本發(fā)明涉及傳感器敏感元件及其制備方法，具體涉及一種熒光偏振熒光磁性分子印跡傳感器的制備方法。

背景技術(shù)：

生物傳感器由于其高靈敏度和特異性已成為分析化學(xué)和生物化學(xué)領(lǐng)域中一個非常重要的課題。但由于生物分子固有的缺陷（使用環(huán)境要求較高，難以長期保存，且生物分子來源于生物活體，制備和純化繁瑣、昂貴）限制了生物傳感器發(fā)展。獲得廉價、穩(wěn)定的識別元件，是生物傳感器進一步發(fā)展的關(guān)鍵之一。最近二十多年來，一種全新的合成“人工抗體”的方法，即分子印跡技術(shù)得到研究。特別是表面分子印跡技術(shù)的研究，解決了傳統(tǒng)分子印跡技術(shù)中存在的問題，如聚合物的高交聯(lián)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)使模板分子不易洗脫和再結(jié)合，結(jié)合效率低下等問題。表面分子印跡技術(shù)是在載體表面進行分子印跡聚合物，形成二維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使模板分子易于吸附和洗脫，提高聚合物的選擇性和吸附性。同時，將磁性納米材料與表面分子印跡技術(shù)像結(jié)合，制備出磁性表面分子印跡聚合物，期可在外加電場下快速分離，具有主動識別和快速分離的優(yōu)點。而將熒光材料標(biāo)記在磁性表面分子印跡聚合物上，得到的熒光磁性表面分子印跡聚合物使制備的印跡聚合物同時具有了熒光和磁性性質(zhì)，無論模板分子是否具有熒光性質(zhì)，均可采用熒光法檢測。該技術(shù)在簡化操作步驟的同時，擴大檢測范圍，就有很強的應(yīng)用價值。同時，在熒光檢測方法中，熒光偏振是熒光檢測的一個新的熱點，其以物理學(xué)顯現(xiàn)為基礎(chǔ)，用來研究生命中分子之間的相互作用。該方法可最大程度模擬真實生命環(huán)境，實時跟蹤監(jiān)控分子之間的變化。并且具有檢測靈敏的優(yōu)點。目前有研究報道的關(guān)于熒光偏振技術(shù)的檢測限如測定血清中環(huán)孢霉素，最低檢測限可達5μg/L，測定范圍是15-1000μg/L^[199]。Maragos^[200]建立的熒光偏振檢測方法中對馬梭菌毒素的檢出限可低至0.5ng，線性范圍是0.5-20mg/L。中國專利申請201410539526.7公開了一種磁性分子印跡納米顆粒及其制備方法和應(yīng)用。方法步驟如下：1) 在磁性四氧化三鐵納米顆?；虼判驭? 三氧化二鐵納米顆粒表面包覆一層二氧化硅，并使二氧化硅表面帶有氨基。2)在步驟1)得到的磁納米顆粒表面偶聯(lián)偶氮類引發(fā)劑； 3)以步驟2)負(fù)載有引發(fā)劑的磁納米顆粒為引發(fā)劑，在有親水性鏈轉(zhuǎn)移劑存在的條件下，加入蛋白模板分子、功能單體和水溶性交聯(lián)劑，在室溫紫外光照射引發(fā)反應(yīng)，在磁納米顆粒表面原位合成磁性分子印跡聚合物。4）功能單體中加入摩爾(物質(zhì)的量)百分比為1-5％的熒光功能單體進行熒光標(biāo)記。5）檢測時采用熒光顯微鏡進行檢測?？煽吹桨l(fā)明人雖然也制備了熒光磁性分子印跡聚合物，但制備過程中采用的是熒光單體。熒光單體一般難以獲得，且成本很高，因此產(chǎn)物的制備成本高。且在檢測過程中，該發(fā)明采用的檢測方法為熒光顯微鏡，其可以檢測大分子物質(zhì)，但對于小分子物質(zhì)檢測不夠靈敏。

