本發(fā)明屬于間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)基領(lǐng)域，特別涉及一種大規(guī)模制備人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞因子用誘導(dǎo)分泌培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
間充質(zhì)干細(xì)胞來源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層，屬于多能干細(xì)胞。因其具有多向分化潛能、造血支持和促進(jìn)干細(xì)胞植入、免疫調(diào)控和自我復(fù)制等特點(diǎn)而日益受到人們的關(guān)注。間充質(zhì)干細(xì)胞最早在骨髓中發(fā)現(xiàn)，隨后還發(fā)現(xiàn)存在于人體發(fā)生、發(fā)育過程的許多種組織中。目前,我們能夠從骨髓、脂肪、臍帶、滑膜、骨骼等組織中分離和制備間充質(zhì)干細(xì)胞，其中研究最早的是骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞。但骨髓組織取材不易，難以大規(guī)模生產(chǎn)。當(dāng)前研究表明，臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞不但能夠成為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的理想替代物，而且具有更大的應(yīng)用潛能。
間充質(zhì)干細(xì)胞已用于治療十余種難治性疾病的治療研究，除了用來促進(jìn)恢復(fù)造血，與造血干細(xì)胞共移植提高白血病和難治性貧血等以外，還用于心腦血管疾病，肝硬化、骨和肌肉衰退性疾病、腦和脊髓神經(jīng)損傷、老年癡呆及紅斑狼瘡和硬皮病等自身免疫性疾病的治療研究，已經(jīng)取得的部分臨床試驗(yàn)結(jié)果令人鼓舞。間充質(zhì)干細(xì)胞作用機(jī)理尚不完全明確，一般認(rèn)為主要通過以下機(jī)制：1、旁分泌作用(分泌細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)因子、細(xì)胞生長(zhǎng)因子、抗凋亡因子等)。2、代替或修復(fù)死亡或受損的細(xì)胞。3、細(xì)胞直接接觸，調(diào)控細(xì)胞的功能。當(dāng)前，越來越多的研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞的旁分泌效應(yīng)在其發(fā)揮治療效果中其主要作用。間充質(zhì)干細(xì)胞通過分泌各類細(xì)胞因子對(duì)鄰近細(xì)胞產(chǎn)生作用，從而發(fā)揮其功效。研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞可分泌多種細(xì)胞因子，如VEGF(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子)、bFGF(堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)、NGF(神經(jīng)生長(zhǎng)因子)、HGF(肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子)、IGF-1(胰島素樣生長(zhǎng)因子1)、BDNF(腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子)、GDNF(膠質(zhì)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子)、IL-6(白細(xì)胞介素6)、IL-11(白細(xì)胞介素11)等。間充質(zhì)干細(xì)胞分泌活性因子具有改善炎性環(huán)境、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫狀態(tài)、抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖、促進(jìn)血管再生、促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞遷移和分化、促進(jìn)軸突生長(zhǎng)及突觸連接形成、促進(jìn)髓鞘形成的功能，通過腦白質(zhì)損傷的動(dòng)物模型證實(shí)可以抑制宿主細(xì)胞及移植細(xì)胞凋亡、改善模型鼠的神經(jīng)功能，通過心梗動(dòng)物模型證實(shí)可以促進(jìn)心功能恢復(fù)，通過皮膚損傷實(shí)驗(yàn)證實(shí)可以促進(jìn)傷口愈合。
