本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及蛋白質(zhì)ZmVps29在調(diào)控植物籽粒性狀和產(chǎn)量中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：玉米(ZeamaysL.)是世界上重要的糧食、飼料和工業(yè)原料三元作物。隨著世界人口的增加，對(duì)于糧食的需求與日俱增，進(jìn)而對(duì)一系列主要糧食作物的產(chǎn)量提出了更高的要求。在可耕地面積的持續(xù)減少的情況下，選育單產(chǎn)突出的玉米新品種是穩(wěn)定和提高玉米總產(chǎn)量最經(jīng)濟(jì)有效的途徑。玉米總產(chǎn)量受單位面積有效穗數(shù)、穗粒數(shù)和粒重三個(gè)因素的影響，三者關(guān)系的協(xié)調(diào)是取得玉米高產(chǎn)的關(guān)鍵。作為產(chǎn)量構(gòu)成因子之一的粒重相對(duì)最穩(wěn)定且受環(huán)境條件的影響相對(duì)較小，歷來(lái)被育種者所重視，因此提高玉米粒重是玉米高產(chǎn)育種的重要途徑之一。玉米籽粒性狀(如粒長(zhǎng)，粒寬)是決定粒重的重要因子。因此，尋找與玉米籽粒性狀相關(guān)的蛋白質(zhì)對(duì)培育玉米新品種具有重要的意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是如何使植物籽粒性狀更優(yōu)和如何提高植物產(chǎn)量。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明首先提供了蛋白質(zhì)ZmVps29在調(diào)控植物籽粒性狀和/或調(diào)控植物產(chǎn)量中的應(yīng)用；所述籽粒性狀可為d1)和/或d2)和/或d3)：d1)粒長(zhǎng)/粒寬；d2)粒長(zhǎng)；d3)粒寬。上述應(yīng)用中，所述蛋白質(zhì)ZmVps29可為a1)或a2)或a3)：a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)；a2)在序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)的N端或/和C端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)；a3)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的與植物籽粒性狀和/或植物產(chǎn)量相關(guān)的蛋白質(zhì)。其中，序列表中序列2由188個(gè)氨基酸殘基組成。為了使a1)中的蛋白質(zhì)便于純化，可在序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1標(biāo)簽的序列上述a3)中的蛋白質(zhì)，所述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過(guò)10個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。上述a3)中的蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述a3)中的蛋白質(zhì)的編碼基因可通過(guò)將序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變，和/或在其5′端和/或3′端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。編碼所述蛋白質(zhì)ZmVps29的核酸分子在調(diào)控植物籽粒性狀和/或調(diào)控植物產(chǎn)量中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍；所述籽粒性狀可為d1)和/或d2)和/或d3)：d1)粒長(zhǎng)/粒寬；d2)粒長(zhǎng)；d3)粒寬。上述應(yīng)用中，編碼所述蛋白質(zhì)ZmVps29的核酸分子可為如下b1)或b2)或b3)或b4)所示的DNA分子：b1)編碼區(qū)如序列表中序列1所示的DNA分子；b2)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；b3)與b1)或(b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼所述蛋白質(zhì)ZmVps29的DNA分子；b4)在嚴(yán)格條件下與(b1)或(b2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼所述蛋白質(zhì)ZmVps29的DNA分子。其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。其中，序列表中序列1由567個(gè)核苷酸組成，序列表中序列1的核苷酸編碼序列表中序列2所示的氨基酸序列。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易地采用已知的方法，例如定向進(jìn)化和點(diǎn)突變的方法，對(duì)本發(fā)明的編碼所述蛋白質(zhì)ZmVps29的核苷酸序列進(jìn)行突變。那些經(jīng)過(guò)人工修飾的，具有與本發(fā)明分離得到的所述蛋白質(zhì)ZmVps29的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要編碼所述蛋白質(zhì)ZmVps29，均是衍生于本發(fā)明的核苷酸序列并且等同于本發(fā)明的序列。這里使用的術(shù)語(yǔ)“同一性”指與天然核酸序列的序列相似性?！巴恍浴卑ㄅc本發(fā)明的編碼序列表的序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)ZmVps29的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行評(píng)價(jià)。使用計(jì)算機(jī)軟件，兩個(gè)或多個(gè)序列之間的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用來(lái)評(píng)價(jià)相關(guān)序列之間的同一性。上述應(yīng)用中，所述調(diào)控植物籽粒性狀可為植物籽粒性狀優(yōu)；所述籽粒性狀優(yōu)可體現(xiàn)為e1)和/或e2)和/或e3)：e1)粒長(zhǎng)/粒寬大；e2)粒長(zhǎng)長(zhǎng)；e3)粒寬小。上述應(yīng)用中，所述調(diào)控植物產(chǎn)量可為增加植物產(chǎn)量。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。本發(fā)明所提供的培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，可包括將編碼所述蛋白質(zhì)ZmVps29的核酸分子導(dǎo)入受體植物中，得到轉(zhuǎn)基因植物的步驟；與所述受體植物相比，所述轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)量增加和/或籽粒性狀改變。上述培育轉(zhuǎn)基因植物的方法中，所述籽粒性狀改變可為粒長(zhǎng)/粒寬增加。上述培育轉(zhuǎn)基因植物的方法中，所述籽粒性狀改變可為粒長(zhǎng)增加。上述培育轉(zhuǎn)基因植物的方法中，所述籽粒性狀改變可為粒寬減少。上述方法中，編碼所述蛋白質(zhì)ZmVps29的核酸分子可為如下b1)或b2)或b3)或b4)所示的DNA分子：b1)編碼區(qū)如序列表中序列1所示的DNA分子；b2)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；b3)與b1)或(b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼所述蛋白質(zhì)ZmVps29的DNA分子；b4)在嚴(yán)格條件下與(b1)或(b2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼所述蛋白質(zhì)ZmVps29的DNA分子。其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。其中，序列表中序列1由567個(gè)核苷酸組成，序列表中序列1的核苷酸編碼序列表中序列2所示的氨基酸序列。上述方法中，所述“將編碼所述蛋白質(zhì)ZmVps29的核酸分子導(dǎo)入受體植物中”可通過(guò)向受體植物中導(dǎo)入重組載體實(shí)現(xiàn)；所述重組載體可為向表達(dá)載體插入編碼所述蛋白質(zhì)ZmVps29的核酸分子得到的重組質(zhì)粒。所述重組載體具體可為重組質(zhì)粒pCAMBIA3301-ZmVps29。所述重組質(zhì)粒pCAMBIA3301-ZmVps29具體可為向載體pCAMBIA3301的限制性?xún)?nèi)切酶BglⅡ和PmlI酶切位點(diǎn)之間插入核苷酸序列是序列表中的序列1所示的DNA分子得到的重組質(zhì)粒。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了植物育種方法。本發(fā)明所提供的植物育種方法，可包括如下步驟：增加植物中所述蛋白質(zhì)ZmVps29的含量或活性，從而產(chǎn)量增加和/或籽粒性狀改變。