中國專利申請 201410214026.6 公開了一種分離、凈化萊克多巴胺磁性分子印跡聚合物的制備方法，該方法制備磁性四氧化三鐵納米微球，并用ATPS 修 飾四氧化三鐵材料 (ATPS-Fe3O4)。同時制備磁性Fe3O4功能單體，得到Fe3O4@MIPs。該材料只具有磁性，而不具有熒光性質(zhì)。檢測被測物質(zhì)采用的是高效液相色譜測定方法，且檢測最低濃度為20mg/L。該發(fā)明只是簡化了分子印跡聚合物制備的方法，并沒有改善對被測物質(zhì)檢測的靈敏性。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是制備了一種同時具有熒光和磁性的分子印跡聚合物，并采用熒光偏振技術(shù)對該聚合物和被測物質(zhì)進行檢測，得到熒光偏振熒光磁性分子印跡傳感器。該方法克服傳統(tǒng)熒光分子印跡傳感器檢測存在的只能檢測具有熒光性質(zhì)的被測物的問題。同時，該方法簡化制備工藝流程，增加了檢測靈敏性，將檢測限可降低至ng/L。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來解決的：一種熒光偏振熒光磁性分子印跡傳感器的制備方法，包括下述步驟：

步驟一、Fe₃O₄納米顆粒的制備

1.72gFeCl₂?4H₂O和 4.72gFeCl₃?6H₂O和80mL的去離子水加入燒瓶中，連續(xù)通入氮氣并置于DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器并進行劇烈攪拌使其溶解；當(dāng)溫度升高至80℃，將10毫升的氨水溶液慢慢滴入燒瓶中，反應(yīng)30min；在外加磁場作用下將產(chǎn)物分離；用去離子水洗滌6次，以除去未反應(yīng)的物質(zhì)，干燥、保存；

步驟二、Fe₃O₄@SiO₂的制備

300mg的磁納米顆粒、50mL的異丙醇和4mL超純水一起超聲處理15-20mim，后依次加入5mL氨水和2mL 正硅酸四乙酯；室溫下連續(xù)攪拌反應(yīng)12h。在外加磁場下收集產(chǎn)物，并用超純水徹底的洗六次，干燥；

步驟三、熒光Fe₃O₄@SiO₂的制備

將20g Fe₃O₄@SiO₂在甲烷磺酸溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%）中活化。將活化的Fe₃O₄@SiO₂和 30mL乙烯基三乙氧基烷（Triethoxyvinylsilane，TTS）加入400mL（乙醇：水=1:1）混合溶液中， 50℃反應(yīng)24-30h，用乙醇和蒸餾水沖洗，干燥，得TTS-Fe₃O₄@SiO₂；取3gTTS- Fe₃O₄@SiO₂和10g甲基丙烯酸，1g丙烯酰胺以及200mL蒸餾水，0.018g過硫酸胺于200ml圓底燒瓶內(nèi)，70℃反應(yīng)7h，在外加電場下收集產(chǎn)物，并用乙醇和蒸餾水多次沖洗，并干燥；取得到的產(chǎn)物1g與15mg異硫氰酸熒光素，5mL乙醇，100mL蒸餾水混合，振蕩5-6h；在外加磁場下收集產(chǎn)物，水洗，烘干；

步驟四、熒光MIP- Fe₃O₄@SiO₂的制備

將合成熒光Fe₃O₄@SiO₂和4mmol/L模板分子，溶入100mL氯仿溶液中，反應(yīng)前通入氮氣5min，振蕩5-6h，之后加入交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯，在50℃水浴鍋內(nèi)攪拌加熱8h。在外加磁場下收集產(chǎn)物，并洗脫、烘干；

步驟五、非印跡熒光磁性聚合物（NIP- Fe₃O₄@SiO₂）的制備

重復(fù)制備過程除不加入模板分子外，其余步驟與步驟四相同。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點是：

1、 采用普通熒光試劑對分子印跡聚合物進行標(biāo)記，而不是采用熒光單體。這樣降低制備成本，簡化操作步驟；

2、 經(jīng)過本發(fā)明方法制備得到的產(chǎn)物，極大地提高了檢測的靈敏性，其檢測靈敏性高，使檢測限達到ng級，最低檢測限可達5ng/L。在對產(chǎn)物檢測中，采用的是熒光偏振技術(shù)，可實現(xiàn)即時檢測；

