本發(fā)明屬于微生物基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種帕克特酰胺的生物合成基因簇及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

近年來(lái)蓬勃發(fā)展起來(lái)的合成生物學(xué)技術(shù)，為激活深海微生物蘊(yùn)藏的沉默生物合成基因簇、發(fā)現(xiàn)新型抗腫瘤先導(dǎo)化合物帶來(lái)了新的機(jī)遇。在闡明自然界的生物合成途徑、理解組合生物合成機(jī)理的基礎(chǔ)上，采用組合生物合成技術(shù)對(duì)抗生素的生物合成基因進(jìn)行體內(nèi)敲除和重組等操作，不但能夠生產(chǎn)“非天然”的天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，而且還可以提高天然產(chǎn)物的產(chǎn)量，或定向積累所需要的天然產(chǎn)物，為天然產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)和藥物開(kāi)發(fā)提供化合物結(jié)構(gòu)和生物活性多樣化。

迄今為止，有關(guān)帕克特酰胺的生物合成基因簇、環(huán)化酶等生物催化制備帕克特酰胺及啟動(dòng)子工程獲得抗腫瘤帕克特酰胺及其類(lèi)似物等國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種來(lái)自深海微生物中的帕克特酰胺的生物合成基因簇。

本發(fā)明，對(duì)鏈霉菌(Streptomyces pactum)SCSIO 02999全基因組序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，獲取帕克特酰胺的生物合成基因簇。運(yùn)用啟動(dòng)子工程及異源表達(dá)等合成生物學(xué)技術(shù)，成功激活了沉默的帕克特酰胺的生物合成基因簇，獲取了6個(gè)新的帕克特酰胺類(lèi)化合物，為抗腫瘤藥物篩選提供化合物實(shí)體。

本發(fā)明的帕克特酰胺的生物合成基因簇來(lái)源于南海沉積物鏈霉菌(Streptomyces pactum)SCSIO 02999，其特征在于，該生物合成基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第14290-29055位的堿基序列所示，包括5個(gè)基因，具體為：

(1)負(fù)責(zé)帕克特酰胺的聚酮-鳥(niǎo)氨酸-聚酮骨架合成的基因，即ptmA，位于核苷酸序列SEQ ID NO.1第15332-24676個(gè)堿基處，長(zhǎng)度為9345個(gè)堿基對(duì)，編碼雜合的聚酮/非核糖體聚肽合成酶，3114個(gè)氨基酸；

(2)負(fù)責(zé)帕克特酰胺骨架合成修飾的另一個(gè)基因，即ptmB1，位于核苷酸序列SEQ ID NO.1第24663-26348個(gè)堿基處，長(zhǎng)度為1686個(gè)堿基對(duì)，編碼FAD依賴的氧化還原酶，561個(gè)氨基酸；

(3)負(fù)責(zé)帕克特酰胺骨架合成修飾的基因ptmB2，位于核苷酸序列SEQ ID NO.1第26360-28003個(gè)堿基處，長(zhǎng)度為1644個(gè)堿基對(duì)，編碼八氫番茄紅素脫氫酶，547個(gè)氨基酸；

(4)負(fù)責(zé)帕克特酰胺骨架環(huán)化的基因ptmC，位于核苷酸序列SEQ ID NO.1第28000-29055個(gè)堿基處，長(zhǎng)度1056個(gè)堿基對(duì)，編碼環(huán)化酶，351個(gè)氨基酸；

(5)負(fù)責(zé)帕克特酰胺羥基化修飾的基因ptmD，位于核苷酸序列SEQ ID NO.1第14290-15195個(gè)堿基處，長(zhǎng)度為906堿基對(duì)，編碼羥化酶，301個(gè)氨基酸。

SEQ ID NO.1所示序列的第14290-29055個(gè)堿基序列的互補(bǔ)序列可根據(jù)DNA堿基互補(bǔ)原則隨時(shí)得到，且SEQ ID NO.1第14290-29055個(gè)堿基序列或部分核苷酸序列可以通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或用合適的限制性內(nèi)切酶酶切相應(yīng)DNA或DNA重組技術(shù)獲得。本發(fā)明提供了構(gòu)建至少包含部分SEQ ID NO.1所示序列的第14290-29055位中DNA片段的重組DNA載體途徑。

本發(fā)明還提供了創(chuàng)制帕克特酰胺生物合成基因被阻斷或異源表達(dá)等其他基因改造的途徑，至少其中之一的基因包含SEQ ID NO.1所示序列的第14290-29055位中DNA片段。

本發(fā)明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列，可使用PCR探針?lè)ɑ騍outhern雜交等技術(shù)，從其他生物體重篩選獲得帕克特酰胺的生物合成基因簇同源基因。

本發(fā)明提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列，可用于鏈霉菌(Streptomyces pactum)SCSIO 02999基因組文庫(kù)中定位更多的文庫(kù)質(zhì)粒。這些文庫(kù)質(zhì)粒至少包括本發(fā)明中的部分序列，也包含鏈霉菌(Streptomyces pactum)SCSIO 02999基因組中鄰近區(qū)域未克隆DNA。

