本發(fā)明涉及藥物的技術(shù)領(lǐng)域，具體說(shuō)是一種抑肽酶的用途及寨卡病毒非結(jié)構(gòu)蛋白酶活性的測(cè)定方法。

背景技術(shù)：

寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)屬黃病毒科(Fla.viviridae)，黃病毒屬(Flavivirus)，呈球形，直徑約為40—70 nm，有包膜。黃熱病病毒屬于黃熱病科黃熱病毒屬的病毒，為RNA病毒，具有嗜內(nèi)臟性及嗜神經(jīng)性，在室溫下容易死基因組為單股正鏈RNA，長(zhǎng)度約為10.8Kb?；蚪M包含一個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF)，編碼一個(gè)多聚蛋白。

寨卡病毒最早于1947年從烏干達(dá)森林中的獼猴身上分離出來(lái)。1952年首次從人體分離出來(lái)。截至上世紀(jì)末，寨卡病毒感染被認(rèn)為僅在赤周圍的非洲、美洲、亞洲和太平洋地區(qū)散發(fā)，被證實(shí)的人類感染病例僅14例。該病毒自2007年開(kāi)始出現(xiàn)暴發(fā)流行。2015年底至2016年初，美洲出現(xiàn)寨卡疫情，并通過(guò)旅游者輸入到其他國(guó)家。截至2016年2月，美洲、非洲、亞洲等地已有超過(guò)30個(gè)國(guó)家出現(xiàn)寨卡病毒傳播。雖然寨卡病毒感染者大部分癥狀較輕微，通常在發(fā)病3—7天后可自行痊愈，但醫(yī)學(xué)界普遍認(rèn)為這種快速傳播的病毒可能與異常增多的新生兒小頭畸形有關(guān)聯(lián)。2016年2月1日，世界衛(wèi)生組織召開(kāi)緊急會(huì)議，宣布寨卡病毒的暴發(fā)和傳播已經(jīng)構(gòu)成全球突發(fā)公共衛(wèi)生事件。之后越來(lái)越多的證據(jù)顯示寨卡病毒感染和胎兒畸形以及神經(jīng)系統(tǒng)疾病之間存在因果關(guān)系。。寨卡病毒表達(dá)的蛋白酶是抗寨卡感染的理想靶標(biāo)。

因此測(cè)出寨卡病毒表達(dá)的蛋白酶的活性并篩選出好的活性抑制劑對(duì)殺死這種病毒的傳播起著至關(guān)重要的作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種抑肽酶的用途及寨卡病毒非結(jié)構(gòu)蛋白酶活性的測(cè)定方法。

本發(fā)明為解決公知技術(shù)中存在的技術(shù)問(wèn)題所采取的技術(shù)方案是:

本發(fā)明的抑肽酶用于寨卡病毒非結(jié)構(gòu)蛋白酶活性抑制劑的用途。

本發(fā)明還可以采用以下技術(shù)措施：

抑肽酶即為Aprotinin，針對(duì)寨卡病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白酶為NS2B-NS3。

本發(fā)明的寨卡病毒非結(jié)構(gòu)蛋白酶活性的測(cè)定方法，包括以下步驟：

A、將含有全基因合成的寨卡病毒蛋白酶基因的載體pMV轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂在LB平板上培養(yǎng)過(guò)夜，LB培養(yǎng)基中含100mg/L氨芐青霉素；

B、從平板上挑取多個(gè)單克隆，分別接種于裝有5mL的LB培養(yǎng)基的試管培養(yǎng)過(guò)夜，LB培養(yǎng)基中含100mg/L氨芐青霉素，然后用質(zhì)粒小提試劑盒提取含有寨卡病毒蛋白酶基因片段的pMV載體，并將含有目的基因的pMV載體和目標(biāo)載體pET-duet-1雙酶切用瓊脂糖凝膠回收，之后將酶切回收的基因片段和目標(biāo)載體片段按照摩爾比5:1至10:1的比率混合在16℃下連接10到18h；

C、將構(gòu)建好的片段轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂在LB平板上培養(yǎng)過(guò)夜，LB培養(yǎng)基中含100mg/L氨芐青霉素,將篩選得到的陽(yáng)性克隆，分別接種于裝有5mL的LB培養(yǎng)基的試管培養(yǎng)過(guò)夜，LB培養(yǎng)基中含100mg/L氨芐青霉素，然后用質(zhì)粒小提試劑盒提取構(gòu)建好的質(zhì)粒，用于鑒定和測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示可用；

