置過夜。同時做未轉化菌對照。s4.陽性pcomb3xss-fab重組質粒帶有氨芐抗性標記，在抗氨芐青霉素的lb平板上挑取白色菌落，接種于10ml含100μg/ml氨芐青霉素的lb液體培養(yǎng)基，37℃條件下，200r/min振蕩培養(yǎng)過夜。將轉化至top10f’的陽性pcomb3xss克隆子接種于10ml2×yt培養(yǎng)基中，37℃，250r/min振蕩培養(yǎng)過夜。取過夜培養(yǎng)菌液2ml加入到100ml2×yt培養(yǎng)基中，37℃，250r/min振蕩培養(yǎng)至a600nm為0.6～0.8，補加iptg，250r/min振蕩培養(yǎng)過夜表達。同時以不含質粒的空菌top10f’設置為陰性對照。優(yōu)選地，iptg誘導濃度為0.1mm。優(yōu)選地，表達溫度為18℃。優(yōu)選地，表達時間為12小時。實施例4fab可溶性蛋白提取本發(fā)明采用tris-蔗糖法提取大腸桿菌周質腔中的fab蛋白。其具體步驟如下：s1.取200ml已經過表達的菌液，8000rpm離心15min，棄掉上清液。加入20mltris-蔗糖-edta溶液，用移液槍把沉積在離心管底部的細菌吹散，然后攪拌10min。s2.將攪拌后的菌液8000rpm離心，離心溫度為4℃，離心時間為10min。離心后棄掉上清。s3.加入10ml冰凍的5mmol/lmgso4溶液，用移液槍把沉積在離心管底部的細菌吹散。在冰上緩慢攪拌1h，此時周質腔蛋白被釋放到溶液中，然后8000rpm離心，離心溫度為4℃，離心時間為10min，取上清液，上清液即為fab蛋白提取液。實施例5fab可溶性蛋白ci-elisa檢測測定fab與蠅毒磷、對硫磷、除線磷、辛硫磷、喹硫磷、三唑磷、伏殺硫磷、甲拌磷、毒死蜱、乙基溴硫磷、治螟磷、氯唑磷、二嗪磷以及乙基嘧啶磷14種dpps的半抑制濃度(ic50)，按下式計算交叉反應率cr(％)：cr(％)＝[ic50(hapten)/ic50(dpps)]×100％ci-elisa檢測步驟如下：s1.包被：用包被液將包被原稀釋至合適1μg/ml，加入酶標板孔中，100μl/孔，37℃水浴箱中過夜。s2.洗滌：傾去孔內液體，洗板機洗板2次，每孔加洗滌液250μl，甩干孔中液體。s3.封閉：每孔加入120μl封閉液，37℃封閉3h，甩干孔內液體，倒置于37℃烘箱中1h備用。s4.加樣及孵育：將半抗原稀釋成系列梯度標準液，分別稀釋為10000、1000、100、10、1、0.1、0.01ng/ml，每孔加50μl，然后加入合理稀釋fab蛋白稀釋液50μl。稀釋震蕩混勻，37℃水浴箱中反應40min后，洗板機洗板5次，每孔加入洗滌液250μl，甩干孔中液體。s5.加二抗：每孔加入100μl稀釋5000倍的hrp-羊抗鼠fab片段i，37℃水浴箱中反應30min后，洗板同s4。s6.顯色：tmb底物液和底物緩沖液等體積混合，每孔加入混合液100μl，置于37℃水浴箱中顯色10min后，每孔加入50μl10％h2so4終止液。s7.測定：用酶聯免疫檢測儀測定各孔a450nm的吸光值。s8.計算：用origin8.5的四參數擬合模塊計算抑制曲線的ic50值，標準曲線見圖4。本發(fā)明以免疫半抗原h(huán)apten(式i)為參照物(cr＝100％)，采用間接ci-elisa方法對14種dpps與fab反應的交叉反應率和檢出限進行評價，結果顯示(表7)，抗dpps的可溶性fab抗體與抗原的結合可被游離的hapten競爭性抑制，ic50為135.7ng/ml，具有很好的抗原結合活性。通過標準曲線可知線性檢測范圍分別在7.2～861.7ng/ml之間。與親本單克隆抗體(mab)的交叉反應率相比，其規(guī)律基本一致，所制備的fab的交叉反應率有整體提高，較mab而言，提高介于1.4～2.8倍，說明所制備的fab的廣譜特異性優(yōu)于親本mab。由于fab與mab相比具有諸多優(yōu)點，因此本研究為有機磷農藥多殘留檢測方法的建立提供了一種更廣譜、更靈敏的新型識別分子。表7為fab與親本mab的交叉反應率比較結果sequencelisting<110>華南農業(yè)大學<120>一種抗二乙氧基硫代磷酸酯類有機磷農藥的fab抗體及其制備方法與應用<130><160>4<170>patentinversion3.3<210>1<211>229<212>prt<213>重鏈的氨基酸序列<400>1leuglugluvallysvalglugluserglyglyglyleuvalglnpro151015glyglysermetlysleusercysvalalaserglyilethrpheser202530histyrtrpmetasntrpvalargglnserproglulysglyleuglu354045trpvalalagluileargleuargpheserasnhisvalthrglntyr505560alagluservallysglyargphethrmetserargaspaspserlys65707580serservaltyrleuglnmetasnasnleuargalagluaspthrgly859095iletyrtyrcysthrseriletyrtyraspasnleutyrtyralamet100105110asptyrtrpglyglnglythrservalthrvalserseralalysthr115120125thrproproservaltyrproleualaproglyseralaalaglnthr130135140asnsermetvalthrleuglycysleuvallysglytyrpheproglu145150155160provalthrvalthrtrpasnserglyserleuserserglyvalhis165170175thrpheproalavalleuglnseraspleutyrthrleuserserser180185190valthrvalproserserthrtrpprosergluthrvalthrcysasn195200205valalahisproalaserserthrlysvalasplyslysilevalpro210215220argaspcysthrser225<210>2<211>216<212>prt<213>輕鏈氨基酸序列<400>2gluleuaspileleumetthrglnserproalaserleuseralaser151015valglygluthrvalthrilethrcysargalasergluasnilehis202530asntyrleualatrptyrglnglnlysglnglylysserproglnleu354045leuvaltyrtyralalysthrleualaaspglyvalproserargphe505560serglyserglyserglythrglntyrserleulysileasnserleu65707580argprogluasppheglythrtyrtyrcysglnhisphetrpthrthr859095proargthrpheglyglyglythrlysleugluilelysargalaasp100105110alaalaprothrvalserilepheproprosersergluglnleuthr115120125serglyglyalaservalvalcyspheleuasnasnphetyrprolys130135140aspileasnvallystrplysileaspglysergluargglnasngly145150155160valleuasnsertrpthraspglnaspserlysaspserthrtyrser165170175metserserthrleuthrleuthrlysaspglutyrgluarghisasn180185190sertyrthrcysglualathrhislysthrserthrserproileval195200205lysserpheasnargasnglucys210215<210>3<211>690<212>dna<213>重鏈核苷酸序列<400>3ctcgaggaagtgaaagttgaggagtctggaggaggcttggtgcaacctggaggatccatg60aaactctcctgtgttgcctctggaatcactttcagtcactactggatgaattgggtccgc120cagtctccagagaaggggcttgagtgggttgctgaaattagattgagatttagtaatcat180gtaacacaatatgcggagtctgtgaaagggaggttcaccatgtcaagagacgattccaaa240agtagtgtctacctgcaaatgaacaacttaagagctgaagacactggcatttattactgt300accagcatctactatgataacctgtactacgctatggactactggggtcaaggaacctca360gtcaccgtctcctcggccaaaacgacacccccatctgtctatccactggcccctggatct420gctgcccaaactaactccatggtgaccctgggatgcctggtcaagggctatttccctgag480ccagtgacagtgacctggaactctggatccctgtccagcggtgtgcacaccttcccagct540gtcctgcagtctgacctctacactctgagcagctcagtgactgtcccctccagcacctgg600cccagcgagaccgtcacctgcaacgttgcccacccggccagcagcaccaaggtggacaag660aaaattgtgcccagggattgtactagttaa690<210>4<211>651<212>dna<213>輕鏈核苷酸序列<400>4gagctcgatattctgatgacccagtctccagcctccctatctgcatctgtgggagaaact60gtcaccatcacatgtcgagcaagtgaaaatattcacaattatttagcatggtatcagcag120aaacagggaaaatctcctcaactcctggtctattatgcaaaaaccttagcagatggtgtg180ccatcaaggttcagtggcagtggatcaggaacacaatattctctcaagatcaacagcctg240cggcctgaagattttgggacttattactgtcaacatttttggactactcctcggacgttc300ggtggaggcaccaagctggaaatcaaacgtgctgatgctgcaccaactgtatccatcttc360ccaccatccagtgagcagttaacatctggaggtgcctcagtcgtgtgcttcttgaacaac420ttctaccccaaagacatcaatgtcaagtggaagattgatggcagtgaacgacaaaatggc480gtcctgaacagttggactgatcaggacagcaaagacagcacctacagcatgagcagcacc540ctcacgttgaccaaggacgagtatgaacgacataacagctatacctgtgaggccactcac600aagacatcaacttcacccattgtcaagagcttcaacaggaatgagtgttaa651當前第1頁12