包含本發(fā)明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的DNA片段，可以被體內(nèi)外突變等修飾，包括插入、置換、缺失、易錯(cuò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、位點(diǎn)特異性突變、不同序列重組、定向進(jìn)化等。

包含本發(fā)明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列的克隆，可以通過(guò)合適表達(dá)系統(tǒng)在外源宿主中表達(dá)生產(chǎn)相應(yīng)酶或者提高生物活性化合物產(chǎn)量。這些外源宿主包括大腸桿菌、鏈霉菌、假單胞菌、芽孢桿菌、酵母及動(dòng)植物等。

本發(fā)明提供的氨基酸序列可以用于分離所需蛋白并可用于抗體制備。

包含本發(fā)明所提供的氨基酸序列或者部分序列的多肽，可能在去除或者替代某些氨基酸之后仍有生物活性甚至新的生物活性，或提高了產(chǎn)量或優(yōu)化了蛋白動(dòng)力學(xué)特征或其他致力于得到的性質(zhì)。

包含本發(fā)明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列的基因或基因簇可以在異源宿主中表達(dá)及揭示它們?cè)谒拗鞔x中的功能。

包含本發(fā)明所提供核苷酸序列或部分核苷酸序列的基因或基因簇可以通過(guò)DNA重組技術(shù)構(gòu)建重組載體，以獲得新型生物合成途徑，也可以通過(guò)插入、置換、缺失或失活，進(jìn)而獲得其他基于生物合成途徑的新結(jié)構(gòu)化合物。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供帕克特酰胺的生物合成基因簇在制備帕克特酰胺或其類(lèi)似物中的應(yīng)用，特別是在制備pactamide A-F任一化合物中的應(yīng)用，

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種環(huán)化酶基因ptmC，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第28000-29055位的堿基序列所示。

本發(fā)明還提供一種由上述環(huán)化酶基因ptmC編碼的環(huán)化酶PtmC。環(huán)化酶PtmC能以NADPH為輔因子催化pactamide C形成pactamide A。因此，本發(fā)明還提供環(huán)化酶PtmC在催化化合物pactamide C形成化合物pactamide A中的應(yīng)用，

本發(fā)明還提供帕克特酰胺的生物合成基因簇的啟動(dòng)子工程突變及其與環(huán)化酶基因ptmC缺失突變、氧化還原酶基因ptmB1缺失突變或八氫番茄紅素脫氫酶基因ptmB2缺失突變的基因工程菌；所述的氧化還原酶基因ptmB1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第24663-26348位的堿基序列所示；所述的八氫番茄紅素脫氫酶基因ptmB2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第26360-28003位的堿基序列所示。

本發(fā)明還提供所述的基因工程菌在制備帕克特酰胺或其類(lèi)似物中的應(yīng)用。

優(yōu)選，所述的帕克特酰胺的生物合成基因簇的啟動(dòng)子工程突變的基因工程菌是Streptomyces pactum SCSIO 02999PTMp1。

總之，本發(fā)明所提供的包括帕克特酰胺生物合成相關(guān)的所有基因和蛋白信息，幫助人們理解多環(huán)tetramate大環(huán)內(nèi)酰胺家族天然產(chǎn)物的還原型環(huán)化等關(guān)鍵機(jī)制，為進(jìn)一步遺傳改造提供材料和理論基礎(chǔ)。本發(fā)明所提供的基因和蛋白質(zhì)可以用來(lái)尋找和發(fā)現(xiàn)可用于醫(yī)藥、衛(wèi)生或農(nóng)業(yè)的多環(huán)tetramate大環(huán)內(nèi)酰胺家族、基因或蛋白。

本發(fā)明人通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明新分離鑒定的化合物pactamide A–F對(duì)人癌細(xì)胞包括乳腺癌MCF-7、人肝癌HepG2、人肺癌H460和人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞SF-268有細(xì)胞毒活性(表8)，其中pactamide A對(duì)人癌細(xì)胞包括乳腺癌MCF-7、人肺癌H460細(xì)胞、人肝癌HepG2和人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞SF-268的IC₅₀分別是0.26μM、0.24μM、0.37μM和0.51μM。

因此，本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供新的化合物pactamide A、B、C、D、E和F，

本發(fā)明還提供化合物pactamide A、B、C、D、E或F在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

所述的抗腫瘤藥物優(yōu)選為抗乳腺癌、人肺癌、人肝癌或人神經(jīng)膠質(zhì)瘤的藥物。

本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供一種抗腫瘤藥物，其特征在于，包含有效量的pactamide A、B、C、D、E或F作為活性成份。

所述的抗腫瘤藥物優(yōu)選為抗乳腺癌、人肺癌、人肝癌或人神經(jīng)膠質(zhì)瘤的藥物。

本發(fā)明從鏈霉菌(Streptomyces pactum)SCSIO 02999分離得到6個(gè)新的具有抗腫瘤活性的大環(huán)內(nèi)酰胺類(lèi)生物堿，其能用于制備抗腫瘤藥物，通過(guò)生物工程或化學(xué)修飾可望開(kāi)發(fā)成為抗腫瘤新藥。