3、 經(jīng)過本發(fā)明方法制備得到的產(chǎn)物，識別分辨率高、特異性強、穩(wěn)定性好。傳感器采用熒光標(biāo)記的分子印跡聚合物對目標(biāo)物質(zhì)的特異性識別前后,偏振光的改變來進行物質(zhì)的檢測。制備不同濃度的模板分子溶液，得到最低檢測限和響應(yīng)時間；

4、 適用范圍廣：該分子印跡感器結(jié)合磁微球技術(shù)、光學(xué)技術(shù)、微電子技術(shù)及微機械加工技術(shù)等技術(shù)實現(xiàn)對生物傳感器的開發(fā)，研制的生物傳感器可實現(xiàn)物質(zhì)分子水平的快速、準(zhǔn)確和微量檢測，可對被測物質(zhì)進行準(zhǔn)確、痕量、快速的探測。

附圖說明

圖1為熒光磁性納米表面分子印跡聚合物的制備原理圖；

圖2為Fe₃0₄（a）、Fe₃O₄@SiO₂（b）、熒光MIP- Fe₃O₄@SiO₂（c）的磁性檢測圖；

圖3為磁納米顆粒Fe₃O₄（a）和Fe₃O₄ @SiO₂（b）顆粒紅外光譜圖；

圖4為熒光MIP- Fe₃O₄@SiO₂（a）和Fe₃O₄@SiO₂（b）的熒光顯微鏡的檢測；

圖5為Fe₃O₄、Fe₃O₄@SiO₂與熒光MIP-Fe₃O₄@SiO₂透射電鏡檢測結(jié)果；

圖6為熒光MIP-Fe₃O₄@SiO₂和NIP-Fe₃O₄@SiO₂對棉酚的熒光偏振檢測圖。

具體實施方式：

參見圖1，以下為本發(fā)明熒光磁性納米分子印跡聚合物的設(shè)計原理圖：

首先制備四氧化三鐵磁性納米顆粒，然后在磁性顆粒表面修飾一層二氧化硅，即Fe₃O₄@ SiO₂微球。并以Fe₃O₄@ SiO₂微球為載體，采用“接入法（grafting to）”技術(shù)。該技術(shù)是用偶聯(lián)劑與Fe₃O₄@ SiO₂表面的羥基相互作用，引入高活性基團，即以乙烯基三乙氧基硅烷（TTS）為偶聯(lián)劑通過羥基偶聯(lián)在硅膠表面。再加入功能單體，甲基丙烯酸和丙烯酰胺，形成多聚高分子鏈，并偶合在硅膠表面。加入熒光試劑，并將熒光試劑與丙烯酰胺的酰胺鍵結(jié)合。最后加入模板、交聯(lián)劑，聚合生成分子印跡層。將模板分子洗脫后，得到熒光磁性納米表面分子印跡聚合物。

在以上設(shè)計思路的基礎(chǔ)上，一種熒光偏振熒光磁性分子印跡傳感器的制備方法，具體步驟是：

步驟一、Fe₃O₄納米顆粒的制備

1.72gFeCl₂?4H₂O和 4.72gFeCl₃?6H₂O和80mL的去離子水加入燒瓶中，連續(xù)通入氮氣并置于DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器并進行劇烈攪拌使其溶解；當(dāng)溫度升高至80℃，將10毫升的氨水溶液慢慢滴入燒瓶中，反應(yīng)30min；在外加磁場作用下將產(chǎn)物分離；用去離子水洗滌6次，以除去未反應(yīng)的物質(zhì)，干燥、保存；

步驟二、Fe₃O₄@SiO₂的制備

300mg的磁納米顆粒、50mL的異丙醇和4mL超純水一起超聲處理15-20mim，后依次加入5mL氨水和2mL 正硅酸四乙酯；室溫下連續(xù)攪拌反應(yīng)12h；在外加磁場下收集產(chǎn)物，并用超純水徹底的洗六次，干燥；

