本發(fā)明屬生命科學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及檢測(cè)與先天性角化不良癥有關(guān)的基因突變的引物和方法。

背景技術(shù)：

先天性角化不良癥(dskeratosiseongenita，DC)是一種具有遺傳異質(zhì)性的骨髓衰竭綜合征，發(fā)病率約為1/100萬。典型的DC患者約80％～90％具有皮膚黏膜異常三聯(lián)征，表現(xiàn)為皮膚網(wǎng)狀色素沉著、指(趾)甲萎縮、口腔黏膜白斑。目前文獻(xiàn)報(bào)道可引起DC的突變基因主要有CTC1，DKC1，TERC，TERT，TINF2，NHP2，NOP10及WRAP53。文獻(xiàn)報(bào)道，這些基因有3種遺傳方式，分別為X-連鎖隱性遺傳、常染色體隱性遺傳、常染色體顯性遺傳。但目前仍約50％患者遺傳特征不明確。X-連鎖隱性遺傳包括DKC1，常染色體顯性遺傳包括TERC及TINF2，常染色體隱性遺傳包括CTC1，WRAP53，NHP2，NOP10，既可以作為常染色體顯性遺傳又可以作為隱性遺傳的有TERT。

端粒酶卡扎爾體蛋白1(telomerase cajal body protein 1，TCAB1又名WRAP53、WDR79)是2009年新發(fā)現(xiàn)的端粒酶關(guān)鍵核心蛋白組分，其主要存在于卡扎爾體蛋白中。WRAP53基因定位于染色體17p13上，共有10個(gè)外顯子，與P53基因重疊，是P53的反義轉(zhuǎn)錄基因，它不僅能調(diào)節(jié)p53基因的表達(dá)還能調(diào)節(jié)端粒的合成。WRAP53表達(dá)的缺失不會(huì)影響端粒酶活性及TERC水平，但可在細(xì)胞的S期阻止端粒酶與端粒結(jié)合，最終導(dǎo)致端粒變短。Zhong等發(fā)現(xiàn)WRAP53的突變阻止了端粒酶定位于卡扎爾體蛋白，導(dǎo)致了先天性角化不良癥的發(fā)生。近年來，通過全基因組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)WRAP53基因突變?cè)谙忍煨越腔涣及Y患者中非常常見。目前文獻(xiàn)報(bào)道在兩個(gè)先天性角化不良癥的家族中發(fā)現(xiàn)WRAP53基因存在4個(gè)突變點(diǎn)，分別為F164L(第2外顯子)、H376Y(第7外顯子)、R398W(第8外顯子)、G435R(第9外顯子)。目前國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道的DC病例絕大多數(shù)為30歲左右皮膚受累的臨床病例，病例數(shù)較少，且較少進(jìn)行基因檢測(cè)。因此有必要進(jìn)行相關(guān)基因的突變檢測(cè)，有必要先對(duì)患者進(jìn)行WRAP53基因進(jìn)行全外顯子突變篩選，有助于對(duì)先天性角化不良癥的早期診斷，減少誤診、漏診，并進(jìn)行治療。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)遺傳性WRAP53基因多態(tài)突變熱點(diǎn)的引物，采用PCR技術(shù)，可用于快速檢測(cè)先天性角化不良癥患者體內(nèi)WRAP53基因多態(tài)位點(diǎn)的突變情況。所述檢測(cè)WRAP53基因多態(tài)熱點(diǎn)突變情況的引物，包括：

擴(kuò)增WRAP53基因的引物，其堿基序列為：

WRAP53-Exon1A-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGAACGGGAAACCTTCTAA

WRAP53-Exon1A-R：AACAGCTATGACCATGGACAGCAGTCCGGAGCTAAC

WRAP53-Exon1B-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTAATCTCCGCTGTGCTTCC

WRAP53-Exon1B-R：AACAGCTATGACCATGTCTTCTGCAGGAAGGCTTGT

WRAP53-Exon1C-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGACCCAGTTTCTCTCTCC

WRAP53-Exon1C-R：AACAGCTATGACCATGCTGGAGAAGTGGGTCTCAGG

WRAP53-Exon2-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGTGGAGTCTGGGGAGATGAA

WRAP53-Exon2-R：AACAGCTATGACCATGGGGCATCCCTCTCCTAGAAA

WRAP53-Exon3-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCAGCCCTAGCCCTACACTTG

WRAP53-Exon3-R：AACAGCTATGACCATGTGCTGCCACAAGAAATTCAC

WRAP53-Exon4-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGAGCTCACCCTTGAACA

WRAP53-Exon4-R：AACAGCTATGACCATGCTGACCAGCCCCTCTGATAA

WRAP53-Exon5-F：TGTAAAACGACGGCCAGTACACCCAGCCTCATTTTTGT

WRAP53-Exon5-R：AACAGCTATGACCATGGGAAGGAAAGGGCTGAAAAC

WRAP53-Exon6-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCATATCTGGGACGCATTCA

WRAP53-Exon6-R：AACAGCTATGACCATGGTACAGAGGACGGCGTGAAC

WRAP53-Exon7A-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCTTGTGACAGACAGCATGG

WRAP53-Exon7A-R：AACAGCTATGACCATGTCTCAGGGTGTGACCCCTAC

WRAP53-Exon7B-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGTATGCCTGGGATGATG

WRAP53-Exon7B-R：AACAGCTATGACCATGATTGGTGGTCACCTCTCGAC

WRAP53-Exon8-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTGAAGGAGTGCCTGGAGAC

WRAP53-Exon8-R：AACAGCTATGACCATGACCCTACAGCTGGGCTCTG

WRAP53-Exon9-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCCTCTGCCAGCAAATCTCTC

WRAP53-Exon9-R：AACAGCTATGACCATGTCTCTGTGGGCTCAGGAAAC

WRAP53-Exon10-F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGGGAGCAAGTGTCCTCA

WRAP53-Exon10-R：AACAGCTATGACCATGGCCTGGTTTCAGGACCAATA

進(jìn)一步地，還包括測(cè)序引物，其堿基序列為：

檢測(cè)WRAP53基因的測(cè)序引物堿基序列為：

M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT

M13R：AACAGCTATGACCATG

進(jìn)一步地，引物序列WRAP53-Exon1A-F、WRAP53-Exon1A-R、WRAP53-Exon1B-F、WRAP53-Exon1B-R、WRAP53-Exon1C-R以及WRAP53-Exon1C-F是擴(kuò)增WRAP53基因第1外顯子序列的引物，引物序列WRAP53-Exon2-F和WRAP53-Exon2-R是擴(kuò)增WRAP53基因第2外顯子序列的引物，以此類推，引物序列WRAP53-Exon10-F和WRAP53-Exon10-R是擴(kuò)增WRAP53基因第10外顯子序列的引物。

本發(fā)明還提供了檢測(cè)WRAP53基因全外顯子突變情況的方法，包括以下步驟：

1.抽提外周血中的基因組DNA；

2.用PCR擴(kuò)增步驟1中提取的DNA；

3.對(duì)步驟2中的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序；

4.對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行判斷，確定WRAP53基因是否發(fā)生突變；

其中PCR擴(kuò)增引物為：

擴(kuò)增WRAP53基因的引物，其堿基序列為：

WRAP53-Exon1A-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGAACGGGAAACCTTCTAA

WRAP53-Exon1A-R：AACAGCTATGACCATGGACAGCAGTCCGGAGCTAAC

WRAP53-Exon1B-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTAATCTCCGCTGTGCTTCC

WRAP53-Exon1B-R：AACAGCTATGACCATGTCTTCTGCAGGAAGGCTTGT

WRAP53-Exon1C-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGACCCAGTTTCTCTCTCC

WRAP53-Exon1C-R：AACAGCTATGACCATGCTGGAGAAGTGGGTCTCAGG

WRAP53-Exon2-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGTGGAGTCTGGGGAGATGAA

WRAP53-Exon2-R：AACAGCTATGACCATGGGGCATCCCTCTCCTAGAAA

WRAP53-Exon3-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCAGCCCTAGCCCTACACTTG

WRAP53-Exon3-R：AACAGCTATGACCATGTGCTGCCACAAGAAATTCAC

WRAP53-Exon4-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGAGCTCACCCTTGAACA

WRAP53-Exon4-R：AACAGCTATGACCATGCTGACCAGCCCCTCTGATAA

WRAP53-Exon5-F：TGTAAAACGACGGCCAGTACACCCAGCCTCATTTTTGT

WRAP53-Exon5-R：AACAGCTATGACCATGGGAAGGAAAGGGCTGAAAAC

WRAP53-Exon6-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCATATCTGGGACGCATTCA

WRAP53-Exon6-R：AACAGCTATGACCATGGTACAGAGGACGGCGTGAAC

WRAP53-Exon7A-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCTTGTGACAGACAGCATGG

WRAP53-Exon7A-R：AACAGCTATGACCATGTCTCAGGGTGTGACCCCTAC

WRAP53-Exon7B-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGTATGCCTGGGATGATG

WRAP53-Exon7B-R：AACAGCTATGACCATGATTGGTGGTCACCTCTCGAC

WRAP53-Exon8-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTGAAGGAGTGCCTGGAGAC

WRAP53-Exon8-R：AACAGCTATGACCATGACCCTACAGCTGGGCTCTG

WRAP53-Exon9-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCCTCTGCCAGCAAATCTCTC

WRAP53-Exon9-R：AACAGCTATGACCATGTCTCTGTGGGCTCAGGAAAC

WRAP53-Exon10-F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGGGAGCAAGTGTCCTCA

WRAP53-Exon10-R：AACAGCTATGACCATGGCCTGGTTTCAGGACCAATA

進(jìn)一步地，還包括測(cè)序引物，其堿基序列為：

檢測(cè)WRAP53基因的測(cè)序引物堿基序列為：

M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT

M13R：AACAGCTATGACCATG

本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)WRAP53基因多態(tài)突變位點(diǎn)的試劑盒，包括：

(i)全血基因組DNA抽提試劑；

(ii)檢測(cè)體系PCR擴(kuò)增反應(yīng)液；

(iii)測(cè)序體系試劑；

其中PCR擴(kuò)增反應(yīng)液引物為：

擴(kuò)增WRAP53基因的引物，其堿基序列為：

WRAP53-Exon1A-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGAACGGGAAACCTTCTAA

WRAP53-Exon1A-R：AACAGCTATGACCATGGACAGCAGTCCGGAGCTAAC

WRAP53-Exon1B-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTAATCTCCGCTGTGCTTCC

WRAP53-Exon1B-R：AACAGCTATGACCATGTCTTCTGCAGGAAGGCTTGT

WRAP53-Exon1C-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGACCCAGTTTCTCTCTCC

WRAP53-Exon1C-R：AACAGCTATGACCATGCTGGAGAAGTGGGTCTCAGG

WRAP53-Exon2-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGTGGAGTCTGGGGAGATGAA

WRAP53-Exon2-R：AACAGCTATGACCATGGGGCATCCCTCTCCTAGAAA

WRAP53-Exon3-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCAGCCCTAGCCCTACACTTG

WRAP53-Exon3-R：AACAGCTATGACCATGTGCTGCCACAAGAAATTCAC

WRAP53-Exon4-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGAGCTCACCCTTGAACA

WRAP53-Exon4-R：AACAGCTATGACCATGCTGACCAGCCCCTCTGATAA

WRAP53-Exon5-F：TGTAAAACGACGGCCAGTACACCCAGCCTCATTTTTGT

WRAP53-Exon5-R：AACAGCTATGACCATGGGAAGGAAAGGGCTGAAAAC

WRAP53-Exon6-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCATATCTGGGACGCATTCA

WRAP53-Exon6-R：AACAGCTATGACCATGGTACAGAGGACGGCGTGAAC

WRAP53-Exon7A-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCTTGTGACAGACAGCATGG

WRAP53-Exon7A-R：AACAGCTATGACCATGTCTCAGGGTGTGACCCCTAC

WRAP53-Exon7B-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGTATGCCTGGGATGATG

WRAP53-Exon7B-R：AACAGCTATGACCATGATTGGTGGTCACCTCTCGAC

WRAP53-Exon8-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTGAAGGAGTGCCTGGAGAC

WRAP53-Exon8-R：AACAGCTATGACCATGACCCTACAGCTGGGCTCTG

WRAP53-Exon9-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCCTCTGCCAGCAAATCTCTC

WRAP53-Exon9-R：AACAGCTATGACCATGTCTCTGTGGGCTCAGGAAAC

WRAP53-Exon10-F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGGGAGCAAGTGTCCTCA

WRAP53-Exon10-R：AACAGCTATGACCATGGCCTGGTTTCAGGACCAATA

進(jìn)一步地，測(cè)序引物堿基序列為：

M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT

M13R：AACAGCTATGACCATG

有益效果：本發(fā)明設(shè)計(jì)了擴(kuò)增WRAP5310個(gè)外顯子序列的引物。通過加接頭，使所有13對(duì)引物的PCR產(chǎn)物均可以用一種測(cè)序引物進(jìn)行測(cè)序。采用PCR技術(shù)，構(gòu)建了穩(wěn)定的擴(kuò)增體系。通過調(diào)整引物濃度、退火溫度等反應(yīng)條件，可使擴(kuò)增效率達(dá)到最佳。WRAP53基因的突變類型種類多且遍布整個(gè)基因，因此本發(fā)明所述引物既能將所述WRAP53全部外顯子序列都擴(kuò)增出來，也保證無論這些外顯子的何處位置發(fā)生突變，都不會(huì)出現(xiàn)漏檢的情況。相比較熒光定量PCR法降低了檢測(cè)的成本和難度。熒光定量PCR法要針對(duì)不同的突變類型設(shè)計(jì)多個(gè)探針，成本高，檢測(cè)難度大。本發(fā)明的13對(duì)引物涵蓋了WRAP53基因全部外顯子區(qū)域，使得后續(xù)測(cè)序時(shí)的上下游引物均能測(cè)出目的片段，一定程度上保證了測(cè)序的準(zhǔn)確性。

附圖說明

圖1為WRAP53基因在染色體上定位圖。

圖2和圖3為WRAP53基因經(jīng)13對(duì)引物擴(kuò)增后所得產(chǎn)物的電泳圖譜，每對(duì)引物的擴(kuò)增均設(shè)有一個(gè)重復(fù)，M為Marker DL 2000，如圖2和圖3所示，引物擴(kuò)增有效，且條帶單一。

圖4為樣本4WRAP53基因第2號(hào)外顯子引物擴(kuò)增后的產(chǎn)物正反向測(cè)序圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例和附圖，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)注意的是，實(shí)施例中未說明的常規(guī)條件和方法，通常按照所屬領(lǐng)域?qū)嶒?yàn)人員常規(guī)采用方法：譬如，奧斯柏和金斯頓主編的《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》第四版，或者按照制造廠商所建議的步驟和條件。

實(shí)施例1

一種檢測(cè)WRAP53基因多態(tài)突變位點(diǎn)的引物，該引物的設(shè)計(jì)是針對(duì)WRAP53全外顯子設(shè)計(jì)的擴(kuò)增引物，包括：

擴(kuò)增WRAP53基因全外顯子序列的引物，其堿基序列為：

WRAP53-Exon1A-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGAACGGGAAACCTTCTAA

WRAP53-Exon1A-R：AACAGCTATGACCATGGACAGCAGTCCGGAGCTAAC

WRAP53-Exon1B-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTAATCTCCGCTGTGCTTCC

WRAP53-Exon1B-R：AACAGCTATGACCATGTCTTCTGCAGGAAGGCTTGT

WRAP53-Exon1C-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGACCCAGTTTCTCTCTCC

WRAP53-Exon1C-R：AACAGCTATGACCATGCTGGAGAAGTGGGTCTCAGG

WRAP53-Exon2-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGTGGAGTCTGGGGAGATGAA

WRAP53-Exon2-R：AACAGCTATGACCATGGGGCATCCCTCTCCTAGAAA

WRAP53-Exon3-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCAGCCCTAGCCCTACACTTG

WRAP53-Exon3-R：AACAGCTATGACCATGTGCTGCCACAAGAAATTCAC

WRAP53-Exon4-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGAGCTCACCCTTGAACA

WRAP53-Exon4-R：AACAGCTATGACCATGCTGACCAGCCCCTCTGATAA

WRAP53-Exon5-F：TGTAAAACGACGGCCAGTACACCCAGCCTCATTTTTGT

WRAP53-Exon5-R：AACAGCTATGACCATGGGAAGGAAAGGGCTGAAAAC

WRAP53-Exon6-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCATATCTGGGACGCATTCA

WRAP53-Exon6-R：AACAGCTATGACCATGGTACAGAGGACGGCGTGAAC

WRAP53-Exon7A-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCTTGTGACAGACAGCATGG

WRAP53-Exon7A-R：AACAGCTATGACCATGTCTCAGGGTGTGACCCCTAC

WRAP53-Exon7B-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGTATGCCTGGGATGATG

WRAP53-Exon7B-R：AACAGCTATGACCATGATTGGTGGTCACCTCTCGAC

WRAP53-Exon8-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTGAAGGAGTGCCTGGAGAC

WRAP53-Exon8-R：AACAGCTATGACCATGACCCTACAGCTGGGCTCTG

WRAP53-Exon9-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCCTCTGCCAGCAAATCTCTC

WRAP53-Exon9-R：AACAGCTATGACCATGTCTCTGTGGGCTCAGGAAAC

WRAP53-Exon10-F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGGGAGCAAGTGTCCTCA

WRAP53-Exon10-R：AACAGCTATGACCATGGCCTGGTTTCAGGACCAATA

一種檢測(cè)WRAP53基因多態(tài)突變位點(diǎn)的試劑盒，包括

(i)全血基因組DNA抽提試劑；

(ii)檢測(cè)體系PCR反應(yīng)液；

(iii)測(cè)序體系試劑；

其中，外周血基因組DNA提取所用試劑盒由天根生物科技有限公司提供。

檢測(cè)體系PCR擴(kuò)增反應(yīng)液包括：

測(cè)序體系試劑包括：

實(shí)施例2

血液/細(xì)胞/組織基因組DNA抽提試劑盒(天根生物)的操作流程：

(1)全血基因組DNA提取

1)于1.5ml離心管底部加入20μl QIAGEN Protease(或proteinase K)。.

2)離心管中加入200μl血漿。

3)加入200μl Buffer AL，振蕩15s。(注意：不可將QIAGEN Protease或proteinase K直接加入到Buffer AL中。若樣本量較大，則QIAGEN Protease和Buffer AL按比例增加。)

4)56℃水浴10min，之后短暫離心，以除去離心管蓋內(nèi)沿的液體。

5)加入200μl乙醇(96％-100％)，振蕩15s，短暫離心，以去除離心管蓋內(nèi)沿液體。

6)小心將以上所得混合液(包括沉淀物)小心加入到QIAamp微型離心柱中(不要潤(rùn)濕離心柱邊緣)將離心柱放入2ml收集管中，蓋緊離心管蓋，以6000×g(8000rpm)離心1min。將離心柱取出，放入一支潔凈的2ml收集管中(試劑盒提供)。丟棄收集管及其中液體。

7)小心加入500μl Buffer AW1到QIAamp微型離心柱中(不要潤(rùn)濕離心柱邊緣)。蓋緊離心管蓋，以6000×g(8000rpm)離心1min。將離心柱取出，放入一支潔凈的2ml收集管中(試劑盒提供)。丟棄收集管及其中液體。

8)小心加入500μl Buffer AW2到QIAamp微型離心柱中(不要潤(rùn)濕離心柱邊緣)。蓋緊離心管蓋，以20000×g(14000rpm)離心3min。

9)將QIAamp微型離心柱置入一支新的2ml收集管中(自備)，丟棄收集管及其中液體。全速離心1min。

10)將QIAamp微型離心柱置入一支潔凈1.5ml收集管中(自備)，丟棄收集管及其中液體。小心在QIAamp微型離心柱中加入100μl Buffer AE或蒸餾水。室溫下(15-25℃)靜置1min，6000×g(8000rpm)離心1min。將收集管蓋好，保存于-20℃。

(2)試劑配置：按檢測(cè)人份數(shù)配置檢測(cè)體系PCR反應(yīng)液各Xμl，每人份19μl分裝：

X＝19μl反應(yīng)液×(n份標(biāo)本+1份空白對(duì)照)

n為檢測(cè)標(biāo)本數(shù)。

(3)加樣：在分裝好的PCR反應(yīng)管中加入DNA，空白對(duì)照加等量生理鹽水或不加任何物質(zhì)。加樣要求如下：

(4)擴(kuò)增：檢測(cè)在常規(guī)PCR儀上進(jìn)行，可用儀器包括ABI veriti(美國(guó)Applied Biosystems公司)等。反應(yīng)條件如下：