D、將得到的含有編碼寨卡病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白酶基因的pET-duet-1載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，并用LB平板篩選陽(yáng)性克?。?/p>

E、將D中所述的LB平板上挑取陽(yáng)性克隆，培養(yǎng)過(guò)夜，然后轉(zhuǎn)入0.8L的LB培養(yǎng)基，LB培養(yǎng)基中含100mg/L氨芐青霉素和氯霉素，當(dāng)OD₆₀₀達(dá)到0.6-0.8時(shí)，加入IPTG并于16℃培養(yǎng)16-18個(gè)小時(shí)；

F、以5000 rpm離心15 min收集細(xì)胞，然后高壓破菌5-6次；破菌液12000rpm離心30min后收集上清液；

G、將上清液加入懸菌溶液預(yù)平衡的鎳柱中，該懸菌溶液為20mM Tris，PH 8.5， 300mM Nacl，20mM咪唑，掛柱1個(gè)小時(shí)；

H、用破菌緩沖液清洗雜蛋白，該破菌緩沖液為20mM Tris，PH8.5，300mM Nacl，20mM咪唑，然后用洗脫緩沖液將目的蛋白洗下來(lái)，至G250檢測(cè)不變藍(lán)，洗脫緩沖液為20mM Tris，PH8.5，300mM Nacl，500mM咪唑；

I、將步驟H得到的寨卡病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白酶再用HiTrap Q 陰離子交換層析和superdex75 10/300 凝膠過(guò)濾層析進(jìn)行純化，得到寨卡病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白酶部分；

J、寨卡病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白酶的活性測(cè)定采用純度大于95%的熒光底物AC-LKRR-AMC作為底物；熒光強(qiáng)度測(cè)定的儀器為Fluoraskan Ascent酶標(biāo)儀,激發(fā)光和發(fā)射光的波長(zhǎng)分別為355nm和460nm；蛋白濃度為100nM,熒光底物選用多個(gè)濃度，分別進(jìn)行測(cè)定；蛋白緩沖液組分為10 mM Tris,20%體積百分?jǐn)?shù)的甘油，PH=9.0,1 mM CHAPS；

K、分別獨(dú)立進(jìn)行多組測(cè)定，得到非結(jié)構(gòu)蛋白酶在達(dá)到最大反應(yīng)速度一半時(shí)的底物濃度Km和酶的最大反應(yīng)速度Vmax；

L、選取最優(yōu)熒光底物濃度，選擇不同濃度的抑肽酶Aprotinin分別進(jìn)行測(cè)定；

M、分別獨(dú)立進(jìn)行多組測(cè)定，將不同濃度下的反應(yīng)數(shù)據(jù)進(jìn)行IC₅₀的擬合，根據(jù)Ki=IC₅₀/(1+[S]/Km)計(jì)算出Ki。

步驟J中熒光底物的濃度分別選擇150μM 、100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.125μM。

步驟L中，熒光底物的最優(yōu)濃度為100μM，抑制劑濃度梯度為25μM、20μM、15μM 、10μM、5μM 、2.5μM 、1.25μM 、0.625μM 、0.3125μM。

利用底物AC-LKRR-AMC測(cè)得的蛋白酶活性的Km=85.32±2.11μM ，Kcat=1149.19±69.0710^-3 s^-1, Kcat/Km=13469M^-1S^-1；利用Aprotinin測(cè)得動(dòng)力學(xué)抑制常數(shù)Ki=0.361±0.019 μM。

采用GraphPad Prism軟件處理數(shù)據(jù)；不同底物濃度時(shí)的反應(yīng)數(shù)據(jù)使用 “nonlinear fit”-“straight line”來(lái)確定其擬合度，據(jù)此選擇前300s的反應(yīng)數(shù)據(jù)計(jì)算其初始線性反應(yīng)速率；不同底物濃度下的初始線性反應(yīng)速率中使用“nonlinear fit”“Michaelis–Menten”計(jì)算Km 與Vmax；將各底物濃度下的反應(yīng)數(shù)據(jù)使用程序中“nonlinear fit”-“l(fā)og(inhibitor) vs.response-Variable slope”來(lái)進(jìn)行IC₅₀的擬合。