目前對(duì)干細(xì)胞的研究集中于干細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)分化，對(duì)于利用干細(xì)胞生產(chǎn)分泌因子的研究較少。培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞收集培養(yǎng)液或細(xì)胞裂解液，存在培養(yǎng)規(guī)模較小，誘導(dǎo)細(xì)胞因子分泌過程不夠高效，分離純化過程不具規(guī)模化、分泌的活性因子得不到充分利用問題。CN104099294A公開了一種基于干細(xì)胞分泌生物因子的培養(yǎng)基及其制備和使用方法，收集干細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增過程中更換的廢棄培養(yǎng)液，將其進(jìn)行凍融、低溫分離、超濾和濃縮，得到富含豐富生物活性因子的溶液，按照一定的比例添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對(duì)上述問題，本發(fā)明提出了一種大規(guī)模制備人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞因子用誘導(dǎo)分泌培養(yǎng)基，具體如下：
一種大規(guī)模制備人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞因子用誘導(dǎo)分泌培養(yǎng)基，所述誘導(dǎo)分泌培養(yǎng)基主要由DMEM、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、4-2-羥乙基-1-哌嗪乙磺酸、D-葡萄糖和L-抗壞血酸溶解于磷酸鹽緩沖液而成，DMEM、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、4-2-羥乙基-1-哌嗪乙磺酸、D-葡萄糖和L-抗壞血酸在誘導(dǎo)分泌培養(yǎng)基中的濃度分別為400-600ml/L、1-3mmol/L、10-20μmol/L、10-20g/L、10-100μmol/L。
優(yōu)選的，DMEM、4-2-羥乙基-1-哌嗪乙磺酸、D-葡萄糖和L-抗壞血酸在誘導(dǎo)分泌培養(yǎng)基中的濃度分別為500ml/L、2mmol/L、15μmol/L、15g/L、50μmol/L。
優(yōu)選的，所述誘導(dǎo)分泌培養(yǎng)基還包括誘導(dǎo)增強(qiáng)劑，所述誘導(dǎo)增強(qiáng)劑在誘導(dǎo)分泌培養(yǎng)基中濃度為1-2g/L，所述誘導(dǎo)增強(qiáng)劑包括10-20重量份的三磷酸腺苷、10-20重量份的三磷酸鳥苷、10-50重量份環(huán)磷酸鳥苷和5-20重量份的NaNO3。
進(jìn)一步優(yōu)選的，所述誘導(dǎo)增強(qiáng)劑在誘導(dǎo)分泌培養(yǎng)基中濃度為1.5g/L。
更進(jìn)一步優(yōu)選的，所述誘導(dǎo)增強(qiáng)劑包括15重量份的三磷酸腺苷、15重量份的三磷酸鳥苷、20重量份環(huán)磷酸鳥苷和10重量份的NaNO3。
優(yōu)選的，所述誘導(dǎo)分泌培養(yǎng)基還包括分泌增強(qiáng)劑，所述分泌增強(qiáng)劑在誘導(dǎo)分泌培養(yǎng)基中濃度為0.1-1g/L，所述分泌增強(qiáng)劑包括10-20重量份的甘油、10-20重量份的亞麻酸、10-50重量份二十二碳六烯酸和1-10重量份的脂肪醇聚氧乙烯醚。
更進(jìn)一步優(yōu)選的，所述分泌增強(qiáng)劑在誘導(dǎo)分泌培養(yǎng)基中濃度為0.5g/L。
更進(jìn)一步優(yōu)選的，所述分泌增強(qiáng)劑包括15重量份的甘油、15重量份的亞麻酸、20重量份二十二碳六烯酸和5重量份的脂肪醇聚氧乙烯醚。
本發(fā)明還公開了制備大規(guī)模制備人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞因子用誘導(dǎo)分泌培養(yǎng)基的方法，包括以下步驟：
a取配置培養(yǎng)基目標(biāo)體積四分之一的磷酸鹽緩沖液，充分?jǐn)嚢瑁?/p>
b依次加入DMEM、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、4-2-羥乙基-1-哌嗪乙磺酸、D-葡萄糖和L-抗壞血酸，充分?jǐn)嚢瑁?/p>
c用磷酸鹽緩沖液定容至目標(biāo)體積。
本發(fā)明還公開了另一種大規(guī)模制備人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞因子用誘導(dǎo)分泌培養(yǎng)基的方法，包括以下步驟：
a取配置培養(yǎng)基目標(biāo)體積四分之一的磷酸鹽緩沖液，充分?jǐn)嚢瑁?/p>
b1依次加入DMEM、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、4-2-羥乙基-1-哌嗪乙磺酸、D-葡萄糖和L-抗壞血酸，充分?jǐn)嚢瑁?/p>