本發(fā)明中的帕克特酰胺生產(chǎn)菌株鏈霉菌(Streptomyces pactum)SCSIO 02999于2012年9月8日保藏于中國(guó)廣東省廣州市中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所中國(guó)科學(xué)院海洋微生物研究中心(RNAM Center for Marine Microbiology，CAS)，保藏編號(hào)為SCSIO 02999。該保藏中心的菌株是對(duì)外銷(xiāo)售的，因此本領(lǐng)域技術(shù)人員可以自2012年9月8日之后從該保藏中心購(gòu)買(mǎi)到該菌株。

本發(fā)明的鏈霉菌(Streptomyces pactum)SCSIO 02999還于2012年9月8日公開(kāi)于非專(zhuān)利文獻(xiàn)中(網(wǎng)頁(yè))，其網(wǎng)址為：http://www.scsio.ac.cn/xwzx/tpxw/201209/t20120908_3640561.html(以名稱“鏈霉菌Streptomyces sp.SCSIO 02999”公開(kāi))，該菌種申請(qǐng)人本人也持有，并保證自申請(qǐng)日起20年內(nèi)向公眾提供。

附圖說(shuō)明

圖1是代表性PTM類(lèi)化合物及帕克特酰胺化合物pactamide A-F的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

圖2是Streptomyces pactum SCSIO 02999中帕克特酰胺的生物合成基因簇及其功能分析；其中，A是Streptomyces pactum SCSIO 02999中帕克特酰胺的生物合成基因簇結(jié)構(gòu)示意圖；B是不同菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基中的丁酮粗提物的HPLC分析圖：(i)：xiaP基因同框缺失的S.pactum SCSIO 02999XM47i，(ii)：ptmA基因位點(diǎn)前原位激活的突變株S.pactum SCSIO 02999PTMp1，(iii)：TK64/pCSG2801，(iv)：TK64/pSET152，(v)：TK64/pCSG2804，(vi)TK64/pCSG2805，(vii)TK64/pCSG2809，(viii)TK64/pCSG2811，(ix)TK64/pCSG2814，“#”代表尚未鑒定的PTM類(lèi)化合物，圖中阿拉伯?dāng)?shù)字表示帕克特酰胺化合物，其中11-16依次分別代表圖1中的式11-16表示的化合物即pactamide A-F；C是酶PtmA、PtmB1、PtmB2、PtmC和PtmD參與合成帕克特酰胺的功能推測(cè)分析。

圖3是在ptmA基因前靶向插入ermE*p啟動(dòng)子的方案設(shè)計(jì)；其中，A是引物設(shè)計(jì)用于ptmA基因前插入ermE*p啟動(dòng)子；B是激活帕克特酰胺的生物合成基因簇可用于模式變鉛青鏈霉菌TK64異源表達(dá)的粘粒pCSG2804構(gòu)建流程圖；C是引物擴(kuò)增aadA、ermE*p啟動(dòng)子、aadA-ermE*P DNA片段產(chǎn)物的PCR電泳圖；D是驗(yàn)證成功將aadA-ermE*P DNA片段在ptmA基因前靶向插入的PCR電泳圖。

圖4是同框缺失ptmC基因及在ptmA基因前靶向插入ermE*p啟動(dòng)子的方案設(shè)計(jì)；其中，A是完成帕克特酰胺合成基因簇的啟動(dòng)子工程改造及ptmC的同框缺失的粘粒pCSG2809構(gòu)建流程圖；B是驗(yàn)證成功將ptmC的同框缺失并將aadA-ermE*P DNA片段在ptmA基因前靶向插入成功構(gòu)建粘粒pCSG2809的PCR電泳圖。

圖5是重組蛋白PtmC的表達(dá)純化SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果，其中，M為蛋白maker，PtmC為環(huán)化酶PtmC。

圖6是pactamide C(化合物13)在酶PtmC催化下生成pactamide A(化合物11)的HPLC分析圖；(i)反應(yīng)體系：化合物13，PtmC及NADPH；(ii)反應(yīng)體系：化合物13，PtmC及NADH；(iii)化合物11標(biāo)準(zhǔn)品；(iv)對(duì)照體系：化合物13，熱失活PtmC，NADPH；(V)對(duì)照體系：化合物13，PtmC，缺失NADPH。

圖7是pactamide A(化合物11)的高分辨電噴霧電離質(zhì)譜。

圖8是pactamide A(化合物11)的氫譜，溶劑CDCl₃/CD₃OD(9:1)。

圖9是pactamide A(化合物11)的碳譜，溶劑CDCl₃/CD₃OD(9:1)。

圖10是pactamide A(化合物11)的HSQC譜，溶劑CDCl₃/CD₃OD(9:1)。

圖11是pactamide A(化合物11)的HMBC譜，溶劑CDCl₃/CD₃OD(9:1)。

圖12是pactamide A(化合物11)的COSY譜，溶劑CDCl₃/CD₃OD(9:1)。

圖13是pactamide A(化合物11)的NOESY譜，溶劑CDCl₃/CD₃OD(9:1)。

圖14是pactamide A(化合物11)的NOESY譜，溶劑CDCl₃/CD₃OD(9:1)。

圖15是pactamide A-E譜圖比較；A是pactamide A-E關(guān)鍵NOESY相關(guān)；B是pactamide A、B、D、E的ECD譜；C是lysobacteramide B和HSAF的ECD譜。