本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是:

本發(fā)明的抑肽酶能夠寨卡病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白酶的活性抑制劑，通過(guò)使用Aprotinin作為抑制劑的寨卡病毒非結(jié)構(gòu)蛋白酶活性的測(cè)定方法，通過(guò)優(yōu)選抑制劑的濃度，能夠?yàn)榭拐ú《镜母腥菊覝?zhǔn)方向，進(jìn)而推動(dòng)寨卡病毒的針對(duì)性藥物研發(fā)進(jìn)程。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明的寨卡病毒非結(jié)構(gòu)蛋白酶活性抑制劑的測(cè)定方法過(guò)程中的Km熒光圖；

圖2是本發(fā)明的寨卡病毒非結(jié)構(gòu)蛋白酶活性抑制劑的測(cè)定方法中的Aprotinin的IC₅₀示意圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明的抑肽酶用于寨卡病毒非結(jié)構(gòu)蛋白酶活性抑制劑的用途。

抑肽酶即為Aprotinin，針對(duì)寨卡病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白酶為NS2B-NS3。

A、將含有全基因合成的寨卡病毒蛋白酶基因的載體pMV轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂在LB平板上培養(yǎng)過(guò)夜，LB培養(yǎng)基中含100mg/L氨芐青霉素；

B、從平板上挑取多個(gè)單克隆，分別接種于裝有5mL的LB培養(yǎng)基的試管培養(yǎng)過(guò)夜，LB培養(yǎng)基中含100mg/L氨芐青霉素，然后用質(zhì)粒小提試劑盒提取含有寨卡病毒蛋白酶基因片段的pMV載體，并將含有目的基因的pMV載體和目標(biāo)載體pET-duet-1雙酶切用瓊脂糖凝膠回收，之后將酶切回收的基因片段和目標(biāo)載體片段按照摩爾比5:1至10:1的比率混合在16℃下連接10到18h；

C、將構(gòu)建好的片段轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂在LB平板上培養(yǎng)過(guò)夜，LB培養(yǎng)基中含100mg/L氨芐青霉素,將篩選得到的陽(yáng)性克隆，分別接種于裝有5mL的LB培養(yǎng)基的試管培養(yǎng)過(guò)夜，LB培養(yǎng)基中含100mg/L氨芐青霉素，然后用質(zhì)粒小提試劑盒提取構(gòu)建好的質(zhì)粒，用于鑒定和測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示可用；

D、將得到的含有編碼寨卡病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白酶基因的pET-duet-1載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，并用LB平板篩選陽(yáng)性克?。?/p>

E、將D中所述的LB平板上挑取陽(yáng)性克隆，培養(yǎng)過(guò)夜，然后轉(zhuǎn)入0.8L的LB培養(yǎng)基，LB培養(yǎng)基中含100mg/L氨芐青霉素和氯霉素，當(dāng)OD₆₀₀達(dá)到0.6-0.8時(shí)，加入IPTG并于16℃培養(yǎng)16-18個(gè)小時(shí)；

F、以5000 rpm離心15 min收集細(xì)胞，然后高壓破菌5-6次；破菌液12000rpm離心30min后收集上清液；

G、將上清液加入懸菌溶液預(yù)平衡的鎳柱中，該懸菌溶液為20mM Tris，PH 8.5， 300mM Nacl，20mM咪唑，掛柱1個(gè)小時(shí)；

H、用破菌緩沖液清洗雜蛋白，該破菌緩沖液為20mM Tris，PH8.5，300mM Nacl，20mM咪唑，然后用洗脫緩沖液將目的蛋白洗下來(lái)，至G250檢測(cè)不變藍(lán)，洗脫緩沖液為20mM Tris，PH8.5，300mM Nacl，500mM咪唑；

I、將步驟H得到的寨卡病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白酶再用HiTrap Q 陰離子交換層析和superdex75 10/300 凝膠過(guò)濾層析進(jìn)行純化，得到寨卡病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白酶部分；