步驟三、熒光Fe₃O₄@SiO₂的制備

將20g Fe₃O₄@SiO₂在甲烷磺酸溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%）中活化；將活化的Fe₃O₄@SiO₂和 30mL乙烯基三乙氧基烷（Triethoxyvinylsilane，TTS）加入400mL（乙醇：水=1:1）混合溶液中， 50℃反應(yīng)24-30h，用乙醇和蒸餾水沖洗，干燥，得TTS-Fe₃O₄@SiO₂；取3gTTS- Fe₃O₄@SiO₂和10g甲基丙烯酸，1g丙烯酰胺以及200mL蒸餾水，0.018g過硫酸胺于200ml圓底燒瓶內(nèi)，70℃反應(yīng)7h，在外加電場下收集產(chǎn)物，并用乙醇和蒸餾水多次沖洗,并干燥；取得到的產(chǎn)物1g與15mg異硫氰酸熒光素，5mL乙醇，100mL蒸餾水混合，振蕩5-6h；在外加磁場下收集產(chǎn)物，水洗，烘干；

步驟四、熒光MIP- Fe₃O₄@SiO₂的制備

將合成熒光Fe₃O₄@SiO₂和4mmol/L模板分子，溶入100mL氯仿溶液中，反應(yīng)前通入氮氣5min，振蕩5-6h，之后加入交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯，在50℃水浴鍋內(nèi)攪拌加熱8h；在外加磁場下收集產(chǎn)物，并洗脫、烘干；

步驟五、非印跡熒光磁性聚合物（NIP- Fe₃O₄@SiO₂）的制備

重復(fù)制備過程除不加入模板分子外，其余步驟與步驟四相同。

下面通過實施例對本發(fā)明進行進一步的說明：

實施例1：

一種熒光偏振熒光磁性分子印跡傳感器的制備方法，具體步驟是：

步驟一、Fe₃O₄納米顆粒的制備

1.72gFeCl₂?4H₂O和 4.72gFeCl₃?6H₂O和80mL的去離子水加入燒瓶中，連續(xù)通入氮氣并置于DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器并進行劇烈攪拌使其溶解；當(dāng)溫度升高至80℃，將10毫升的氨水溶液慢慢滴入燒瓶中，反應(yīng)30min；在外加磁場作用下將產(chǎn)物分離；用去離子水洗滌6次，以除去未反應(yīng)的物質(zhì)，干燥、保存；

步驟二、Fe₃O₄@SiO₂的制備

300mg的磁納米顆粒、50mL的異丙醇和4mL超純水一起超聲處理20mim，后依次加入5mL氨水和2mL 正硅酸四乙酯；室溫下連續(xù)攪拌反應(yīng)12h；在外加磁場下收集產(chǎn)物，并用超純水徹底的洗六次，干燥；

步驟三、熒光Fe₃O₄@SiO₂的制備

將20g Fe₃O₄@SiO₂在甲烷磺酸溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%）中活化；將活化的Fe₃O₄@SiO₂和 30mL乙烯基三乙氧基烷（Triethoxyvinylsilane，TTS）加入400mL（乙醇：水=1:1）混合溶液中， 50℃反應(yīng)24h，用乙醇和蒸餾水沖洗，干燥，得TTS-Fe₃O₄@SiO₂；取3gTTS- Fe₃O₄@SiO₂和10g甲基丙烯酸，1g丙烯酰胺以及200mL蒸餾水，0.018g過硫酸胺于200ml圓底燒瓶內(nèi)，70℃反應(yīng)7h，在外加電場下收集產(chǎn)物，并用乙醇和蒸餾水多次沖洗,并干燥；取得到的產(chǎn)物1g與15mg異硫氰酸熒光素，5mL乙醇，100mL蒸餾水混合，振蕩6h；在外加磁場下收集產(chǎn)物，水洗，烘干；