b2依次加入三磷酸腺苷、三磷酸鳥苷、環(huán)磷酸鳥苷、NaNO3和甘油，充分?jǐn)嚢瑁?/p>
b3加入脂肪醇聚氧乙烯醚充分?jǐn)嚢?，依次加入亞麻酸和二十二碳六烯酸，充分?jǐn)嚢瑁?/p>
c用磷酸鹽緩沖液定容至目標(biāo)體積。
本發(fā)明中，所述DMEM為高糖型液體培養(yǎng)基，購自Thermo Fisher Scientific，貨號(hào)：11995-065，所述磷酸鹽緩沖液為1倍磷酸鹽緩沖液，pH為7.4。
本發(fā)明的一種實(shí)施方式公開了大規(guī)模制備人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞因子用誘導(dǎo)分泌培養(yǎng)基，適用于大規(guī)模培養(yǎng)的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，可以高效的誘導(dǎo)分泌活性因子；本發(fā)明的一種實(shí)施方式公開了大規(guī)模制備人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞因子用誘導(dǎo)分泌培養(yǎng)基的制備方法。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
大規(guī)模制備人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞因子用誘導(dǎo)分泌培養(yǎng)基，主要由DMEM、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、4-2-羥乙基-1-哌嗪乙磺酸、D-葡萄糖和L-抗壞血酸溶解于磷酸鹽緩沖液而成，DMEM、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、4-2-羥乙基-1-哌嗪乙磺酸、D-葡萄糖和L-抗壞血酸在誘導(dǎo)分泌培養(yǎng)基中的濃度分別為400ml/L、1mmol/L、10μmol/L、10g/L、10μmol/L。
實(shí)施例2
大規(guī)模制備人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞因子用誘導(dǎo)分泌培養(yǎng)基，主要由DMEM、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、4-2-羥乙基-1-哌嗪乙磺酸、D-葡萄糖和L-抗壞血酸溶解于磷酸鹽緩沖液而成，DMEM、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、4-2-羥乙基-1-哌嗪乙磺酸、D-葡萄糖和L-抗壞血酸在誘導(dǎo)分泌培養(yǎng)基中的濃度分別為600ml/L、3mmol/L、20μmol/L、20g/L、100μmol/L。
實(shí)施例3
大規(guī)模制備人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞因子用誘導(dǎo)分泌培養(yǎng)基，主要由DMEM、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、4-2-羥乙基-1-哌嗪乙磺酸、D-葡萄糖和L-抗壞血酸溶解于磷酸鹽緩沖液而成，DMEM、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、4-2-羥乙基-1-哌嗪乙磺酸、D-葡萄糖和L-抗壞血酸在誘導(dǎo)分泌培養(yǎng)基中的濃度分別為500ml/L、2mmol/L、15μmol/L、15g/L、50μmol/L。
實(shí)施例4
與實(shí)施例3的不同之處在于，所述誘導(dǎo)分泌培養(yǎng)基還包括誘導(dǎo)增強(qiáng)劑，所述誘導(dǎo)增強(qiáng)劑在誘導(dǎo)分泌培養(yǎng)基中濃度為1g/L，所述誘導(dǎo)增強(qiáng)劑包括10重量份的三磷酸腺苷、10重量份的三磷酸鳥苷、10重量份環(huán)磷酸鳥苷和5重量份的NaNO3。
實(shí)施例5
與實(shí)施例3的不同之處在于，所述誘導(dǎo)分泌培養(yǎng)基還包括誘導(dǎo)增強(qiáng)劑，所述誘導(dǎo)增強(qiáng)劑在誘導(dǎo)分泌培養(yǎng)基中濃度為2g/L，所述誘導(dǎo)增強(qiáng)劑包括20重量份的三磷酸腺苷、20重量份的三磷酸鳥苷、50重量份環(huán)磷酸鳥苷和20重量份的NaNO3。
實(shí)施例6
與實(shí)施例3的不同之處在于，所述誘導(dǎo)分泌培養(yǎng)基還包括誘導(dǎo)增強(qiáng)劑，所述誘導(dǎo)增強(qiáng)劑在誘導(dǎo)分泌培養(yǎng)基中濃度為1.5g/L，所述誘導(dǎo)增強(qiáng)劑包括15重量份的三磷酸腺苷、15重量份的三磷酸鳥苷、20重量份環(huán)磷酸鳥苷和10重量份的NaNO3。
實(shí)施例7