PCR擴(kuò)增體系試劑配制方法如下：

其中，引物序列為：

WRAP53-Exon1A-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGAACGGGAAACCTTCTAA

WRAP53-Exon1A-R：AACAGCTATGACCATGGACAGCAGTCCGGAGCTAAC

WRAP53-Exon1B-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTAATCTCCGCTGTGCTTCC

WRAP53-Exon1B-R：AACAGCTATGACCATGTCTTCTGCAGGAAGGCTTGT

WRAP53-Exon1C-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGACCCAGTTTCTCTCTCC

WRAP53-Exon1C-R：AACAGCTATGACCATGCTGGAGAAGTGGGTCTCAGG

WRAP53-Exon2-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGTGGAGTCTGGGGAGATGAA

WRAP53-Exon2-R：AACAGCTATGACCATGGGGCATCCCTCTCCTAGAAA

WRAP53-Exon3-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCAGCCCTAGCCCTACACTTG

WRAP53-Exon3-R：AACAGCTATGACCATGTGCTGCCACAAGAAATTCAC

WRAP53-Exon4-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGAGCTCACCCTTGAACA

WRAP53-Exon4-R：AACAGCTATGACCATGCTGACCAGCCCCTCTGATAA

WRAP53-Exon5-F：TGTAAAACGACGGCCAGTACACCCAGCCTCATTTTTGT

WRAP53-Exon5-R：AACAGCTATGACCATGGGAAGGAAAGGGCTGAAAAC

WRAP53-Exon6-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCATATCTGGGACGCATTCA

WRAP53-Exon6-R：AACAGCTATGACCATGGTACAGAGGACGGCGTGAAC

WRAP53-Exon7A-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCTTGTGACAGACAGCATGG

WRAP53-Exon7A-R：AACAGCTATGACCATGTCTCAGGGTGTGACCCCTAC

WRAP53-Exon7B-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGTATGCCTGGGATGATG

WRAP53-Exon7B-R：AACAGCTATGACCATGATTGGTGGTCACCTCTCGAC

WRAP53-Exon8-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTGAAGGAGTGCCTGGAGAC

WRAP53-Exon8-R：AACAGCTATGACCATGACCCTACAGCTGGGCTCTG

WRAP53-Exon9-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCCTCTGCCAGCAAATCTCTC

WRAP53-Exon9-R：AACAGCTATGACCATGTCTCTGTGGGCTCAGGAAAC

WRAP53-Exon10-F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGGGAGCAAGTGTCCTCA

WRAP53-Exon10-R：AACAGCTATGACCATGGCCTGGTTTCAGGACCAATA

(5)電泳：1.5％瓊脂糖凝膠電泳，110V，25min，凝膠成像系統(tǒng)觀察。

如圖2和圖3所示，即為引物擴(kuò)增后所得產(chǎn)物的電泳圖譜。圖2中1-A為WRAP53-Exon1A-F和WRAP53-Exon1A-R引物擴(kuò)增后的片段Exon1A，1-B為WRAP53-Exon1B-F和WRAP53-Exon1B-R引物擴(kuò)增后的片段Exon1B，1-C為WRAP53-Exon1C-F和WRAP53-Exon1C-R引物擴(kuò)增后的片段Exon1C，2為WRAP53-Exon2-F和WRAP53-Exon2-R引物擴(kuò)增后的片段Exon2，以此類推，圖3中10為WRAP53-Exon10-F和WRAP53-Exon10-R引物擴(kuò)增后的片段Exon10。通過電泳圖的分析表明本發(fā)明所述擴(kuò)增有效，且條帶單一。

(6)Sanger測(cè)序：

取9μl PCR產(chǎn)物與2μl純化體系。按照以下程序進(jìn)行純化：

將1μl純化產(chǎn)物分別與上、下測(cè)序引物按照如下體系進(jìn)行混合：

測(cè)序反應(yīng)程序：

沉淀環(huán)節(jié)：

向完成測(cè)序反應(yīng)的產(chǎn)物中加入2μl 125mmol的EDTA，靜置5min；加入15：l無水乙醇，漩渦混勻；3700rpm離心30min；倒置離心15sec，加入50μl l70％乙醇，漩渦混勻；3700rpm離心15min；倒置離心15sec，置于95℃金屬浴上；加入10μl Hi-Di后進(jìn)行變性試驗(yàn)。變性程序：