上述植物育種方法中，所述籽粒性狀改變可為粒長(zhǎng)/粒寬增加。上述植物育種方法中，所述籽粒性狀改變可為粒長(zhǎng)增加。上述植物育種方法中，所述籽粒性狀改變可為粒寬減少。上述任一所述粒長(zhǎng)/粒寬即粒長(zhǎng)與粒寬的比值。上述任一所述粒長(zhǎng)/粒寬可為10粒長(zhǎng)/10粒寬。上述任一所述產(chǎn)量可為籽粒產(chǎn)量。所述籽粒產(chǎn)量可為單穗產(chǎn)量。上述任一所述植物可為如下c1)至c10)中的任一種：c1)雙子葉植物；c2)單子葉植物；c3)禾本科植物；c4)十字花科植物；c5)擬南芥；c6)野生型擬南芥；c7)玉米自交系黃早四；c8)玉米自交系旅28；c9)玉米自交系鄭58；c10)玉米品種Hi-Ⅱ。本發(fā)明還保護(hù)如序列表的序列3所示的分子標(biāo)記甲或如序列表的序列4所示的分子標(biāo)記乙。本發(fā)明還保護(hù)一種鑒別或輔助鑒別玉米籽粒性狀的方法，該方法可包括如下步驟：檢測(cè)待測(cè)玉米的基因組DNA中基于ZmVps29基因的啟動(dòng)子的基因型為P1純合型還是P2純合型；P1純合型玉米的籽粒性狀優(yōu)于P2純合型；所述籽粒性狀優(yōu)體現(xiàn)為e1)和/或e2)和/或e3)：e1)粒長(zhǎng)/粒寬大；e2)粒長(zhǎng)長(zhǎng)；e3)粒寬?。籔1純合型指的是基因組DNA具有序列表中序列4所示的DNA分子且為純合型；P2純合型指的是基因組DNA具有序列表中序列3所示的DNA分子且為純合型。本發(fā)明還保護(hù)一種鑒別或輔助鑒別玉米產(chǎn)量的方法，該方法可包括如下步驟：檢測(cè)待測(cè)玉米的基因組DNA中基于ZmVps29基因的啟動(dòng)子的基因型為P1純合型還是P2純合型；P1純合型玉米的產(chǎn)量高于P2純合型；P1純合型指的是基因組DNA具有序列表中序列4所示的DNA分子且為純合型；P2純合型指的是基因組DNA具有序列表中序列3所示的DNA分子且為純合型。上述方法中，所述產(chǎn)量可為籽粒產(chǎn)量。所述籽粒產(chǎn)量可為單穗產(chǎn)量。實(shí)驗(yàn)證明，在野生型擬南芥中過(guò)表達(dá)ZmVPS29基因，得到轉(zhuǎn)ZmVps29基因擬南芥；與野生型擬南芥相比，轉(zhuǎn)ZmVps29基因擬南芥的粒長(zhǎng)增加和粒長(zhǎng)/粒寬增加。實(shí)驗(yàn)還證明，在黃早四或鄭58中過(guò)表達(dá)ZmVPS29基因，可以顯著的減少10粒寬、增加10粒長(zhǎng)/10粒寬和增加單穗產(chǎn)量，籽粒變?yōu)榧?xì)長(zhǎng)籽粒。因此，蛋白質(zhì)ZmVps29在培育籽粒性狀優(yōu)良和/或植物產(chǎn)量高的植物中具有重要的理論意義和實(shí)用價(jià)值。附圖說(shuō)明圖1為實(shí)施例3步驟一的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖2為實(shí)施例3步驟二的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖3為實(shí)施例4的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖4為實(shí)施例5步驟二的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖5為實(shí)施例5步驟三的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖6為實(shí)施例5步驟四的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖7為實(shí)施例5步驟五的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖8為實(shí)施例6步驟二的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖9為實(shí)施例6步驟三中1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖10為實(shí)施例6步驟四的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖11為實(shí)施例6步驟四的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖12為實(shí)施例6步驟五中1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖13為實(shí)施例6步驟五中1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖14為實(shí)施例6步驟五中2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖15為實(shí)施例6步驟五中2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。玉米自交系黃早四、玉米自交系旅28、玉米自交系鄭58、玉米品種Hi-Ⅱ和玉米自交系B73均來(lái)源于國(guó)家種質(zhì)資源庫(kù)(網(wǎng)址為：http://www.cgris.net/)。公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所(即申請(qǐng)人處)獲得，以重復(fù)本實(shí)驗(yàn)。在下文中，玉米自交系黃早四簡(jiǎn)稱(chēng)黃早四或HZS或HZ4，玉米自交系旅28簡(jiǎn)稱(chēng)旅28或LV28，玉米自交系鄭58簡(jiǎn)稱(chēng)鄭58或Z58，玉米品種Hi-Ⅱ簡(jiǎn)稱(chēng)Hi-Ⅱ，玉米自交系B73簡(jiǎn)稱(chēng)B73。TRIzol試劑和M-MLV均為Invitrogen公司的產(chǎn)品。pLB零背景快速克隆試劑盒為天根生化科技(北京)有限公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為VT205-01?？寺≥d體pLBVector為pLB零背景快速克隆試劑盒中的組件。SYBRPremixExTaqTM試劑盒為北京六合通經(jīng)貿(mào)有限公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為RR420A。2×SYBRPremixExTaq和50×ROXReferenceDyeII均為SYBRPremixExTaqII試劑盒中的組件。載體pGreen-GFP和載體pCAMBIA3301均記載于如下文獻(xiàn)中：LuM，YingS，ZhangDF，etal.Amaizestress-responsiveNACtranscriptionfactor，ZmSNAC1，confersenhancedtolerancetodehydrationintransgenicArabidopsis[J].PlantCellReports，2012，31(9):1701-1711.，公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所(即申請(qǐng)人處)獲得，以重復(fù)本實(shí)驗(yàn)。酶解液：先將Cellase0.3g、離析酶0.08g、甘露醇1.456g、KCl0.03g和MES0.078g溶于20mL超純水，調(diào)節(jié)pH值至5.7；然后55℃水浴10min；最后冷卻至室溫后，加入CaCl20.0294g、BSA0.02g和β-巰基乙醇5μL。W5溶液：將NaCl9.0g、CaCl213.875g、2.5mL濃度為2MKCl水溶液和4mLpH5.7、0.5MMES緩沖液溶于適量超純水，然后用超純水定容至1L。MMg溶液：將1.5mL濃度為1M的MgCl2水溶液、0.8mLpH5.7、0.5MMES緩沖液和7.3g甘露醇溶于適量超純水，然后用超純水定容至100mL。40％PEG溶液：將PEG400040g、甘露醇3.64g、10mL濃度為1M的CaCl2水溶液溶于適量超純水，然后用超純水定容至100mL。實(shí)施例1、ZmVps29基因的克隆黃早四和旅28具有不同的籽粒性狀：黃早四粒長(zhǎng)較短，粒寬較大，表現(xiàn)為圓形籽粒；旅28粒長(zhǎng)較長(zhǎng)，粒寬較小，表現(xiàn)為細(xì)長(zhǎng)籽粒；黃早四的粒長(zhǎng)/粒寬遠(yuǎn)小于旅28的粒長(zhǎng)/粒寬，二者的籽粒性狀存在顯著差異。本申請(qǐng)的發(fā)明人根據(jù)前期玉米籽粒性狀主效QTL的挖掘與圖位克隆等實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測(cè)玉米基因組中ZmVps29基因與玉米籽粒性狀相關(guān)?？寺mVps29基因的步驟如下：1、采用TRIzol試劑提取黃早四的幼嫩葉片組織的總RNA，將該總RNA用M-MLV反轉(zhuǎn)錄出第一鏈cDNA，得到葉片組織的cDNA。2、以步驟1得到的葉片組織的cDNA為模板，以F1：5’-ACTCggATCATggTgTgCAg-3’和R1：5’-CgCATgAACAggTAgAAAgCg-3’為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約721bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。