與實(shí)施例6的不同之處在于，所述誘導(dǎo)分泌培養(yǎng)基還包括分泌增強(qiáng)劑，所述分泌增強(qiáng)劑在誘導(dǎo)分泌培養(yǎng)基中濃度為0.1g/L，所述分泌增強(qiáng)劑包括10重量份的甘油、10重量份的亞麻酸、10重量份二十二碳六烯酸和1重量份的脂肪醇聚氧乙烯醚。
實(shí)施例8
與實(shí)施例6的不同之處在于，所述誘導(dǎo)分泌培養(yǎng)基還包括分泌增強(qiáng)劑，所述分泌增強(qiáng)劑在誘導(dǎo)分泌培養(yǎng)基中濃度為1g/L，所述分泌增強(qiáng)劑包括20重量份的甘油、20重量份的亞麻酸、50重量份二十二碳六烯酸和10重量份的脂肪醇聚氧乙烯醚。
實(shí)施例9
與實(shí)施例6的不同之處在于，所述誘導(dǎo)分泌培養(yǎng)基還包括分泌增強(qiáng)劑，所述分泌增強(qiáng)劑在誘導(dǎo)分泌培養(yǎng)基中濃度為0.5g/L，所述分泌增強(qiáng)劑包括15重量份的甘油、15重量份的亞麻酸、20重量份二十二碳六烯酸和5重量份的脂肪醇聚氧乙烯醚。
實(shí)施例10
制備大規(guī)模制備人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞因子用誘導(dǎo)分泌培養(yǎng)基的方法，包括以下步驟：
a取配置培養(yǎng)基目標(biāo)體積四分之一的磷酸鹽緩沖液，充分?jǐn)嚢瑁?/p>
b依次加入DMEM、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、4-2-羥乙基-1-哌嗪乙磺酸、D-葡萄糖和L-抗壞血酸，充分?jǐn)嚢瑁?/p>
c用磷酸鹽緩沖液定容至目標(biāo)體積。
實(shí)施例11
制備大規(guī)模制備人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞因子用誘導(dǎo)分泌培養(yǎng)基的方法，，包括以下步驟：
a取配置培養(yǎng)基目標(biāo)體積四分之一的磷酸鹽緩沖液，充分?jǐn)嚢瑁?/p>
b1依次加入DMEM、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、4-2-羥乙基-1-哌嗪乙磺酸、D-葡萄糖和L-抗壞血酸，充分?jǐn)嚢瑁?/p>
b2依次加入三磷酸腺苷、三磷酸鳥苷、環(huán)磷酸鳥苷、NaNO3和甘油，充分?jǐn)嚢瑁?/p>
b3加入脂肪醇聚氧乙烯醚充分?jǐn)嚢?，依次加入亞麻酸和二十二碳六烯酸，充分?jǐn)嚢瑁?/p>
c用磷酸鹽緩沖液定容至目標(biāo)體積。
對(duì)照例1
大規(guī)模制備人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞因子用誘導(dǎo)分泌培養(yǎng)基，大規(guī)模制備人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞因子用誘導(dǎo)分泌培養(yǎng)基，主要由DMEM、D-葡萄糖和L-抗壞血酸溶解于磷酸鹽緩沖液而成，DMEM、D-葡萄糖和L-抗壞血酸在誘導(dǎo)分泌培養(yǎng)基中的濃度分別為100ml/L、10g/L、50μmol/L。
對(duì)照例2
大規(guī)模制備人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞因子用誘導(dǎo)分泌培養(yǎng)基，主要由DMEM、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺和D-葡萄糖溶解于磷酸鹽緩沖液而成，DMEM、4-2-羥乙基-1-哌嗪乙磺酸和D-葡萄糖在誘導(dǎo)分泌培養(yǎng)基中的濃度分別為800ml/L、10μmol/L、20g/L。
對(duì)照例3
與實(shí)施例4的不同之處在于，誘導(dǎo)增強(qiáng)劑在誘導(dǎo)分泌培養(yǎng)基中的濃度為1g/L，所述誘導(dǎo)增強(qiáng)劑包括10重量份的三磷酸腺苷、10重量份的三磷酸鳥苷。
對(duì)照例4
與實(shí)施例4的不同之處在于，誘導(dǎo)增強(qiáng)劑在誘導(dǎo)分泌培養(yǎng)基中的濃度為5g/L，所述誘導(dǎo)增強(qiáng)劑包括10重量份環(huán)磷酸鳥苷和5重量份的NaNO3。
對(duì)照例5
與實(shí)施例7的不同之處在于，所述分泌增強(qiáng)劑在誘導(dǎo)分泌培養(yǎng)基中濃度為0.1g/L，所述分泌增強(qiáng)劑包括20重量份的甘油、20重量份的亞麻酸。
對(duì)照例6
與實(shí)施例7的不同之處在于，所述分泌增強(qiáng)劑在誘導(dǎo)分泌培養(yǎng)基中濃度為1g/L，所述分泌增強(qiáng)劑包括50重量份二十二碳六烯酸和10重量份的脂肪醇聚氧乙烯醚。
實(shí)驗(yàn)例誘導(dǎo)分泌培養(yǎng)基對(duì)于人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分泌活性因子的影響