圖16是pactamide B(化合物12)的高分辨電噴霧電離質(zhì)譜。

圖17是pactamide B(化合物12)的DMSO-d₆氫譜。

圖18是pactamide B(化合物12)的DMSO-d₆碳譜。

圖19是pactamide B(化合物12)的DMSO-d₆HSQC譜。

圖20是pactamide B(化合物12)的DMSO-d₆HMBC譜。

圖21是pactamide B(化合物12)的DMSO-d₆COSY譜。

圖22是pactamide B(化合物12)的DMSO-d₆NOESY譜。

圖23是pactamide C(化合物13)的高分辨電噴霧電離質(zhì)譜。

圖24是pactamide C(化合物13)的DMSO-d₆氫譜。

圖25是pactamide C(化合物13)的DMSO-d₆碳譜。

圖26是pactamide C(化合物13)的DMSO-d₆HSQC譜。

圖27是pactamide C(化合物13)的DMSO-d₆HMBC譜。

圖28是pactamide C(化合物13)的DMSO-d₆COSY譜。

圖29是pactamide C(化合物13)的DMSO-d₆NOESY譜。

圖30是pactamide C(化合物13)的DMSO-d₆NOESY譜。

圖31是pactamide D(化合物14)的高分辨電噴霧電離質(zhì)譜。

圖32是pactamide D(化合物14)的DMSO-d₆氫譜。

圖33是pactamide D(化合物14)的DMSO-d₆碳譜。

圖34是pactamide D(化合物14)的DMSO-d₆HSQC譜。

圖35是pactamide D(化合物14)的DMSO-d₆HMBC譜。

圖36是pactamide D(化合物14)的DMSO-d₆COSY譜。

圖37是pactamide D(化合物14)的DMSO-d₆NOESY譜。

圖38是pactamide E(化合物15)的高分辨電噴霧電離質(zhì)譜。

圖39是pactamide E(化合物15)的DMSO-d₆氫譜。

圖40是pactamide E(化合物15)的DMSO-d₆碳譜。

圖41是pactamide E(化合物15)的DMSO-d₆COSY譜。

圖42是pactamide E(化合物15)的DMSO-d₆HSQC譜。

圖43是pactamide E(化合物15)的DMSO-d₆HMBC譜。

圖44是pactamide E(化合物15)的DMSO-d₆NOESY譜。

圖45是pactamide F(化合物16)的高分辨電噴霧電離質(zhì)譜。

圖46是pactamide F(化合物16)的DMSO-d₆氫譜。

圖47是pactamide F(化合物16)的DMSO-d₆碳譜。

圖48是pactamide F(化合物16)的DMSO-d₆HSQC譜。

圖49是pactamide F(化合物16)的DMSO-d₆HMBC譜。

圖50是pactamide F(化合物16)的DMSO-d₆COSY譜。

圖51是pactamide F(化合物16)的DMSO-d₆NOESY譜。

具體實(shí)施方式

以下是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。

1.克隆分析帕克特酰胺的生物合成基因簇

帕克特酰胺(圖1)屬于多環(huán)tetramate大環(huán)內(nèi)酰胺家族(PTM)天然產(chǎn)物，由雜合的聚酮/非核糖體聚肽合成酶催化產(chǎn)生。對(duì)鏈霉菌(Streptomyces pactum)SCSIO 02999全基因組序列分析，發(fā)現(xiàn)存在PTM生物合成基因簇。對(duì)鏈霉菌(Streptomyces pactum)SCSIO 02999基因組文庫(kù)約2000個(gè)克隆進(jìn)行PCR篩選，獲得含有完整PTM生物合成基因簇陽(yáng)性克隆pCSG2404。

2.帕克特酰胺的生物合成基因簇中各基因體內(nèi)功能分析

本發(fā)明對(duì)帕克特酰胺的生物合成機(jī)制進(jìn)行了研究。對(duì)陽(yáng)性克隆pCSG2404的測(cè)序結(jié)果，運(yùn)用生物信息學(xué)分析，顯示其包含18個(gè)ORF，預(yù)測(cè)ptmA、ptmB1、ptmB2、ptmC和ptmD共5個(gè)基因負(fù)責(zé)帕克特酰胺的生物合成及后修飾(表1和圖2A)。