步驟四、熒光MIP- Fe₃O₄@SiO₂的制備

將合成熒光Fe₃O₄@SiO₂和4mmol/L模板分子，溶入100mL氯仿溶液中，反應(yīng)前通入氮氣5min，振蕩6h，之后加入交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯，在50℃水浴鍋內(nèi)攪拌加熱8h；在外加磁場下收集產(chǎn)物，并洗脫、烘干；

步驟五、非印跡熒光磁性聚合物（NIP- Fe₃O₄@SiO₂）的制備

重復(fù)制備過程除不加入模板分子外，其余步驟與步驟四相同。

實施例2：

一種熒光偏振熒光磁性分子印跡傳感器的制備方法，具體步驟是：

步驟一、Fe₃O₄納米顆粒的制備

1.72gFeCl₂?4H₂O和 4.72gFeCl₃?6H₂O和80mL的去離子水加入燒瓶中，連續(xù)通入氮氣并置于DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器并進行劇烈攪拌使其溶解；當(dāng)溫度升高至80℃，將10毫升的氨水溶液慢慢滴入燒瓶中，反應(yīng)30min；在外加磁場作用下將產(chǎn)物分離；用去離子水洗滌6次，以除去未反應(yīng)的物質(zhì)，干燥、保存；

步驟二、Fe₃O₄@SiO₂的制備

300mg的磁納米顆粒、50mL的異丙醇和4mL超純水一起超聲處理15mim，后依次加入5mL氨水和2mL 正硅酸四乙酯；室溫下連續(xù)攪拌反應(yīng)12h；在外加磁場下收集產(chǎn)物，并用超純水徹底的洗六次，干燥；

步驟三、熒光Fe₃O₄@SiO₂的制備

將20g Fe₃O₄@SiO₂在甲烷磺酸溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%）中活化；將活化的Fe₃O₄@SiO₂和 30mL乙烯基三乙氧基烷（Triethoxyvinylsilane，TTS）加入400mL（乙醇：水=1:1）混合溶液中， 50℃反應(yīng)30h，用乙醇和蒸餾水沖洗，干燥，得TTS-Fe₃O₄@SiO₂；取3gTTS- Fe₃O₄@SiO₂和10g甲基丙烯酸，1g丙烯酰胺以及200mL蒸餾水，0.018g過硫酸胺于200ml圓底燒瓶內(nèi)，70℃反應(yīng)7h，在外加電場下收集產(chǎn)物，并用乙醇和蒸餾水多次沖洗,并干燥；取得到的產(chǎn)物1g與15mg異硫氰酸熒光素，5mL乙醇，100mL蒸餾水混合，振蕩5h；在外加磁場下收集產(chǎn)物，水洗，烘干；

步驟四、熒光MIP- Fe₃O₄@SiO₂的制備

將合成熒光Fe₃O₄@SiO₂和4mmol/L模板分子，溶入100mL氯仿溶液中，反應(yīng)前通入氮氣5min，振蕩5h，之后加入交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯，在50℃水浴鍋內(nèi)攪拌加熱8h；在外加磁場下收集產(chǎn)物，并洗脫、烘干；

步驟五、非印跡熒光磁性聚合物（NIP- Fe₃O₄@SiO₂）的制備

重復(fù)制備過程除不加入模板分子外，其余步驟與步驟四相同。

通過上述實施例2制備得到的產(chǎn)物，其檢測如下：

參見圖2：可看到顆粒分散在水中，使水呈黑色渾濁狀態(tài)。用磁鐵對分散在水中的顆粒進行吸附，可以明顯看出水中的顆粒全部被磁鐵吸附至一側(cè)，溶液液重新變澄清。由此可證明所制備的Fe₃0₄、Fe₃O₄@SiO₂、熒光MIP- Fe₃O₄@SiO₂是具有磁性的。

采用紅外光譜、熒光顯微鏡和透射電鏡對制備的熒光磁性納米分子印跡聚合物的結(jié)構(gòu)進行檢測。

參見圖3：可以看到兩處有特征峰，其中561cm-1處的吸收峰是Fe-O的特征振動峰，而1400cm-1表示羥基的振動峰。可知Fe₃O₄磁性納米顆粒的制備無誤。圖3（b）表示Fe₃O₄ @SiO₂，圖中可見1091 cm-1處有吸收峰，為Si-O的特征峰，證明SiO₂成功包覆在Fe₃O₄微粒表面。