J、寨卡病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白酶的活性測(cè)定采用純度大于95%的熒光底物AC-LKRR-AMC作為底物；熒光強(qiáng)度測(cè)定的儀器為Fluoraskan Ascent酶標(biāo)儀,激發(fā)光和發(fā)射光的波長(zhǎng)分別為355nm和460nm；蛋白濃度為100nM,熒光底物選用多個(gè)濃度，分別進(jìn)行測(cè)定；蛋白緩沖液組分為10 mM Tris,20%體積百分?jǐn)?shù)的甘油，PH=9.0,1 mM CHAPS；

K、分別獨(dú)立進(jìn)行多組測(cè)定，得到非結(jié)構(gòu)蛋白酶在達(dá)到最大反應(yīng)速度一半時(shí)的底物濃度Km和酶的最大反應(yīng)速度Vmax；

L、選取最優(yōu)熒光底物濃度，選擇不同濃度的抑肽酶Aprotinin分別進(jìn)行測(cè)定；

M、分別獨(dú)立進(jìn)行多組測(cè)定，將不同濃度下的反應(yīng)數(shù)據(jù)進(jìn)行IC₅₀的擬合，根據(jù)Ki=IC₅₀/(1+[S]/Km)計(jì)算出Ki。

實(shí)施例一：

本發(fā)明的寨卡病毒非結(jié)構(gòu)蛋白酶活性的測(cè)定方法，包括以下步驟：

A、將含有全基因合成的寨卡病毒蛋白酶基因的載體pMV轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂在LB平板上培養(yǎng)過(guò)夜，LB培養(yǎng)基中含100mg/L氨芐青霉素；

B、從平板上挑取多個(gè)單克隆，分別接種于裝有5mL的LB培養(yǎng)基的試管培養(yǎng)過(guò)夜，LB培養(yǎng)基中含100mg/L氨芐青霉素，然后用質(zhì)粒小提試劑盒提取含有寨卡病毒蛋白酶基因片段的pMV載體，并將含有目的基因的pMV載體和目標(biāo)載體pET-duet-1雙酶切用瓊脂糖凝膠回收，之后將酶切回收的基因片段和目標(biāo)載體片段按照摩爾比5:1的比率混合在16℃下連接10；

C、將構(gòu)建好的片段轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂在LB平板上培養(yǎng)過(guò)夜，LB培養(yǎng)基中含100mg/L氨芐青霉素,將篩選得到的陽(yáng)性克隆，分別接種于裝有5mL的LB培養(yǎng)基的試管培養(yǎng)過(guò)夜，LB培養(yǎng)基中含100mg/L氨芐青霉素，然后用質(zhì)粒小提試劑盒提取構(gòu)建好的質(zhì)粒，用于鑒定和測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示可用；

D、將得到的含有編碼寨卡病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白酶基因的pET-duet-1載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，并用LB平板篩選陽(yáng)性克??；

E、將D中所述的LB平板上挑取陽(yáng)性克隆，培養(yǎng)過(guò)夜，然后轉(zhuǎn)入0.8L的LB培養(yǎng)基，LB培養(yǎng)基中含100mg/L氨芐青霉素和氯霉素，當(dāng)OD₆₀₀達(dá)到0.6時(shí)，加入IPTG并于16℃培養(yǎng)16個(gè)小時(shí)；

F、以5000 rpm離心15 min收集細(xì)胞，然后高壓破菌5次；破菌液12000rpm離心30min后收集上清液；

G、將上清液加入懸菌溶液預(yù)平衡的鎳柱中，該懸菌溶液為20mM Tris，PH 8.5， 300mM Nacl，20mM咪唑，掛柱1個(gè)小時(shí)；

H、用破菌緩沖液清洗雜蛋白，該破菌緩沖液為20mM Tris，PH8.5，300mM Nacl，20mM咪唑，然后用洗脫緩沖液將目的蛋白洗下來(lái)，至G250檢測(cè)不變藍(lán)，洗脫緩沖液為20mM Tris，PH8.5，300mM Nacl，500mM咪唑；

I、將步驟H得到的寨卡病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白酶再用HiTrap Q 陰離子交換層析和superdex75 10/300 凝膠過(guò)濾層析進(jìn)行純化，得到寨卡病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白酶部分；