表1帕克特酰胺的生物合成基因簇的基因及其功能

a氨基酸數(shù)目；b括號(hào)內(nèi)包含同源蛋白GenBank登錄號(hào)；c一致性/相似性(identity/similarity)。

3.帕克特酰胺生物合成基因簇的啟動(dòng)子工程改造：

野生型鏈霉菌(Streptomyces pactum)SCSIO 02999中的xiaP基因是負(fù)責(zé)廈霉素(xiamycin)骨架生物合成的關(guān)鍵基因，通過(guò)PCR targeting策略(Gust B,et al.2003,Proc.Natl.Acad.Sci.100:1541–1546.)，將該基因同框缺失后，獲取的突變株S.pactum SCSIO 02999XM47i喪失了生產(chǎn)廈霉素的能力。野生型鏈霉菌(Streptomyces pactum)SCSIO 02999及突變株S.pactum SCSIO 02999XM47i(表3)的傳統(tǒng)發(fā)酵培養(yǎng)均未檢測(cè)到帕克特酰胺類(lèi)化合物的產(chǎn)生(圖2B)。推測(cè)鏈霉菌(Streptomyces pactum)SCSIO 02999存在的帕克特酰胺生物合成簇處于沉默狀態(tài)，本發(fā)明對(duì)帕克特酰胺生物合成簇進(jìn)行了啟動(dòng)子工程改造，從而原位激活帕克特酰胺生物合成基因簇或異源表達(dá)帕克特酰胺生物合成基因簇。

以pPWW50載體為模板，PCR擴(kuò)增獲得0.3kb ermE*p啟動(dòng)子(所用引物為：ermE-p1-F/ermE-p1-R，見(jiàn)表2)；以pIJ778為模板，擴(kuò)增獲得1.4kb壯觀霉素抗性基因aadA(所用引物為：p1-aadA-F/p-aadA-R，見(jiàn)表2)；使用橋式PCR技術(shù)連接，構(gòu)建成為1.7kb的aadA-ermE*P DNA片段。根據(jù)PCR targeting策略，1.7kb的aadA-ermE*P DNA片段通過(guò)同源重組(所用引物為：p1-aadA-F/ermE-p1-R，見(jiàn)表2、圖3B、C)，插入至pCSG2404的ptmA基因前(用引物ermE-p1-det F/ermE-p1-det R驗(yàn)證，見(jiàn)表2、圖3B、D)，構(gòu)建獲得重組粘粒pCSG2802。DNA片段aac(3)IV-oriT-IntφC31來(lái)自于質(zhì)粒pSET152A’B(Zhang,Y et al.2013.Org.Lett.15,3254-3257)，用于與變鉛青鏈霉菌Streptomyces lividans TK64接合轉(zhuǎn)移。將質(zhì)粒pSET152A’B使用BamHI/EcoRI雙酶切，獲取的DNA片段aac(3)IV-oriT-IntφC31進(jìn)一步通過(guò)PCR targeting技術(shù)，替換pCSG2802的卡那霉素抗性基因，構(gòu)建獲得粘粒pCSG2804(圖3B)。pCSG2804中ptmA基因前，通過(guò)PCR-targeting技術(shù)，插入了強(qiáng)啟動(dòng)子ermE*p，此外卡那霉素抗性基因被aac(3)IV-oriT-IntφC31替代，從而可在TK64中異源整合(圖3)。粘粒pCSG2805的構(gòu)建策略與pCSG2804類(lèi)似，1.7kb的aadA-ermE*P DNA片段通過(guò)同源重組(所用引物為：p2-aadA-F/ermE-p2-R，見(jiàn)表2)，插入至pCSG2404的ptmD基因前(用引物ermE-p2-det F/ermE-p2-det R驗(yàn)證，見(jiàn)表2)，構(gòu)建獲得重組粘粒pCSG2803；進(jìn)一步pCSG2803卡那霉素抗性基因被aac(3)IV-oriT-IntφC31替代，從而獲得的粘粒pCSG2805可在TK64中異源整合。

4.ptm基因的同框缺失

如圖4A所示，pCSG2801未經(jīng)啟動(dòng)子改造，僅使用PCR-targeting技術(shù)，使用DNA片段aac(3)IV-oriT-IntφC31置換pCSG2404的卡那霉素抗性基因，從而可在TK64中異源整合。

如圖4A所示，粘粒pCSG2801的ptmC基因，通過(guò)PCR-targeting技術(shù)，被來(lái)自于質(zhì)粒pIJ778的aadA(壯觀霉素抗性基因)+oriT部分置換(所用引物為：ptmC-dis-F/ptmC-dis-R，見(jiàn)表2)，獲得粘粒pCSG2806。對(duì)粘粒pCSG2806，進(jìn)行42℃誘導(dǎo)FLP重組酶表達(dá)，移除aadA+oriT盒，完成ptmC同框刪除(用引物ptmC-det F/ptmC-det R驗(yàn)證，見(jiàn)表2、圖4B)，獲得粘粒pCSG2808。

根據(jù)PCR targeting策略，通過(guò)同源重組，將1.7kb的aadA-ermE*P DNA片段整合至pCSG2808的ptmA基因前(用引物ermE-p1-det F/ermE-p1-det R驗(yàn)證，見(jiàn)表2、圖4B)，完成帕克特酰胺合成基因簇的啟動(dòng)子工程改造及ptmC的同框缺失，構(gòu)建獲得重組粘粒pCSG2809(圖4)。