3、按照pLB零背景快速克隆試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟，將步驟2得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和克隆載體pLBVector連接，得到重組質(zhì)粒pLB-ZmVps29-HZS。對(duì)重組質(zhì)粒pLB-ZmVps29-HZS進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，重組質(zhì)粒pLB-ZmVps29-HZS中含有序列表中序列1所示的DNA分子(以下命名為ZmVps29基因)，表達(dá)序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)(以下命名為ZmVps29蛋白或蛋白質(zhì)ZmVps29)。按照上述方法，將步驟1中的黃早四的幼嫩葉片組織替換為旅28的幼嫩葉片組織，其它步驟均不變，得到重組質(zhì)粒pLB-ZmVps29-LV28。對(duì)重組質(zhì)粒pLB-ZmVps29-LV28進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，重組質(zhì)粒pLB-ZmVps29-LV28中也含有序列表中序列1所示的ZmVps29基因，表達(dá)序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)ZmVps29。上述結(jié)果表明，黃早四和旅28的基因組DNA中，均含有ZmVps29基因。實(shí)施例2、ZmVps29基因的啟動(dòng)子的克隆1、采用CTAB法提取處于三葉一心時(shí)期黃早四幼苗的葉片組織的基因組DNA，得到葉片組織的基因組DNA。2、以步驟1得到的葉片組織的基因組DNA為模板，以F2：5’-CTCACCCCCACAAGTCAAGA-3’和R2：5’-CCGACCGAACCAAACAAACA-3’為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約2351bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。3、按照pLB零背景快速克隆試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟，將步驟2得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和克隆載體pLBVector連接，得到重組質(zhì)粒丙。對(duì)重組質(zhì)粒丙進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果表明，重組質(zhì)粒丙中含有序列表中序列3所示的DNA分子。按照上述方法，將步驟1中處于三葉一心時(shí)期的黃早四幼苗的葉片組織替換為處于三葉一心時(shí)期旅28幼苗的葉片組織，其它步驟均不變，得到重組質(zhì)粒丁。對(duì)重組質(zhì)粒丁進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果表明，重組質(zhì)粒丁中含有序列表中序列4所示的DNA分子。將序列表中序列3所示的DNA分子和序列表中序列4所示的DNA分子進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明，黃早四和旅28的基因組DNA中ZmVps29基因的啟動(dòng)子的核苷酸序列不同。推測(cè)ZmVps29基因的啟動(dòng)子的核苷酸序列不同造成蛋白質(zhì)ZmVps29的表達(dá)量不同，進(jìn)而形成不同的籽粒性狀。實(shí)施例3、表達(dá)模式分析一、不同組織的表達(dá)模式1、采用TRIzol試劑提取黃早四材料(黃早四處于三葉一心時(shí)期的根、黃早四處于三葉一心時(shí)期的莖、黃早四處于三葉一心時(shí)期的葉片、黃早四的雌穗、黃早四的雄穗、黃早四的穗位葉、黃早四的花絲或黃早四的籽粒)的總RNA，將該總RNA用M-MLV反轉(zhuǎn)錄出第一鏈cDNA，得到黃早四材料的cDNA。黃早四材料的cDNA中，DNA濃度為500ng/μL。2、以步驟1得到的黃早四材料的cDNA為模板，采用RT-PCR檢測(cè)ZmVps29基因的表達(dá)量(以GAPDH基因作為內(nèi)參基因)。檢測(cè)ZmVps29基因的引物為正向引物1：5’-CTTTGCCCTGATCTCCATATTACC-3’和反向引物1：5’-CACGCCTCCCTCGTGCTTAT-3’。檢測(cè)GAPDH基因的引物為正向引物2：5’-CCCTTCATCACCACGGACTAC-3’和反向引物2：5’-TCCCACCACGGTTCTTCCAA-3’。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1(M為DNAmarker，1為黃早四處于三葉一心時(shí)期的根，2為黃早四處于三葉一心時(shí)期的莖，3為黃早四處于三葉一心時(shí)期的葉片，4為黃早四的雌穗，5為黃早四的雄穗，6為黃早四的穗位葉，7為黃早四的花絲，8為黃早四的籽粒)。結(jié)果表明，黃早四的基因組DNA中ZmVps29基因?yàn)榻M成型表達(dá)基因，在上述黃早四各個(gè)組織中均表達(dá)。按照上述方法，將黃早四替換為旅28，其它步驟均不變。結(jié)果表明，旅28的基因組DNA中ZmVps29基因?yàn)榻M成型表達(dá)基因，在旅28各個(gè)組織中均表達(dá)。二、不同時(shí)期的玉米籽粒組織的表達(dá)模式1、采用TRIzol試劑提取籽粒(黃早四自交授粉第6天的籽粒、黃早四自交授粉第12天的籽粒、黃早四自交授粉第18天的籽粒、黃早四自交授粉第24天的籽粒、旅28自交授粉第6天的籽粒、旅28自交授粉第12天的籽粒、旅28自交授粉第18天的籽?；蚵?8自交授粉第24天的籽粒)的總RNA，將該總RNA用M-MLV反轉(zhuǎn)錄出第一鏈cDNA，得到籽粒的cDNA。籽粒的cDNA中，DNA濃度為500ng/μL。2、以步驟1得到的籽粒的cDNA為模板，使用SYBRPremixExTaqTM試劑盒檢測(cè)ZmVps29基因的相對(duì)表達(dá)量(以GAPDH基因作為內(nèi)參基因)。檢測(cè)ZmVps29基因的引物為正向引物1：5’-CTTTGCCCTGATCTCCATATTACC-3’和反向引物1：5’-CACGCCTCCCTCGTGCTTAT-3’。檢測(cè)GAPDH基因的引物為正向引物2：5’-CCCTTCATCACCACGGACTAC-3’和反向引物2：5’-TCCCACCACGGTTCTTCCAA-3’。反應(yīng)體系為20μL，由10μL2×SYBRPremixExTaq、0.4μL濃度為10μM的正向引物、0.4μL濃度為10μM的反向引物、0.4μL50×ROXReferenceDyeII、0.8μL黃早四籽粒的cDNA和8.0μL無(wú)核酸酶水組成。熒光定量PCR檢測(cè)的反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性1min；95℃變性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸31sec，40個(gè)循環(huán)；在95℃變性15sec，60℃退火30sec，72℃延伸15sec時(shí)收集溶解曲線，通過(guò)采用2-ΔΔCt法(LivakandSchmittgen，2001)分析籽粒的cDNA中ZmVps29基因的相對(duì)表達(dá)量。以黃早四自交授粉第6天的籽粒的ZmVps29基因的相對(duì)表達(dá)量作為1，其它籽粒的ZmVps29基因的相對(duì)表達(dá)量見(jiàn)圖2(注：NS表示差異不顯著，**表示差異極顯著)。結(jié)果表明，旅28自交授粉第6天的籽粒的ZmVps29基因的相對(duì)表達(dá)量顯著高于黃早四自交授粉第6天的籽粒，旅28自交授粉第12天的籽粒的ZmVps29基因的相對(duì)表達(dá)量顯著高于黃早四自交授粉第12天的籽粒，旅28自交授粉第18天的籽粒的ZmVps29基因的相對(duì)表達(dá)量顯著高于黃早四自交授粉第18天的籽粒?？梢?jiàn)，與黃早四相比，旅28表達(dá)的蛋白質(zhì)ZmVps29較多。因此，蛋白質(zhì)ZmVps29的表達(dá)量越高，則粒長(zhǎng)越長(zhǎng)，粒寬越小，粒長(zhǎng)/粒寬越大。實(shí)施例4、亞細(xì)胞定位分析一、重組質(zhì)粒ZmVps29-pGreen-GFP的構(gòu)建1、以實(shí)施例1步驟3得到的重組質(zhì)粒pLB-ZmVps29-HZS為模板，以F3：5’-TTTTCTAGACATGGTGCTTGTGCT-3’(下劃線為限制性?xún)?nèi)切酶XbaI的識(shí)別位點(diǎn))和R3：5’-TTTGATATCGCCGTGCATCGTC-3’(下劃線為限制性?xún)?nèi)切酶EcoRⅤ的識(shí)別位點(diǎn))為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約590bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。2、按照pLB零背景快速克隆試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟，將步驟2得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和克隆載體pLBVector連接，得到重組質(zhì)粒pLB-ZmVps29。