J、寨卡病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白酶的活性測(cè)定采用純度大于95%的熒光底物AC-LKRR-AMC作為底物；熒光強(qiáng)度測(cè)定的儀器為Fluoraskan Ascent酶標(biāo)儀,激發(fā)光和發(fā)射光的波長(zhǎng)分別為355nm和460nm；蛋白濃度為100nM,熒光底物選用多個(gè)濃度，分別進(jìn)行測(cè)定；蛋白緩沖液組分為10 mM Tris,20%體積百分?jǐn)?shù)的甘油，PH=9.0,1 mM CHAPS；

K、分別獨(dú)立進(jìn)行多組測(cè)定，得到非結(jié)構(gòu)蛋白酶在達(dá)到最大反應(yīng)速度一半時(shí)的底物濃度Km和酶的最大反應(yīng)速度Vmax；

L、選取最優(yōu)熒光底物濃度，選擇不同濃度的抑肽酶Aprotinin分別進(jìn)行測(cè)定；

M、分別獨(dú)立進(jìn)行多組測(cè)定，將不同濃度下的反應(yīng)數(shù)據(jù)進(jìn)行IC₅₀的擬合，根據(jù)Ki=IC₅₀/(1+[S]/Km)計(jì)算出Ki。

實(shí)施例二：

本發(fā)明的寨卡病毒非結(jié)構(gòu)蛋白酶活性的測(cè)定方法，包括以下步驟：

A、將含有全基因合成的寨卡病毒蛋白酶基因的載體pMV轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂在LB平板上培養(yǎng)過(guò)夜，LB培養(yǎng)基中含100mg/L氨芐青霉素；

B、從平板上挑取多個(gè)單克隆，分別接種于裝有5mL的LB培養(yǎng)基的試管培養(yǎng)過(guò)夜，LB培養(yǎng)基中含100mg/L氨芐青霉素，然后用質(zhì)粒小提試劑盒提取含有寨卡病毒蛋白酶基因片段的pMV載體，并將含有目的基因的pMV載體和目標(biāo)載體pET-duet-1雙酶切用瓊脂糖凝膠回收，之后將酶切回收的基因片段和目標(biāo)載體片段按照摩爾比10:1的比率混合在16℃下連接18h；

C、將構(gòu)建好的片段轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂在LB平板上培養(yǎng)過(guò)夜，LB培養(yǎng)基中含100mg/L氨芐青霉素,將篩選得到的陽(yáng)性克隆，分別接種于裝有5mL的LB培養(yǎng)基的試管培養(yǎng)過(guò)夜，LB培養(yǎng)基中含100mg/L氨芐青霉素，然后用質(zhì)粒小提試劑盒提取構(gòu)建好的質(zhì)粒，用于鑒定和測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示可用；

D、將得到的含有編碼寨卡病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白酶基因的pET-duet-1載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，并用LB平板篩選陽(yáng)性克??；

E、將D中所述的LB平板上挑取陽(yáng)性克隆，培養(yǎng)過(guò)夜，然后轉(zhuǎn)入0.8L的LB培養(yǎng)基，LB培養(yǎng)基中含100mg/L氨芐青霉素和氯霉素，當(dāng)OD₆₀₀達(dá)到0.8時(shí)，加入IPTG并于16℃培養(yǎng)18個(gè)小時(shí)；

F、以5000 rpm離心15 min收集細(xì)胞，然后高壓破菌6次；破菌液12000rpm離心30min后收集上清液；

G、將上清液加入懸菌溶液預(yù)平衡的鎳柱中，該懸菌溶液為20mM Tris，PH 8.5， 300mM Nacl，20mM咪唑，掛柱1個(gè)小時(shí)；

H、用破菌緩沖液清洗雜蛋白，該破菌緩沖液為20mM Tris，PH8.5，300mM Nacl，20mM咪唑，然后用洗脫緩沖液將目的蛋白洗下來(lái)，至G250檢測(cè)不變藍(lán)，洗脫緩沖液為20mM Tris，PH8.5，300mM Nacl，500mM咪唑；

I、將步驟H得到的寨卡病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白酶再用HiTrap Q 陰離子交換層析和superdex75 10/300 凝膠過(guò)濾層析進(jìn)行純化，得到寨卡病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白酶部分；