粘粒pCSG2811和pCSG2814，分別通過(guò)與pCSG2809的構(gòu)建策略類(lèi)似，分別實(shí)現(xiàn)了ptmB1或ptmB2的同框刪除及帕克特酰胺合成基因簇的啟動(dòng)子工程改造。

5.啟動(dòng)子工程改造的帕克特酰胺生物合成基因簇原位激活或異源表達(dá)

使用鏈霉菌(Streptomyces pactum)SCSIO 02999的遺傳操作系統(tǒng)，對(duì)帕克特酰胺生物合成基因簇進(jìn)行原位激活，構(gòu)建啟動(dòng)子工程突變株S.pactum SCSIO 02999PTMp1(在S.pactum SCSIO 02999XM47i基因工程突變株的ptmA基因前插入強(qiáng)啟動(dòng)子ermE*p而構(gòu)建得到的，表2-3，所用引物和方法與構(gòu)建pCSG2802中強(qiáng)啟動(dòng)子ermE*p插入ptmA基因前的相同)。

對(duì)S.pactum SCSIO 02999PTMp1進(jìn)行發(fā)酵及HPLC分析，可以生產(chǎn)pactamide A-F(圖2B)。

粘粒pCSG2801、pCSG2804、pCSG2805、pCSG2809、pCSG2811、pCSG2814及對(duì)照空載體pSET152，分別通過(guò)接合轉(zhuǎn)移，導(dǎo)入異源表達(dá)宿主變鉛青鏈霉菌TK64(圖2B)。

如圖2B所示，pCSG2801的變鉛青鏈霉菌TK64轉(zhuǎn)化子，帕克特酰胺生物合成基因簇未激活，未檢測(cè)到多環(huán)tetramate大環(huán)內(nèi)酰胺家族天然產(chǎn)物。pCSG2804的變鉛青鏈霉菌TK64轉(zhuǎn)化子，成功表達(dá)pactamide A-E。pCSG2809(ΔptmC)的變鉛青鏈霉菌TK64轉(zhuǎn)化子，主產(chǎn)物為pactamide C(化合物13)。pCSG2811(ΔptmB1)的變鉛青鏈霉菌TK64轉(zhuǎn)化子，主產(chǎn)物為pactamide E(化合物15)。pCSG2814(ΔptmB2)的變鉛青鏈霉菌TK64轉(zhuǎn)化子，主產(chǎn)物為化合物10。

對(duì)突變株進(jìn)行發(fā)酵及代謝產(chǎn)物HPLC分析，進(jìn)一步推測(cè)ptmA、ptmB1、ptmB2、ptmC和ptmD等5個(gè)基因負(fù)責(zé)帕克特酰胺的生物合成(圖2C)。

表2本發(fā)明中使用的引物

表3本發(fā)明中使用的菌株和質(zhì)粒

6.帕克特酰胺生物合成基因簇原位激活突變株S.pactum SCSIO 02999PTMp1的培養(yǎng)發(fā)酵及

帕克特酰胺化合物的分離

S.pactum SCSIO 02999PTMp1的產(chǎn)孢培養(yǎng)基使用添加3％海鹽的38#培養(yǎng)基。S.pactum SCSIO 02999PTMp1單菌落接種于50ml的添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)3％海鹽的R5培養(yǎng)基(R5培養(yǎng)基含有：蔗糖103g/L、硫酸鉀0.25g/L、氯化鎂10.12g/L、葡萄糖10g/L、酪蛋白水解物0.1g/L、酵母粉5.0g/L、磷酸氫二鉀0.5g/L、微量元素0.1mL/L，pH 7.2-7.4)，200rpm，28℃培養(yǎng)5-7天。按照1:10的比例進(jìn)行種子轉(zhuǎn)接，20℃培養(yǎng)7天，1L的搖瓶中裝有200ml培養(yǎng)基，共發(fā)酵20L培養(yǎng)基。S.pactum SCSIO 02999PTMp1的20L發(fā)酵液使用等體積丁酮萃取3遍，旋轉(zhuǎn)蒸干，獲得7g粗提物。將粗提物溶解于體積比1:1的氯仿甲醇后，與適量的硅膠混合拌樣，使用正相硅膠柱層析(快速硅膠柱14.5×2.5cm,40g)，采用氯仿/甲醇混合溶液，按照體積比100/0、95/5、90/10和80/20，分別進(jìn)行梯度洗脫，獲得4個(gè)組分(Fr1-Fr4)。(上樣量)500mg的Fr2組分(氯仿/甲醇95/5v/v洗脫的餾分)，使用葡聚糖凝膠LH-20(柱子參數(shù)120×3.5cm i.d.)，體積比5:5的氯仿/甲醇進(jìn)行洗脫，洗脫1000ml，獲得組分Fr2B-Fr2D。合并第200-300ml洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸干獲得Fr2B(100mg)，該組分使用配置C-18反相柱(250×10.0mm i.d.,5μm)的制備型高效液相色譜(乙腈：水20:80，流速2.5ml/min)，進(jìn)一步分離純化，收集保留時(shí)間為第12分鐘的流份，旋轉(zhuǎn)蒸干制備獲得pactamide B(26mg)；收集保留時(shí)間第15分鐘的流份，旋轉(zhuǎn)蒸干制備獲得pactamide E(2.5mg)。將第300-400ml洗脫液合并，旋轉(zhuǎn)蒸干獲得組分Fr2C(200mg)，使用配置C-18反相柱(250×10.0mm i.d.,5μm)的制備型高效液相色譜(乙腈：水60:40，流速2.5ml/min)，進(jìn)一步分離純化，收集保留時(shí)間第14分鐘的流份，旋轉(zhuǎn)蒸干制備獲得pactamide D(3.2mg)；收集保留時(shí)間為第23分鐘的流份，旋轉(zhuǎn)蒸干制備獲得pactamide A(30mg)。將第400-500ml洗脫液合并，旋轉(zhuǎn)蒸干獲得Fr2D組分，通過(guò)制備型高效液相色譜(250×10.0mm i.d.,5μm；乙腈：水50:50，流速2.5ml/min)，收集保留時(shí)間17分鐘的流份，旋轉(zhuǎn)蒸干，純化獲得pactamide F(4.7mg)。