變性程序結(jié)束后，上測(cè)序儀(ABI3730)測(cè)序。

(7)結(jié)果判斷：分別將測(cè)序結(jié)果與WRAP53基因參考序列(Genbankaccn：AC_000184.1)進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)實(shí)際突變情況對(duì)結(jié)果進(jìn)行報(bào)告。

實(shí)施例3

為了驗(yàn)證引物和整個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)的可行性，取13例臨床樣本(每對(duì)引物設(shè)兩個(gè)重復(fù)，每組按引物編號(hào)為1-13)按實(shí)施例1和2的試劑和方法提取基因組、配制試劑、擴(kuò)增和測(cè)序。取其中樣本4加入引物擴(kuò)增，電泳結(jié)果如圖2和圖3所示，表明本發(fā)明所述引物對(duì)血液樣本能有效擴(kuò)增，且條帶單一。測(cè)序結(jié)果如下表所示。

圖4顯示是樣本4的WRAP53第2號(hào)外顯子野生型正反測(cè)序截圖，說明測(cè)序結(jié)果峰值清晰無雜峰和重峰等影響結(jié)果的干擾。

從檢測(cè)結(jié)果可以看出，本發(fā)明所述引物已經(jīng)把外顯子序列包括在內(nèi)了，能夠擴(kuò)展出WRAP53基因全部外顯子，并且測(cè)序結(jié)果完全準(zhǔn)確。本發(fā)明所述引物可以準(zhǔn)確的擴(kuò)展出WRAP53基因全外顯子，通過結(jié)果表明本發(fā)明所述引物和方法及試劑盒能夠檢測(cè)出WRAP53基因所有外顯子。

SEQUENCE LISTING

<110> 福州艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司

<120> 檢測(cè)先天性角化不良癥WRAP53基因的方法和引物

<130>

<160> 28

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tgtaaaacga cggccagtgg gaacgggaaa ccttctaa 38

<210> 2

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aacagctatg accatggaca gcagtccgga gctaac 36

<210> 3

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tgtaaaacga cggccagtct aatctccgct gtgcttcc 38

<210> 4

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aacagctatg accatgtctt ctgcaggaag gcttgt 36

<210> 5

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tgtaaaacga cggccagtgg gacccagttt ctctctcc 38

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aacagctatg accatgctgg agaagtgggt ctcagg 36

<210> 7

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tgtaaaacga cggccagtgt ggagtctggg gagatgaa 38

<210> 8

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

aacagctatg accatggggc atccctctcc tagaaa 36

<210> 9

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tgtaaaacga cggccagtca gccctagccc tacacttg 38

<210> 10

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

aacagctatg accatgtgct gccacaagaa attcac 36

<210> 11

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tgtaaaacga cggccagttc tgagctcacc cttgaaca 38

<210> 12

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

aacagctatg accatgctga ccagcccctc tgataa 36

<210> 13

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tgtaaaacga cggccagtac acccagcctc atttttgt 38

<210> 14

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

aacagctatg accatgggaa ggaaagggct gaaaac 36

<210> 15

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

tgtaaaacga cggccagttc atatctggga cgcattca 38

<210> 16

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

aacagctatg accatggtac agaggacggc gtgaac 36

<210> 17

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

tgtaaaacga cggccagtgc ttgtgacaga cagcatgg 38

<210> 18

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

aacagctatg accatgtctc agggtgtgac ccctac 36

<210> 19

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

tgtaaaacga cggccagttc tgtatgcctg ggatgatg 38

<210> 20

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

aacagctatg accatgattg gtggtcacct ctcgac 36

<210> 21

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

tgtaaaacga cggccagtct gaaggagtgc ctggagac 38

<210> 22

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

aacagctatg accatgaccc tacagctggg ctctg 35

<210> 23

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

tgtaaaacga cggccagtcc tctgccagca aatctctc 38

<210> 24

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

aacagctatg accatgtctc tgtgggctca ggaaac 36

<210> 25

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

tgtaaaacga cggccagtag agggagcaag tgtcctca 38

<210> 26

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

aacagctatg accatggcct ggtttcagga ccaata 36

<210> 27

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

tgtaaaacga cggccagt 18

<210> 28

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

aacagctatg accatg 16