J、寨卡病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白酶的活性測(cè)定采用純度大于95%的熒光底物AC-LKRR-AMC作為底物；熒光強(qiáng)度測(cè)定的儀器為Fluoraskan Ascent酶標(biāo)儀,激發(fā)光和發(fā)射光的波長(zhǎng)分別為355nm和460nm；蛋白濃度為100nM,熒光底物選用多個(gè)濃度，分別進(jìn)行測(cè)定；蛋白緩沖液組分為10 mM Tris,20%體積百分?jǐn)?shù)的甘油，PH=9.0,1 mM CHAPS；

K、分別獨(dú)立進(jìn)行多組測(cè)定，得到非結(jié)構(gòu)蛋白酶在達(dá)到最大反應(yīng)速度一半時(shí)的底物濃度Km和酶的最大反應(yīng)速度Vmax；

L、選取最優(yōu)熒光底物濃度，選擇不同濃度的抑肽酶Aprotinin分別進(jìn)行測(cè)定；

M、分別獨(dú)立進(jìn)行多組測(cè)定，將不同濃度下的反應(yīng)數(shù)據(jù)進(jìn)行IC₅₀的擬合，根據(jù)Ki=IC₅₀/(1+[S]/Km)計(jì)算出Ki。

實(shí)施例三：

本發(fā)明的寨卡病毒非結(jié)構(gòu)蛋白酶活性的測(cè)定方法，包括以下步驟：

A、將含有全基因合成的寨卡病毒蛋白酶基因的載體pMV轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂在LB平板上培養(yǎng)過(guò)夜，LB培養(yǎng)基中含100mg/L氨芐青霉素；

B、從平板上挑取多個(gè)單克隆，分別接種于裝有5mL的LB培養(yǎng)基的試管培養(yǎng)過(guò)夜，LB培養(yǎng)基中含100mg/L氨芐青霉素，然后用質(zhì)粒小提試劑盒提取含有寨卡病毒蛋白酶基因片段的pMV載體，并將含有目的基因的pMV載體和目標(biāo)載體pET-duet-1雙酶切用瓊脂糖凝膠回收，之后將酶切回收的基因片段和目標(biāo)載體片段按照摩爾比8:1的比率混合在16℃下連接15h；

C、將構(gòu)建好的片段轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂在LB平板上培養(yǎng)過(guò)夜，LB培養(yǎng)基中含100mg/L氨芐青霉素,將篩選得到的陽(yáng)性克隆，分別接種于裝有5mL的LB培養(yǎng)基的試管培養(yǎng)過(guò)夜，LB培養(yǎng)基中含100mg/L氨芐青霉素，然后用質(zhì)粒小提試劑盒提取構(gòu)建好的質(zhì)粒，用于鑒定和測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示可用；

D、將得到的含有編碼寨卡病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白酶基因的pET-duet-1載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，并用LB平板篩選陽(yáng)性克??；

E、將D中所述的LB平板上挑取陽(yáng)性克隆，培養(yǎng)過(guò)夜，然后轉(zhuǎn)入0.8L的LB培養(yǎng)基，LB培養(yǎng)基中含100mg/L氨芐青霉素和氯霉素，當(dāng)OD₆₀₀達(dá)到0.7時(shí)，加入IPTG并于16℃培養(yǎng)17個(gè)小時(shí)；

F、以5000 rpm離心15 min收集細(xì)胞，然后高壓破菌6次；破菌液12000rpm離心30min后收集上清液；

G、將上清液加入懸菌溶液預(yù)平衡的鎳柱中，該懸菌溶液為20mM Tris，PH 8.5， 300mM Nacl，20mM咪唑，掛柱1個(gè)小時(shí)；

H、用破菌緩沖液清洗雜蛋白，該破菌緩沖液為20mM Tris，PH8.5，300mM Nacl，20mM咪唑，然后用洗脫緩沖液將目的蛋白洗下來(lái)，至G250檢測(cè)不變藍(lán)，洗脫緩沖液為20mM Tris，PH8.5，300mM Nacl，500mM咪唑；

I、將步驟H得到的寨卡病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白酶再用HiTrap Q 陰離子交換層析和superdex75 10/300 凝膠過(guò)濾層析進(jìn)行純化，得到寨卡病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白酶部分；