7.帕克特酰胺生物合成基因簇的異源表達(dá)突變株發(fā)酵及帕克特酰胺化合物的分離

粘粒pCSG2801、pCSG2804、pCSG2805、pCSG2809、pCSG2811、pCSG2814、對(duì)照空載體pSET152的變鉛青鏈霉菌TK64轉(zhuǎn)化子使用50ml的R5培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)5-7天。pCSG2809的變鉛青鏈霉菌TK64轉(zhuǎn)化子，使用R5培養(yǎng)基發(fā)酵10L，丁酮萃取3次，獲得4.7g粗提物。將粗提物溶解于體積比1:1的氯仿甲醇后，與適量的硅膠混合拌樣，使用正相硅膠柱層析(快速硅膠柱14.5×2.5cm,40g)，采用氯仿/甲醇混合溶劑，梯度洗脫(100:0-0:100，v/v)，獲得4個(gè)組分(Fr1-Fr4)。收集氯仿/甲醇為95:5時(shí)洗脫的流份為Fr2。165mg(上樣量)的Fr2組分，使用葡聚糖凝膠LH-20(柱子參數(shù)120×3.5cm i.d.)，體積比5:5氯仿/甲醇進(jìn)行洗脫，洗脫1000ml，分別獲得組分Fr2B-Fr2D。將第200-300ml洗脫液合并，旋轉(zhuǎn)蒸干獲得Fr2B(65mg)。Fr2B組分，進(jìn)一步使用C-18反相硅膠柱(250×10.0mm i.d.,5μm)的制備型高效液相色譜(乙腈：水60:40，流速2.5ml/min)，收集保留時(shí)間第18min的流份，純化獲得化合物pactamide C(25mg)。

8.化合物結(jié)構(gòu)鑒定：

帕克特酰胺A(pactamide A)結(jié)構(gòu)解析(表4-5，圖7-14，15)：

根據(jù)HRESIMS將pactamide A的分子式確定為C₂₉H₄₀N₂O₄(m/z 481.3098[M+H]⁺,calcd 481.3066)。pactamide A的核磁數(shù)據(jù)與lysobacteramide B的核磁數(shù)據(jù)很相似，不同的地方是pactamide A在C-14位缺少OH，在N-22位缺少甲基。pactamide A的相對(duì)構(gòu)型由偶合常數(shù)(ZΔ^2,3J_2,3 11.5Hz；EΔ^17,18J_17,18 15.0Hz)和NOESY相關(guān)來(lái)歸屬。根據(jù)NOESY相關(guān)，H-5/H-11/H-13歸屬為同一側(cè)，H-6/H-8/H-10/H-12/H-16/H3-31歸屬為另一側(cè)。通過(guò)比較pactamide A與lysobacteramide B的CD譜，將pactamide A的絕對(duì)構(gòu)型確定為5R，6S，8S，10S，11R，12R，13S，16R，23S。

帕克特酰胺B(pactamide B)結(jié)構(gòu)解析(表4-5，圖15，16-22)：

根據(jù)HRESIMS(m/z 493.2707[M+H]⁺,calcd 493.2708)將pactamide B的分子式確定為C₂₉H₃₈N₂O₅。pactamide B的NMR譜與pactamide A的相似，比較發(fā)現(xiàn)pactamide B缺少一個(gè)雙峰的甲基，¹H NMR中多了一對(duì)互相偶合的亞甲基氫，推測(cè)甲基被取代。從H₃-30到δ_C136.6的HMBC相關(guān)及增加的兩個(gè)sp²雜化的季碳說(shuō)明C10/C11間的單鍵變?yōu)殡p鍵。從δ_H(3.05,4.05)到C-10/C-11/C-12的HMBC確定了CH₃-31被取代，結(jié)合分子式及亞甲基的化學(xué)位移推斷被OH取代。pactamide B的相對(duì)構(gòu)型由偶合常數(shù)(ZΔ^2,3J_2,3 11.5Hz；EΔ¹⁷,¹⁸J_17,1815.5Hz)和NOESY相關(guān)來(lái)歸屬。根據(jù)NOESY相關(guān)，H-5/H-13歸屬為同一側(cè)，H-6/H-8/H-12/H-16歸屬為另一側(cè)。通過(guò)比較pactamide B與lysobacteramide B的CD譜，將pactamide B的絕對(duì)構(gòu)型確定為5R，6S，8R，12S，13S，16R，23S。