3、用限制性?xún)?nèi)切酶XbaI和EcoRⅤ雙酶切重組質(zhì)粒pLB-ZmVps29，回收約590bp的片段甲。4、用限制性?xún)?nèi)切酶XbaI和EcoRⅤ雙酶切載體pGreen-GFP，回收約5300bp的載體骨架甲。6、將片段甲和載體骨架甲連接，得到重組質(zhì)粒ZmVps29-pGreen-GFP。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒ZmVps29-pGreen-GFP進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：向載體pGreen-GFP的限制性?xún)?nèi)切酶XbaI和EcoRⅤ酶切位點(diǎn)之間插入核苷酸序列是序列表中的序列1自5’末端起第1位至第564位所示的DNA分子。二、亞細(xì)胞定位分析1、制備玉米原生質(zhì)體(1)取B73的種子，置于培養(yǎng)箱，25℃黑暗培養(yǎng)7-10天，得到玉米幼苗。(2)先切下步驟(1)得到的玉米幼苗第二片葉子的中間部分，然后切割成0.5mm×0.5mm小塊，將這些小塊命名為玉米組織。(3)將步驟(2)得到的玉米組織置于錐形瓶，加入20mL酶解液；然后用錫箔紙包裹錐形瓶，抽真空30min(15個(gè)大氣壓)；最后置于搖床上，先25℃、40rpm振蕩培養(yǎng)3-4h，再25℃、80rpm振蕩培養(yǎng)5min，得到消化液。(4)取步驟(3)得到的消化液，用尼龍網(wǎng)過(guò)濾，得到濾液。(5)取步驟(4)得到的濾液，1000rpm離心2min(離心機(jī)設(shè)置為緩慢升降速模式)，棄上清，將沉淀用W5溶液洗滌1-2次，即為制備的玉米原生質(zhì)體。2、轉(zhuǎn)化(1)取步驟1中(5)制備的玉米原生質(zhì)體，加入適量的W5溶液，然后置于冰上放置30min；離心棄上清，向沉淀中加入適量MMg溶液進(jìn)行重懸，得到原生質(zhì)體濃度為5×105個(gè)/mL的原生質(zhì)體溶液。(2)將190μL原生質(zhì)體溶液、10μL的重組質(zhì)粒ZmVps29-pGreen-GFP(約15-20μg重組質(zhì)粒ZmVps29-pGreen-GFP)和200μL濃度為40％PEG溶液輕輕混勻，25℃靜置18min；然后加入1.6mLW5溶液，輕輕混勻，1000rpm離心1min，棄上清，將沉淀用W5溶液洗滌1-2次。(3)完成步驟(2)后，取所述原生質(zhì)體，加入1.6mLW5溶液，置于細(xì)胞培養(yǎng)板中暗培養(yǎng)12-24h；然后置于載玻片上，在激光共聚焦顯微鏡下觀察按照上述方法，將重組質(zhì)粒ZmVps29-pGreen-GFP替換為載體pGreen-GFP，其它步驟均不變，在共聚焦顯微鏡下觀察，作為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3(A為載體pGreen-GFP，其中左上為紅光下視野，左下為紅光和綠光疊加下視野，右上為綠光下視野，右下為白光下視野；B為重組質(zhì)粒ZmVps29-pGreen-GFP，其中左上為紅光下視野，左下為紅光和綠光疊加下視野，右上為綠光下視野，右下為白光下視野)：載體pGreen-GFP轉(zhuǎn)化玉米原生質(zhì)體后，在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上均可觀察到綠色熒光；重組質(zhì)粒ZmVps29-pGreen-GFP轉(zhuǎn)化玉米原生質(zhì)體后，僅在細(xì)胞膜上觀察到綠色熒光。因此，蛋白質(zhì)ZmVps29定位在細(xì)胞膜。實(shí)施例5、轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得及鑒定一、重組質(zhì)粒pCAMBIA3301-ZmVps29、GV3101/pCAMBIA3301-ZmVps29和GV3101/pCAMBIA3301的獲得1、重組質(zhì)粒pCAMBIA3301-ZmVps29的獲得(1)以實(shí)施例1步驟3得到的重組質(zhì)粒pLB-ZmVps29-HZS為模板，以F4：5’-ccccAGATCTAATGGTGCTTGTGCTTGCGCT-3’(下劃線為限制性?xún)?nèi)切酶BglⅡ的識(shí)別位點(diǎn))和R4：5’-ttttCACGTGCTAGCCGTGCATCGTCGCAG-3’(下劃線為限制性?xún)?nèi)切酶PmlI的識(shí)別位點(diǎn))為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約590bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。(2)按照pLB零背景快速克隆試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟，將步驟(1)得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和克隆載體pLBVector連接，得到中間質(zhì)粒。(3)用限制性?xún)?nèi)切酶BglⅡ和PmlI雙酶切中間質(zhì)粒，回收約590bp的片段乙。(4)用限制性?xún)?nèi)切酶BglⅡ和PmlI雙酶切載體pCAMBIA3301，回收約9000bp的載體骨架乙。(5)將片段乙和載體骨架乙連接，得到重組質(zhì)粒pCAMBIA3301-ZmVps29。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒pCAMBIA3301-ZmVps29進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：向載體pCAMBIA3301的限制性?xún)?nèi)切酶BglⅡ和PmlI酶切位點(diǎn)之間插入核苷酸序列是序列表中的序列1所示的DNA分子。2、GV3101/pCAMBIA3301-ZmVps29的獲得將重組質(zhì)粒pCAMBIA3301-ZmVps29導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌GV3101，得到重組農(nóng)桿菌，命名為GV3101/pCAMBIA3301-ZmVps29。3、GV3101/pCAMBIA3301的獲得將載體pCAMBIA3301導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌GV3101，得到重組農(nóng)桿菌，命名為GV3101/pCAMBIA3301。二、轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得哥倫比亞生態(tài)型擬南芥為ArabidopsisBiologicalResourceCenter的產(chǎn)品，詳見(jiàn)網(wǎng)址http://abrc.osu.edu/。在下文中，哥倫比亞生態(tài)型擬南芥簡(jiǎn)稱(chēng)為野生型擬南芥或WT。1、采用擬南芥花序浸花轉(zhuǎn)化法(Clough，S.J.，andBent，A.F..Floraldip:asimplifiedmethodforAgrobacterium-mediatedtransformationofArabidopsisthaliana.PlantJ.(1998)16，735-743.)，將步驟一中2制備的GV3101/pCAMBIA3301-ZmVps29轉(zhuǎn)至野生型擬南芥中，獲得T1代轉(zhuǎn)ZmVps29基因擬南芥的種子。2、將T1代轉(zhuǎn)ZmVps29基因擬南芥的種子種植于營(yíng)養(yǎng)土中，25℃培養(yǎng)4周，然后噴施Basta篩選，能夠正常生長(zhǎng)的擬南芥(抗性苗)即為T(mén)1代轉(zhuǎn)ZmVps29基因陽(yáng)性苗。T1代轉(zhuǎn)ZmVps29基因陽(yáng)性苗收到的種子即為T(mén)2代轉(zhuǎn)ZmVps29基因擬南芥的種子。3、將步驟2篩選出的不同株系的T2代轉(zhuǎn)ZmVps29基因擬南芥的種子播種于含7mg/L草銨膦(phosphinothricin，PPT)的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，如果某株系中能夠正常生長(zhǎng)的擬南芥(抗性苗)的數(shù)目與不能夠正常生長(zhǎng)的擬南芥(非抗性苗)的數(shù)目比例為3：1，則該株系為ZmVps29基因插入一個(gè)拷貝的株系，該株系中的抗性苗收到的種子即為T(mén)3代轉(zhuǎn)ZmVps29基因擬南芥的種子。4、將步驟3篩選出的T3代轉(zhuǎn)ZmVps29基因擬南芥的種子再次播種于含7mg/LPPT的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，均為抗性苗的即為T(mén)3代純合轉(zhuǎn)ZmVps29基因擬南芥。將其中13個(gè)T3代純合轉(zhuǎn)ZmVps29基因擬南芥的株系依次命名為OE12-1至OE12-13，并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。T1代轉(zhuǎn)ZmVps29基因擬南芥的Basta篩選具體見(jiàn)圖4(A和B均為噴施Basta前，C為噴施Basta后)。按照上述方法，將GV3101/pCAMBIA3301-ZmVps29替換為GV3101/pCAMBIA3301，其它步驟均相同，得到T3代純合轉(zhuǎn)空載體擬南芥的植株，簡(jiǎn)稱(chēng)轉(zhuǎn)空載體擬南芥。