參見圖4：圖4（a）為柚皮苷熒光MIP-Fe₃O₄@SiO₂，圖4（b）為Fe₃O₄@SiO₂。比較兩者之間的差別，可以看到在圖4（a）中，硅膠顆粒表面有非常明顯的熒光光圈，而在圖4（b）中根本看不到任何熒光光圈。前后兩者的差別證明了熒光分子成功的修飾在熒光MIP-Fe₃O₄@SiO₂上。

參見圖5：圖5（a）為Fe₃O₄，可以看到圖中磁顆粒大小、形狀、空間分布都較為均勻，且平均顆粒直徑約為70nm。圖5（b）為Fe₃O₄@SiO₂，可看到規(guī)則的圓形顆粒，由于Fe₃O₄被SiO₂包裹，直徑增大為100nm左右。圖5（c）為熒光MIP-Fe₃O₄@SiO₂，很明顯顆粒大小、形狀和分布都不規(guī)則，且顆粒直徑約在100-200nm之間。這是由于Fe₃O₄@SiO₂外部包覆單體、熒光試劑（異硫氰酸熒光劑）、交聯(lián)劑后使熒光MIP-Fe₃O₄@SiO₂直徑變大。

參見圖6：

對熒光偏振法對結(jié)合能力進行檢測時，取等量的熒光MIP-Fe₃O₄@SiO₂ 和NIP- Fe₃O₄@SiO₂，分別加入到不同濃度的被測物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)溶液及去離子水的離心管中，靜置使被測物分子與熒光MIP- Fe₃O₄@SiO₂和NIP- Fe₃O₄@SiO₂相互作用。用移液槍取少許混合溶液，在384孔板上進行點樣，十二份樣品加在384孔板上的位置分別記為A₁，B₁，C₁，D₁，E₁，F(xiàn)₁ 和A2, B2, C2, D2, E2, F2。其中A～E表示的溶液濃度，F(xiàn)為去離子水，即0。A1-F1 表示熒光MIP- Fe₃O₄@SiO₂對被測物質(zhì)的結(jié)合能力，A2-F2表示NIP- Fe₃O₄@SiO₂對被測物質(zhì)的結(jié)合能力。將點樣好的384孔板放入熒光偏振檢測儀中，進行檢測，可得出實驗數(shù)據(jù)。

從圖中可以看到，隨著被測物質(zhì)溶液濃度增加，熒光偏振光值增大。這是由于熒光標(biāo)記的小分子抗原在溶液中旋轉(zhuǎn)速度快 ,熒光偏振光強度小，當(dāng)熒光標(biāo)記的小分子抗原與其相應(yīng)抗體結(jié)合后 ,所形成的大分子在溶液中旋轉(zhuǎn)速度變慢,熒光偏振光強度增大。熒光偏振程度的差異 ,與溶液中熒光MIP-Fe₃O₄@SiO₂和被測物質(zhì)的結(jié)合量有關(guān)。隨著被測物質(zhì)溶液濃度的增加，被測物分子與熒光MIP-Fe₃O₄@SiO₂的結(jié)合量也在增加，故熒光偏振的值也逐漸增大。當(dāng)結(jié)合到達到飽和時，熒光偏振值趨于穩(wěn)定，即當(dāng)濃度達到45ng/L時，熒光MIP- Fe₃O₄＠SiO₂與被測物的結(jié)合趨于飽和（如圖6所示）。而NIP- Fe₃O₄＠SiO₂與被測物分子是通過靜電吸附特相互作用的，無特異性，故熒光偏振值很小，且隨溶液濃度的增大變化不明顯。且可看到熒光偏振的最低檢測限為5ng/L。因此說明熒光偏振方法檢測分子印跡聚合物對被測物質(zhì)的結(jié)合能力更為靈敏。