取人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的4代細(xì)胞，消化計(jì)數(shù)后，按2×104/ml密度接種與市售的間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基MSCSFMGIBCOA10332-01，于三氣培養(yǎng)箱37℃、5％CO2、20％O2培養(yǎng)。培養(yǎng)72h，細(xì)胞長(zhǎng)至80％融合，此時(shí)棄掉無血清培養(yǎng)基。按無血清培養(yǎng)基一半體積添加誘導(dǎo)分泌培養(yǎng)基，調(diào)整培養(yǎng)參數(shù)為37℃、5％CO2、5％O2。24h后調(diào)整培養(yǎng)參數(shù)為37℃、5％CO2、20％O2。48h后取出一半誘導(dǎo)分泌培養(yǎng)基用于制備細(xì)胞因子，同時(shí)補(bǔ)加等量誘導(dǎo)分泌培養(yǎng)基放回三氣培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，調(diào)整培養(yǎng)參數(shù)為37℃、5％CO2、5％O2。72h后取出全部誘導(dǎo)分泌培養(yǎng)基，用于制備細(xì)胞因子。通過無菌泵將培養(yǎng)液泵至中空纖維膜微濾過濾器中的0.1μm空纖維微濾膜，循環(huán)過濾，以除去死細(xì)胞及碎片，濾液用無菌泵泵至流超濾膜包(截留分子量5kD)，循環(huán)過濾至原體積1/50。用磷酸鹽緩沖液補(bǔ)至原體積繼續(xù)超濾。循環(huán)過濾至原體積1/50后，用生理鹽水補(bǔ)至原體積繼續(xù)超濾，體積濃縮為原體積1/50后，移至生物安全柜，在生物安全柜中將純化濃縮液收集至合適離心管，稀釋至合適濃度后，取樣，ELISA法測(cè)定VEGF(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子)、BDNF(腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子)、GDNF(膠質(zhì)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子)、bFGF(堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)的濃度，試劑盒購自Thermo Fisher Scientific。
活性因子的濃度為檢測(cè)結(jié)果按照稀釋濃度折算后的濃度。使用的誘導(dǎo)分泌培養(yǎng)基為實(shí)施例1-9和對(duì)照例1-6的培養(yǎng)基，每個(gè)培養(yǎng)基重復(fù)三次，活性因子濃度取平均值。
表1誘導(dǎo)分泌培養(yǎng)基對(duì)于人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分泌活性因子的影響
從表1可以看出，活性因子VEGF(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子)、BDNF(腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子)、GDNF(膠質(zhì)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子)、bFGF(堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)的濃度，實(shí)施例1-3顯著高于(P<0.05)對(duì)照例1-2，說明DMEM、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、4-2-羥乙基-1-哌嗪乙磺酸、D-葡萄糖和L-抗壞血酸合適濃度配置成的培養(yǎng)基在大規(guī)模制備人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞因子中能夠有效誘導(dǎo)分泌生長(zhǎng)因子；實(shí)施例4-6顯著高于(P<0.05)對(duì)照例3-4說明，誘導(dǎo)增強(qiáng)劑三磷酸腺苷、三磷酸鳥苷、環(huán)磷酸鳥苷和NaNO3能夠促進(jìn)誘導(dǎo)分析活性因子；實(shí)施例7-9顯著高于(P<0.05)對(duì)照例5-6說明，分泌增強(qiáng)劑甘油、亞麻酸、二十二碳六烯酸和脂肪醇聚氧乙烯醚能夠進(jìn)一步促進(jìn)誘導(dǎo)分析活性因子。
以上僅為本發(fā)明的實(shí)施例而已。對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，很容易根據(jù)上述披露的精神對(duì)這些實(shí)施例作出多種更改和變化。這些更改和變化均包含在本申請(qǐng)權(quán)利要求書限定的范圍之內(nèi)。