三、分子鑒定1、分別取OE12-1至OE12-13的T3代種子，種植于營(yíng)養(yǎng)土中，25℃培養(yǎng)4周，得到OE12-1至OE12-13的幼苗。2、分別提取OE12-1至OE12-13的幼苗的葉片的基因組DNA并以其作為模板，采用F4：5’-ccccAGATCTAATGGTGCTTGTGCTTGCGCT-3’和R4：5’-ttttCACGTGCTAGCCGTGCATCGTCGCAG-3’組成的引物對(duì)1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后進(jìn)行電泳。3、分別提取OE12-1至OE12-13幼苗的葉片的基因組DNA并以其作為模板，采用F6：5’-GAAGTCCAGCTGCCAGAAAC-3’和R6：5’-GTCTGCACCATCGTCAACC-3’組成的引物對(duì)2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后進(jìn)行電泳。按照上述方法，將OE12-1的幼苗的葉片的基因組DNA替換為水，其它步驟均相同，作為陰性對(duì)照。按照上述方法，將OE12-1的幼苗的葉片的基因組DNA替換為轉(zhuǎn)空載體擬南芥的幼苗的葉片的基因組DNA，其它步驟均相同，作為對(duì)照。按照上述方法，將OE12-1的幼苗的葉片的基因組DNA替換為重組質(zhì)粒pCAMBIA3301-ZmVps29，其它步驟均相同，作為陽(yáng)性對(duì)照。部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5(A為采用引物對(duì)1的PCR擴(kuò)增結(jié)果，B為采用引物對(duì)2的PCR擴(kuò)增結(jié)果；其中M為DNAMarker，泳道1-10為OE12-1至OE12-10)。結(jié)果表明，以O(shè)E12-1至OE12-13的幼苗的葉片的基因組DNA或重組質(zhì)粒pCAMBIA3301-ZmVps29為模板，采用引物對(duì)1均能擴(kuò)增得到587bp的條帶，采用引物對(duì)2均能擴(kuò)增得到444bp的條帶；以水或轉(zhuǎn)空載體擬南芥的幼苗的葉片的基因組DNA為模板，采用引物對(duì)1均不能擴(kuò)增得到587bp的條帶，采用引物對(duì)2均不能擴(kuò)增得到444bp的條帶。經(jīng)過(guò)分子鑒定，OE12-1至OE12-13均為轉(zhuǎn)ZmVps29基因擬南芥。四、檢測(cè)轉(zhuǎn)ZmVps29基因擬南芥的cDNA中ZmVps29基因的相對(duì)表達(dá)量1、采用TRIzol試劑提取擬南芥幼苗(野生型擬南芥幼苗、轉(zhuǎn)空載體擬南芥幼苗、OE12-1的幼苗、OE12-2的幼苗、OE12-3的幼苗、OE12-4的幼苗、OE12-6的幼苗、OE12-7的幼苗、OE12-8的幼苗、OE12-9的幼苗、OE12-11的幼苗或OE12-13的幼苗)的總RNA，將該總RNA用M-MLV反轉(zhuǎn)錄出第一鏈cDNA，得到擬南芥幼苗的cDNA。擬南芥幼苗的cDNA中，DNA濃度為500ng/μL。2、以步驟1得到的擬南芥幼苗的cDNA為模板，使用SYBRPremixExTaqTM試劑盒檢測(cè)擬南芥幼苗的ZmVps29基因的相對(duì)表達(dá)量(以Actin基因作為內(nèi)參基因)。檢測(cè)ZmVps29基因的引物為F4：5’-CTTTGCCCTGATCTCCATATTACC-3’和R4：5’-CACGCCTCCCTCGTGCTTAT-3’。檢測(cè)Actin基因的引物為正向引物6：5’-AGGTATCGCTGACCGTATGAG-3’和反向引物6：5’-GCTGAGGGAAGCAAGAATG-3’。反應(yīng)體系為20μL，由10μL2×SYBRPremixExTaq、0.4μL濃度為10μM的正向引物、0.4μL濃度為10μM的反向引物、0.4μL50×ROXReferenceDyeII、0.8μL擬南芥幼苗的cDNA和8.0μL無(wú)核酸酶水組成。熒光定量PCR檢測(cè)的反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性1min；95℃變性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸31sec，40個(gè)循環(huán)；在95℃變性15sec，60℃退火30sec，72℃延伸15sec時(shí)收集溶解曲線，通過(guò)采用2-ΔΔCt法(LivakandSchmittgen，2001)分析擬南芥幼苗的cDNA中ZmVps29基因的相對(duì)表達(dá)量。各個(gè)擬南芥幼苗的cDNA中ZmVps29基因的相對(duì)表達(dá)量見(jiàn)圖6(WT為野生型擬南芥幼苗)。結(jié)果表明，OE12-1的幼苗、OE12-2的幼苗、OE12-3的幼苗、OE12-4的幼苗、OE12-6的幼苗、OE12-7的幼苗、OE12-8的幼苗、OE12-9的幼苗、OE12-11的幼苗和OE12-13的幼苗的cDNA中ZmVps29基因均有一定程度的表達(dá)，野生型擬南芥幼苗和轉(zhuǎn)空載體擬南芥幼苗的cDNA中均沒(méi)有ZmVps29基因的表達(dá)。五、轉(zhuǎn)ZmVps29基因擬南芥的籽粒性狀的鑒定實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次取平均值，每次重復(fù)的步驟如下：分別將野生型擬南芥種子、轉(zhuǎn)空載體擬南芥種子、OE12-1的T3代種子、OE12-2的T3代種子、OE12-3的T3代種子、OE12-4的T3代種子、OE12-6的T3代種子、OE12-7的T3代種子、OE12-8的T3代種子、OE12-9的T3代種子、OE12-11的T3代種子和OE12-13的T3代種子種植于營(yíng)養(yǎng)土中，25℃培養(yǎng)至成熟，收獲種子。將收獲的種子置于40倍體視鏡下拍照，利用ImageJ軟件測(cè)量種子的粒長(zhǎng)和粒寬，并計(jì)算粒長(zhǎng)/粒寬。部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖7(WT為野生型擬南芥)和表2：轉(zhuǎn)ZmVps29基因擬南芥的種子為細(xì)長(zhǎng)籽粒，均表現(xiàn)為粒長(zhǎng)增加、粒長(zhǎng)/粒寬增加，大部分籽粒的粒寬增加；野生型擬南芥種子和轉(zhuǎn)空載體擬南芥種子的粒長(zhǎng)、粒寬和粒長(zhǎng)/粒寬無(wú)顯著差異；與野生型擬南芥種子相比，OE12-8的T3代種子、OE12-6的T3代種子、OE12-9的T3代種子和OE12-11的T3代種子的粒長(zhǎng)和粒寬均有顯著差異、粒長(zhǎng)/粒寬無(wú)顯著差異，E12-1的T3代種子、OE12-2的T3代種子和OE12-7的T3代種子的粒長(zhǎng)、粒寬和粒長(zhǎng)/粒寬均有顯著差異，OE12-3的T3代種子、OE12-4的T3代種子和OE12-13的T3代種子的粒長(zhǎng)和粒長(zhǎng)/粒寬均有顯著差異。表2擬南芥粒長(zhǎng)/粒寬P值粒長(zhǎng)P值粒寬P值WT1.732無(wú)93.885無(wú)54.412無(wú)OE12-81.733NS108.940**63.071**OE12-61.746NS107.880**61.925**OE12-91.778NS111.630**63.078**OE12-111.783NS101.470**57.178**OE12-21.784*104.110**58.596**OE12-11.798*105.020**58.639**OE12-71.804**105.490**58.691**OE12-41.843**101.960**55.560NSOE12-131.875**103.940**55.729NSOE12-31.913**101.680**53.434NS注：NS表示P＞0.05，即差異不顯著；*表示0.01＜P≤0.05，即差異顯著；**表示P≤0.01，差異極顯著。上述結(jié)果表明，蛋白質(zhì)ZmVps29可調(diào)控?cái)M南芥籽粒的性狀。實(shí)施例6、轉(zhuǎn)基因玉米的獲得及鑒定一、重組質(zhì)粒pCAMBIA3301-ZmVps29和EHA105/pCAMBIA3301-ZmVps29的獲得1、重組質(zhì)粒pCAMBIA3301-ZmVps29的獲得同實(shí)施例4步驟一中1。2、EHA105/pCAMBIA3301-ZmVps29的獲得將重組質(zhì)粒pCAMBIA3301-ZmVps29導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌EHA105，得到重組農(nóng)桿菌，命名為EHA105/pCAMBIA3301-ZmVps29。二、T0代轉(zhuǎn)ZmVps29基因玉米的獲得采用農(nóng)桿菌侵染玉米幼胚的轉(zhuǎn)化方法，將步驟一中2制備的EHA105/pCAMBIA3301-ZmVps29轉(zhuǎn)至Hi-Ⅱ中，獲得T0代擬轉(zhuǎn)ZmVps29基因玉米。在T0代擬轉(zhuǎn)ZmVps29基因玉米的葉片上涂抹Basta，葉片能夠正常生長(zhǎng)的植株(抗性苗)即為T(mén)0代轉(zhuǎn)ZmVps29基因玉米。T0代擬轉(zhuǎn)ZmVps29基因玉米的Basta篩選具體見(jiàn)圖8(左圖為玉米葉片能夠正常生長(zhǎng)，右圖為玉米葉片不能夠正常生長(zhǎng))。將得到三個(gè)T0代轉(zhuǎn)ZmVps29基因玉米分別命名為ZmVPS12-1、ZmVPS12-2和ZmVPS12-3。