J、寨卡病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白酶的活性測(cè)定采用純度大于95%的熒光底物AC-LKRR-AMC作為底物；熒光強(qiáng)度測(cè)定的儀器為Fluoraskan Ascent酶標(biāo)儀,激發(fā)光和發(fā)射光的波長(zhǎng)分別為355nm和460nm；蛋白濃度為100nM,熒光底物選用多個(gè)濃度，分別進(jìn)行測(cè)定；蛋白緩沖液組分為10 mM Tris,20%體積百分?jǐn)?shù)的甘油，PH=9.0,1 mM CHAPS；

K、分別獨(dú)立進(jìn)行多組測(cè)定，得到非結(jié)構(gòu)蛋白酶在達(dá)到最大反應(yīng)速度一半時(shí)的底物濃度Km和酶的最大反應(yīng)速度Vmax；

L、選取最優(yōu)熒光底物濃度，選擇不同濃度的抑肽酶Aprotinin分別進(jìn)行測(cè)定；

M、分別獨(dú)立進(jìn)行多組測(cè)定，將不同濃度下的反應(yīng)數(shù)據(jù)進(jìn)行IC₅₀的擬合，根據(jù)Ki=IC₅₀/(1+[S]/Km)計(jì)算出Ki。

上述各實(shí)施例中的步驟J中熒光底物的濃度分別選擇150μM 、100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.125μM。

步驟L中，熒光底物的最優(yōu)濃度為100μM，抑制劑濃度梯度為25μM、20μM、15μM 、10μM、5μM 、2.5μM 、1.25μM 、0.625μM 、0.3125μM。

利用底物AC-LKRR-AMC測(cè)得的蛋白酶活性的Km=85.32±2.11μM ，Kcat=1149.19±69.0710^-3 s^-1, Kcat/Km=13469M^-1S^-1；利用Aprotinin測(cè)得動(dòng)力學(xué)抑制常數(shù)Ki=0.361±0.019 μM。[1]

采用GraphPad Prism軟件處理數(shù)據(jù)；不同底物濃度時(shí)的反應(yīng)數(shù)據(jù)使用 “nonlinear fit”-“straight line”來(lái)確定其擬合度，據(jù)此選擇前300s的反應(yīng)數(shù)據(jù)計(jì)算其初始線性反應(yīng)速率；不同底物濃度下的初始線性反應(yīng)速率中使用“nonlinear fit”“Michaelis–Menten”計(jì)算Km 與Vmax，結(jié)果如圖1所示；將各底物濃度下的反應(yīng)數(shù)據(jù)使用程序中“nonlinear fit”-“l(fā)og(inhibitor) vs.response-Variable slope”來(lái)進(jìn)行IC₅₀的擬合，結(jié)果如圖2所示，可以得出抑肽酶Aprotinin對(duì)寨卡病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白酶中的NS2B-NS3具有明顯的抑制作用。

熒光底物AC-LKRR-AMC為上海吉爾生化有限公司的產(chǎn)品。

Fluoraskan Ascent熒光儀為美國(guó)Thermo Scientific的產(chǎn)品。

抑肽酶Aprotinin為Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品。

目標(biāo)載體pET-duet-1為Novagene公司產(chǎn)品。

應(yīng)當(dāng)注意，本發(fā)明中所涉及的各種實(shí)驗(yàn)操作，均為本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，如果在文中沒(méi)有特別說(shuō)明，則本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以參照本發(fā)明申請(qǐng)日之前的各種常用工具書(shū)、科技文獻(xiàn)或相關(guān)的說(shuō)明書(shū)、手冊(cè)等加以實(shí)施。

本文中所涉及的各種實(shí)驗(yàn)用品（包括但不限于：化學(xué)試劑、生物制品、細(xì)胞、生物體、儀器等）之中，對(duì)于那些特殊的或者不宜獲得的，文中均已注明了制造商、參考文獻(xiàn)或詳細(xì)的制備方法；未經(jīng)特別說(shuō)明的，均為常規(guī)實(shí)驗(yàn)用品，在本發(fā)明申請(qǐng)日之前，可以通過(guò)各種方式（例如購(gòu)買、自行制備等）很方便地獲得。在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以在形式和細(xì)節(jié)上對(duì)其做出各種改變和改進(jìn)，而這些均被認(rèn)為落入了本發(fā)明的保護(hù)范圍。