三、T1代轉(zhuǎn)ZmVps29基因玉米的獲得1、T1代轉(zhuǎn)ZmVps29基因的黃早四*ZmVPS12-1的獲得(1)采集ZmVPS12-1的花粉，與黃早四進(jìn)行雜交，得到T1代擬轉(zhuǎn)ZmVps29基因的黃早四*ZmVPS12-1。(2)分別提取T1代擬轉(zhuǎn)ZmVps29基因的黃早四*ZmVPS12-1的葉片的基因組DNA并以其作為模板，以F7：5’-CCTTCGCAAGACCCTTCCTC-3’和R7：5’-TCGCCGTCAATCAGCTCGTA-3’為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，然后進(jìn)行如下判斷：如果能夠獲得584bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，則相應(yīng)的T1代擬轉(zhuǎn)ZmVps29基因的黃早四*ZmVPS12-1為T(mén)1代轉(zhuǎn)ZmVps29基因的黃早四*ZmVPS12-1；如果不能獲得584bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，則相應(yīng)的T1代擬轉(zhuǎn)ZmVps29基因的黃早四*ZmVPS12-1為T(mén)1代未轉(zhuǎn)ZmVps29基因的黃早四*ZmVPS12-1。部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖9(M為DNAMarker，泳道1-75為75個(gè)T1代擬轉(zhuǎn)ZmVps29基因的黃早四*ZmVPS12-1。采用上述方法可以得到T1代轉(zhuǎn)ZmVps29基因的黃早四*ZmVPS12-1和T1代未轉(zhuǎn)ZmVps29基因的黃早四*ZmVPS12-1。2、T1代轉(zhuǎn)ZmVps29基因的黃早四*ZmVPS12-2的獲得按照步驟1的方法，將“ZmVPS12-1的花粉”替換為“ZmVPS12-2的花粉”，其它步驟均不變，得到T1代轉(zhuǎn)ZmVps29基因的黃早四*ZmVPS12-2和T1代未轉(zhuǎn)ZmVps29基因的黃早四*ZmVPS12-2。3、T1代轉(zhuǎn)ZmVps29基因的黃早四*ZmVPS12-3的獲得按照步驟1的方法，將“ZmVPS12-1的花粉”替換為“ZmVPS12-3的花粉”，其它步驟均不變，得到T1代轉(zhuǎn)ZmVps29基因的黃早四*ZmVPS12-3和T1代未轉(zhuǎn)ZmVps29基因的黃早四*ZmVPS12-3。4、T1代未轉(zhuǎn)ZmVps29基因的黃早四*Hi-Ⅱ的獲得采集Hi-Ⅱ的花粉，與黃早四進(jìn)行雜交，得到T1代未轉(zhuǎn)ZmVps29基因的黃早四*Hi-Ⅱ。5、T1代轉(zhuǎn)ZmVps29基因的鄭58*ZmVPS12-1的獲得按照步驟1的方法，將“黃早四”替換為“鄭58”，其它步驟均不變，得到T1代轉(zhuǎn)ZmVps29基因的鄭58*ZmVPS12-1和T1代未轉(zhuǎn)ZmVps29基因的鄭58*ZmVPS12-1。6、T1代轉(zhuǎn)ZmVps29基因的鄭58*ZmVPS12-2的獲得按照步驟1的方法，將“黃早四”替換為“鄭58”且將“ZmVPS12-1的花粉”替換為“ZmVPS12-2的花粉”，其它步驟均不變，得到T1代轉(zhuǎn)ZmVps29基因的鄭58*ZmVPS12-2和T1代未轉(zhuǎn)ZmVps29基因的鄭58*ZmVPS12-2。7、T1代轉(zhuǎn)ZmVps29基因的鄭58*ZmVPS12-3的獲得按照步驟1的方法，將“黃早四”替換為“鄭58”且將“ZmVPS12-1的花粉”替換為“ZmVPS12-3的花粉”，其它步驟均不變，得到T1代轉(zhuǎn)ZmVps29基因的鄭58*ZmVPS12-3和T1代未轉(zhuǎn)ZmVps29基因的鄭58*ZmVPS12-3。8、T1代未轉(zhuǎn)ZmVps29基因的鄭58*Hi-Ⅱ的獲得采集Hi-Ⅱ的花粉，與鄭58進(jìn)行雜交，得到T1代未轉(zhuǎn)ZmVps29基因的鄭58*Hi-Ⅱ。四、檢測(cè)T1代轉(zhuǎn)ZmVps29基因玉米中的ZmVps29基因的相對(duì)表達(dá)量1、玉米材料的獲得(1)隨機(jī)取5株T1代轉(zhuǎn)ZmVps29基因的黃早四*ZmVPS12-1，進(jìn)行如下操作：分別取旗葉，混合，得到黃早四*ZmVPS12-1的葉片材料；分別取自交授粉第6天的籽粒，混合，得到黃早四*ZmVPS12-1的籽粒材料。(2)按照步驟(1)的方法，將T1代轉(zhuǎn)ZmVps29基因的黃早四*ZmVPS12-1替換為T(mén)1代轉(zhuǎn)ZmVps29基因的黃早四*ZmVPS12-2，其它步驟均不變，得到黃早四*ZmVPS12-2的葉片材料和黃早四*ZmVPS12-2的籽粒材料。(3)按照步驟(1)的方法，將T1代轉(zhuǎn)ZmVps29基因的黃早四*ZmVPS12-1替換為T(mén)1代轉(zhuǎn)ZmVps29基因的黃早四*ZmVPS12-3，其它步驟均不變，得到黃早四*ZmVPS12-3的葉片材料和黃早四*ZmVPS12-3的籽粒材料。(4)按照步驟(1)的方法，將T1代轉(zhuǎn)ZmVps29基因的黃早四*ZmVPS12-1替換為T(mén)1代未轉(zhuǎn)ZmVps29基因的黃早四*Hi-Ⅱ，其它步驟均不變，得到黃早四*Hi-Ⅱ的葉片材料和黃早四*Hi-Ⅱ的籽粒材料。2、采用TRIzol試劑提取玉米材料(黃早四*ZmVPS12-1的葉片材料、黃早四*ZmVPS12-1的籽粒材料、黃早四*ZmVPS12-2的葉片材料、黃早四*ZmVPS12-2的籽粒材料、黃早四*ZmVPS12-3的葉片材料、黃早四*ZmVPS12-3的籽粒材料、黃早四*Hi-Ⅱ的葉片材料或黃早四*Hi-Ⅱ的籽粒材料)的總RNA，將該總RNA用M-MLV反轉(zhuǎn)錄出第一鏈cDNA，得到玉米材料的cDNA。玉米材料的cDNA中，DNA濃度為500ng/μL。3、以步驟2得到的玉米材料的cDNA為模板，使用SYBRPremixExTaqTM試劑盒檢測(cè)玉米材料的ZmVps29基因的相對(duì)表達(dá)量(以GAPDH基因作為內(nèi)參基因)。檢測(cè)ZmVps29基因的引物為正向引物1：5’-CTTTGCCCTGATCTCCATATTACC-3’和反向引物1：5’-CACGCCTCCCTCGTGCTTAT-3’。檢測(cè)GAPDH基因的引物為正向引物2：5’-CCCTTCATCACCACGGACTAC-3’和反向引物2：5’-TCCCACCACGGTTCTTCCAA-3’。反應(yīng)體系為20μL，由10μL2×SYBRPremixExTaq、0.4μL濃度為10μM的正向引物、0.4μL濃度為10μM的反向引物、0.4μL50×ROXReferenceDyeII、0.8μL擬南芥幼苗的cDNA和8.0μL無(wú)核酸酶水組成。熒光定量PCR檢測(cè)的反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性1min；95℃變性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸31sec，40個(gè)循環(huán)；在95℃變性15sec，60℃退火30sec，72℃延伸15sec時(shí)收集溶解曲線，通過(guò)采用2-ΔΔCt法(LivakandSchmittgen，2001)分析玉米材料的ZmVps29基因的相對(duì)表達(dá)量。以黃早四*Hi-Ⅱ的葉片材料的ZmVps29基因的相對(duì)表達(dá)量作為1，其它葉片材料的相對(duì)表達(dá)量見(jiàn)圖10(WT為黃早四*Hi-Ⅱ的葉片材料，ZmVPS12-1為黃早四*ZmVPS12-1的葉片材料，ZmVPS12-2為黃早四*ZmVPS12-2的葉片材料，ZmVPS12-3為黃早四*ZmVPS12-3的葉片材料)。以黃早四*Hi-Ⅱ的籽粒材料的ZmVps29基因的相對(duì)表達(dá)量作為1，其它籽粒材料的相對(duì)表達(dá)量見(jiàn)圖11(WT為黃早四*Hi-Ⅱ的籽粒材料，ZmVPS12-1為黃早四*ZmVPS12-1的籽粒材料，ZmVPS12-2為黃早四*ZmVPS12-2的籽粒材料，ZmVPS12-3為黃早四*ZmVPS12-3的籽粒材料)。結(jié)果表明，T1代轉(zhuǎn)ZmVps29基因的黃早四*ZmVPS12-1、T1代轉(zhuǎn)ZmVps29基因的黃早四*ZmVPS12-2或T1代轉(zhuǎn)ZmVps29基因的黃早四*ZmVPS12-3的葉片或自交授粉第6天的籽粒的ZmVps29基因的相對(duì)表達(dá)量均顯著高于T1代未轉(zhuǎn)ZmVps29基因的黃早四*Hi-Ⅱ。按照上述方法，將“T1代轉(zhuǎn)ZmVps29基因的黃早四*ZmVPS12-1”替換為“T1代轉(zhuǎn)ZmVps29基因的鄭58*ZmVPS12-1”，將“T1代轉(zhuǎn)ZmVps29基因的黃早四*ZmVPS12-2”替換為“T1代轉(zhuǎn)ZmVps29基因的鄭58*ZmVPS12-2”，將“T1代轉(zhuǎn)ZmVps29基因的黃早四*ZmVPS12-3”替換為“T1代轉(zhuǎn)ZmVps29基因的鄭58*ZmVPS12-3”，將“T1代未轉(zhuǎn)ZmVps29基因的黃早四*Hi-Ⅱ”替換為“T1代未轉(zhuǎn)ZmVps29基因的鄭58*Hi-Ⅱ”，其它步驟均不變，得到各個(gè)玉米材料的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果表明，T1代轉(zhuǎn)ZmVps29基因的鄭58*ZmVPS12-1、T1代轉(zhuǎn)ZmVps29基因的鄭58*ZmVPS12-2或T1代轉(zhuǎn)ZmVps29基因的鄭58*ZmVPS12-3的葉片或自交授粉第6天的籽粒的ZmVps29基因的相對(duì)表達(dá)量均顯著高于T1代未轉(zhuǎn)ZmVps29基因的鄭58*Hi-Ⅱ。五、籽粒性狀的鑒定1、測(cè)量待測(cè)果穗上種子的10粒長(zhǎng)(cm)和10粒寬(cm)。待測(cè)果穗為步驟三中1得到的T1代轉(zhuǎn)ZmVps29基因的黃早四*ZmVPS12-1的果穗、步驟三中1得到的T1代未轉(zhuǎn)ZmVps29基因的黃早四*ZmVPS12-1的果穗、步驟三中2得到的T1代轉(zhuǎn)ZmVps29基因的黃早四*ZmVPS12-2的果穗、步驟三中2得到的T1代未轉(zhuǎn)ZmVps29基因的黃早四*ZmVPS12-2的果穗、步驟三中3得到的T1代轉(zhuǎn)ZmVps29基因的黃早四*ZmVPS12-3的果穗、步驟三中3得到的T1代未轉(zhuǎn)ZmVps29基因的黃早四*ZmVPS12-3的果穗、步驟三中5得到的T1代轉(zhuǎn)ZmVps29基因的鄭58*ZmVPS12-1的果穗、步驟三中5得到的T1代未轉(zhuǎn)ZmVps29基因的鄭58*ZmVPS12-1的果穗、步驟三中6得到的T1代轉(zhuǎn)ZmVps29基因的鄭58*ZmVPS12-2的果穗、步驟三中6得到的T1代未轉(zhuǎn)ZmVps29基因的鄭58*ZmVPS12-2的果穗、步驟三中7得到的T1代轉(zhuǎn)ZmVps29基因的鄭58*ZmVPS12-3的果穗或步驟三中7得到的T1代未轉(zhuǎn)ZmVps29基因的鄭58*ZmVPS12-3的果穗。部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖12和圖13。2、測(cè)量待測(cè)果穗上種子的10粒長(zhǎng)(cm)、10粒寬(cm)、10粒長(zhǎng)/10粒寬和單穗產(chǎn)量(g)。待測(cè)果穗為步驟三中1得到的T1代轉(zhuǎn)ZmVps29基因的黃早四*ZmVPS12-1的果穗、步驟三中2得到的T1代轉(zhuǎn)ZmVps29基因的黃早四*ZmVPS12-2的果穗、步驟三中3得到的T1代轉(zhuǎn)ZmVps29基因的黃早四*ZmVPS12-3的果穗、步驟三中4得到的T1代未轉(zhuǎn)ZmVps29基因的黃早四*Hi-Ⅱ的果穗、步驟三中5得到的T1代轉(zhuǎn)ZmVps29基因的鄭58*ZmVPS12-1的果穗、步驟三中6得到的T1代轉(zhuǎn)ZmVps29基因的鄭58*ZmVPS12-2的果穗、步驟三中7得到的T1代轉(zhuǎn)ZmVps29基因的鄭58*ZmVPS12-3的果穗或步驟三中8得到的T1代未轉(zhuǎn)ZmVps29基因的鄭58*Hi-Ⅱ的果穗。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖14(左上為10粒長(zhǎng)，右上為10粒寬，左下為10粒長(zhǎng)/10粒寬，右下為單穗產(chǎn)量；WT為T(mén)1代未轉(zhuǎn)ZmVps29基因的黃早四*Hi-Ⅱ，ZmVPS12-1為T(mén)1代轉(zhuǎn)ZmVps29基因的黃早四*ZmVPS12-1，ZmVPS12-2為T(mén)1代轉(zhuǎn)ZmVps29基因的黃早四*ZmVPS12-2，ZmVPS12-3為T(mén)1代轉(zhuǎn)ZmVps29基因的黃早四*ZmVPS12-3)和圖15(左上為10粒長(zhǎng)，右上為10粒寬，左下為10粒長(zhǎng)/10粒寬，右下為單穗產(chǎn)量；WT為T(mén)1代未轉(zhuǎn)ZmVps29基因的鄭58*Hi-Ⅱ，ZmVPS12-1為T(mén)1代轉(zhuǎn)ZmVps29基因的鄭58*ZmVPS12-1，ZmVPS12-2為T(mén)1代轉(zhuǎn)ZmVps29基因的鄭58*ZmVPS12-2，ZmVPS12-3為T(mén)1代轉(zhuǎn)ZmVps29基因的鄭58*ZmVPS12-3)。上述結(jié)果表明，在黃早四或鄭58中過(guò)表達(dá)ZmVPS29基因，可以顯著的減少10粒寬、增加10粒長(zhǎng)/10粒寬和增加單穗產(chǎn)量，籽粒變?yōu)榧?xì)長(zhǎng)籽粒。因此，蛋白質(zhì)ZmVps29可調(diào)控玉米籽粒的性狀和單穗產(chǎn)量。<110>中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所<120>蛋白質(zhì)ZmVps29在調(diào)控植物籽粒性狀和產(chǎn)量中的應(yīng)用<160>4<170>PatentInversion3.5<210>1<211>567<212>DNA<213>玉米ZeamaysL.<400>1atggtgcttgtgcttgcgctgggggatctgcacatcccgcaccgggcgcccgacctcccc60gccaaattcaagtccatgctcgtgcccggcaagatccaacacatcatctgcactggcaat120ctctgcatcaaggaagtccatgactacctgaaaagcctttgccctgatctccatattacc180agaggtgaacatgatgaggatgctcgatacccagagactaagacacttacaattggtcag240tttaagcttgggctgtgccatggccatcaggttgttccatggggcgacctggactccctg300gcgatgctccagcggcagctggacgtggacatcctggtgaccgggcacacgcaccagttc360aaggcatataagcacgagggaggcgtggtgatcaaccctggctctgccacgggcgcctac420agcagcatcacttacgacgtgaacccaagctttgtgctgatggacatcgacgggctccgt480gtggtggtgtacgtctacgagctgattgacggcgaggtgaaggtggacaaaatcgacttc540aagaagactgcgacgatgcacggctag567<210>2<211>188<212>PRT<213>玉米ZeamaysL.<400>2MetValLeuValLeuAlaLeuGlyAspLeuHisIleProHisArgAla151015ProAspLeuProAlaLysPheLysSerMetLeuValProGlyLysIle202530GlnHisIleIleCysThrGlyAsnLeuCysIleLysGluValHisAsp354045TyrLeuLysSerLeuCysProAspLeuHisIleThrArgGlyGluHis505560AspGluAspAlaArgTyrProGluThrLysThrLeuThrIleGlyGln65707580PheLysLeuGlyLeuCysHisGlyHisGlnValValProTrpGlyAsp859095LeuAspSerLeuAlaMetLeuGlnArgGlnLeuAspValAspIleLeu100105110ValThrGlyHisThrHisGlnPheLysAlaTyrLysHisGluGlyGly115120125ValValIleAsnProGlySerAlaThrGlyAlaTyrSerSerIleThr130135140TyrAspValAsnProSerPheValLeuMetAspIleAspGlyLeuArg145150155160ValValValTyrValTyrGluLeuIleAspGlyGluValLysValAsp165170175LysIleAspPheLysLysThrAlaThrMetHisGly180185<210>3<211>2351<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>3ctcacccccacaagtcaagaacaggtaccacaggatgaggcgcatggaggatgctgcgat60gtgttcgtgagaggtctaggccgtcgtctcctagtcaactttgggttgctggatcgttgt120ctccttaccatgtaattatttatttattttgtacagaactcctattatatagtaaagtta180ttacattcatttctgtaccatgatttatcatatgtgtgagacttggtcccagcacacctg240gtgattatgttcgcgcctgggtccctaaaactcgagtgtgacagagggcgtgcggagatg300gccggaaaacgcgtgaacgtggacgcatccacgatgggggcgtgggtgggaggttaggga360cgaggtctgacgggtgggtccgcaggacagagagagaggatgagcgcgtgcgaggggatc420agcaccgacaggccgaccccacagagcacagagagagagagaaggggtgcgtgggctggc480gccgataggccgggtccgtctgtccgacttgggctgaaatggttttttctatttttcagg540gaatttctagtgtttttctatttatgttctctagggttttgaattcaaattcaaactaaa600tcaaacatgtgcaacaatttaaaaaatatttggagctcagcacgatgcaacatttcatga660ctcatattattttgacaaaataaaataatcaacccctcactaattaagctaattctacta720aaaagaaaaagagagagaaactagagagagaggagtaacacctgaatttggtaggtaatt780agaaagaaattttatacccccaaatttagggtgttacaacctctgcggacaaggcaaaat840gcgcagttatttgaaaggaatattcgaaccaaggttcgatctaccacggccacggcccgc900cggcggcggcggcacgcgcgtgtgtggtcgtctttcattcttttcccaacttcttaatag960atgcaccaattggtgcacctatttaagttgattgattgatctcttaaacttacaatatgg1020tactaaattattagtacaccatatcattaaagtggaccactagcattgactattattgaa1080tattaattgggccaagccaacattaatccaatataaacaatgataattaggtaatatttt1140gaataatatggatgacataaatcttgaaaatataggatacatggagattatgtattgaac1200ttgagaaatctatagacagagtttctgaattgaactaggtaaatctgtaaacgggaatac1260tgaattatactccctctctttagaaaattaacaaattcttacaatacttgatgtatgtat1320tatatatatgtgtatagatttattatcattcatttgaatatagacataaaaccaagatct1380aaaacgaatactattttagacggagagagtatagatttgtaagaatctatttagctgatg1440tatcctttcagttaggattcaatttttttttaataggaggattcaaattttttgatagta1500catctagattctagaccgtcgatctttcaaacgttgaaaagaggaagaagagcttgacgt1560tttgcttagcttaacgctagcccaacgaacttggcgaaaccgatggagcctcaaacgggc1620cgtatccgtcgtgcacagcatgctaaagcccagtgctgacgacgacgaacaacactcatc1680cggcccggtcatgagcccaatgcggggccacttcgtcgtttttgacaagtagacccacag1740tggccccacgtgcttgcccctccctttctcttctccccttgtgtcgcgctcgcgcatctg1800aagcaagggggggaagggccaagggggatcggtcttgttctcggagagggttgagctgct1860tgacggttttgactcggatcatggtgtgcagctctatcagatagagagctgacgtgaggt1920gtgagacgcggatcgtggagtactactcagtaggagaggtggggagggggaagaaggcga1980tagccggggaggatggtgcttgtgcttgcgctgggggatctgcacatcccgcaccgggcg2040cccgacctccccgccaaattcaagtccatgctcgtgcccggcaagatccaacacatcatc2100tgcactggcaatctctgcatcaaggtaaccttaccttccgcgcctggccggccggccggg2160taaccggcgtccctcggcgatcgattttacaatcctttcctctcgcctcatgtgtccaat2220ttttgcgctggctaggtcgtactgccgcggatagttgcatcacgtgagaaatcgttatgg2280ttcttaggtcgtgctgggatcagccgcatcgctgtattagtctactgcagttgtttgttt2340ggttcggtcgg2351<210>4<211>2367<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>4ctcacccccacaagtcaagaacaggtaccacaggatgaggcgcatggaggatgctgcgat60gtgttcgtgagaggtctaggccgtcgtctcctagtcaactttgggttgatggatcgttgt120ctccttaccatgtatttatttatttattttgtacagaactcctattatatagtaaagtta180ttacattcgtttctgtaccatgatttatcatatgtgtgagacttggtcccagcgcacctg240gtgattatgttcgcgcccgggtccctaaaacccgagtgtgacagagggcgtgcggagatg300gccggaaaacgcgtgaacgtggacgcatccacgatgggggcgtgggtgggaggttaggga360cgaggtctgacgggtgggtccgcagggcagagagagaggatgagcgcgtgcgaggggatc420agcaccgacaggccgaccccacagagcagagagagagagagagaaggggtgcgtgggctg480gcgccgataggccgggtccgtctgtccgacttgggctgaaatggttttttctatttttca540gggaatttctaatgtttttctatttatgttctctagggttttgaattcaaattcaaacta600aatcaaacatgtgcaacaatttaaaaaatatttggagctcaccacgatgcaacatttcat660gactcatattgttttgacaaaataaaataatcaacccctcactaattaagctaattctac720taaaaagaaaaagagagagaaactagagagagaggagtaacacctgaatttggtaggtaa780ttagaaagaaattttatacccccaaatttagggtgttacaacctctgcggacaaggcaaa840atgcgcagttatttgaaaggaatattcgaaccaaggttcgatctaccacggccacggccc900gccggcggcggcggcacgcgcgcgtgtggtcgtttttcattcttttcccaacttcttaat960agatgcaccaattggtgcacctatttaagttgattgattgatctcttgaacttacaatat1020gatactaaattattagtataccatatcattaaagtggaccactagcattgactattattg1080aatattaattgggccaagccaacattaatccaatataaacaatgataattaggtaatatt1140ttgaataatatggatggcataaatcttgaaaatataggatacatggagattatgtattga1200acttgagaaatctatagacagagtttctgaattgaactaggtaaatctgtaaacgggaat1260actgaattatactccctctctttagaaaattaacaaattcttacaatacttgatgtatgt1320attatatatatgtgtatagatttattatcattcatttgaatatagacataaaaaccaaga1380tctaaaacgaatactattttagacggagagagtatagatttgtaagaatctatttagctg1440atgtatcctttcagttaggattcaatttttttttaataggaggattcaaattttttgata1500gtacatctagattctagaccgtcgatctttcaaacgttgaaaagaggaagaagagcttga1560cgttttgcttagcttaacgctagcccaacgaacttggcgaaaccgatggagcctcaaacg1620ggccgtatccgtcgtgcacagcatgctaaagcccagtgctgacgacgacgaacaacactc1680atccggcccggtcatgagcccaatgcggggccacttcgtcgtttttgacaagtagaccca1740cagtggccccacgtgcttgcccctccctttctcttctccccttgtgtcgcgctcgcgcat1800ctgaagcaagggggggaagggccaagggggatcggtcttgttctcggagagggttgagct1860gcttgacggttttgactcggatcatggtgtgcagctctatcagatagagagctgacgtga1920ggtgtgagacgcggatcgtggagtactactcagtaggagatcaagaggaaggaggtgggg1980agggggaagaaggcgatagccggggaggatggtgcttgtgcttgcgctgggggatctgca2040catcccgcaccgggcgcccgacctccccgccaaattcaagtccatgctcgtgcccggcaa2100gatccaacacatcatctgcactggcaatctctgcatcaaggtaaccttaccttccgcgcc2160tggccggccggccgggtaaccggcgtccctcggcgatcgattttacaatcctttcctctc2220gcctcatgtgtccaatttttgcgctggctaggtcgtactgccgcggatagttgcatcacg2280tgagaaatcgttatggttcttaggtcgtgctgggatcagccgcatcgctgtattagtcta2340ctgcagttgtttgtttggttcggtcgg2367當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3