帕克特酰胺C(pactamide C)結(jié)構(gòu)解析(表4-5，圖15，23-30)：

根據(jù)HRESIMS(m/z 479.2901[M+H]⁺,calcd 479.2904)將pactamide C的分子式確定為C₂₉H₃₈N₂O₄。pactamide C的NMR譜與pactamide A的相似，通過(guò)仔細(xì)比較二者的NMR譜推測(cè)pactamide C缺少一個(gè)六元環(huán)，這一推測(cè)通過(guò)pactamide C的NMR數(shù)據(jù)歸屬得到了確證。pactamide C的相對(duì)構(gòu)型由偶合常數(shù)(EΔ^2,3J_2,3 15.0Hz；EΔ^4,5J_4,514.5Hz；EΔ^15,16J_15,1614.5Hz；EΔ^17,18J_17,18 15.0Hz)和NOESY相關(guān)來(lái)歸屬。根據(jù)NOESY相關(guān)，H-11/H-13歸屬為同一側(cè)，H-6/H-8/H-10/H-12/H3-31歸屬為另一側(cè)。通過(guò)比較pactamide C與lysobacteramide B的CD譜，將pactamide C的絕對(duì)構(gòu)型確定為6S，8S，10S，11R，12R，13S，23S。

帕克特酰胺D(pactamide D)結(jié)構(gòu)解析(表6-7，圖15，31-37)：

根據(jù)HRESIMS(m/z 517.2665[M+H]⁺,calcd 517.2678)將pactamide D的分子式確定為C₂₉H₃₈N₂O₅。pactamide D的NMR譜與pactamide B的相似，與pactamide B不同的是，pactamide D多一個(gè)sp²雜化的次甲基(δ_H 5.24br s,δ_C 127.8,C-9)，少一個(gè)sp²雜化的季碳。從H₃-30及δ_H 5.24到δ_C 144.0的HMBC相關(guān)說(shuō)明在pactamide D中C9/C10為雙鍵。H-8/H-9，H-9/H-30，H-9/H-7間的Noesy相關(guān)進(jìn)一步證實(shí)了上述的歸屬。pactamide D的相對(duì)構(gòu)型由偶合常數(shù)(ZΔ^2,3J_2,3 11.0Hz；EΔ^17,18J_17,18 14.5Hz)和NOESY相關(guān)來(lái)歸屬。根據(jù)NOESY相關(guān)，H-5/H-11/H-13歸屬為同一側(cè)，H-6/H-8/H-12/H-16歸屬為另一側(cè)。通過(guò)比較pactamide D與lysobacteramide B的CD譜，將pactamide D的絕對(duì)構(gòu)型確定為5R，6R，8S，12R，13S，16R，23S。

帕克特酰胺E(pactamide E)結(jié)構(gòu)解析(表6-7，圖15，38-44)：

根據(jù)HRESIMS(m/z 499.2581[M+Na]⁺,calcd 499.2657)將pactamide E的分子式確定為C₂₉H₃₆N₂O₄。pactamide E的NMR譜與pactamide C的相似，與pactamide C不同的是，pactamide E有12個(gè)烯碳，這說(shuō)明pactamide E只有含有一個(gè)5元環(huán)。通過(guò)歸屬pactamide E的2D NMR譜確證了這一推測(cè)。pactamide E的相對(duì)構(gòu)型由偶合常數(shù)(EΔ^2,3J_2,3 15.0Hz；EΔ^4,5J_4,514.5Hz；EΔ^6,7J_6,715.0Hz；EΔ^13,14J_13,1415Hz；EΔ^15，16J_15,1615.0Hz；EΔ^17,18J_17,1814.5Hz)和NOESY相關(guān)來(lái)歸屬。根據(jù)NOESY相關(guān)，H-8/H-10/H-12/H3-31歸屬為同側(cè)。因?yàn)閜actamide E是pactamied C的生物合成前體，根據(jù)生物合成將pactamide E的絕對(duì)構(gòu)型推測(cè)為8S，10S，11R，12S。

帕克特酰胺F(pactamide F)結(jié)構(gòu)解析(表6-7，圖45-51)：

根據(jù)HRESIMS將pactamide F的分子式確定為C₂₉H₃₉ClN₂O₅(m/z 531.2606[M+H]⁺,calcd 531.2626)。pactamide F質(zhì)譜的同位素峰與分子式中含有1個(gè)氯原子相符。pactamide F的核磁數(shù)據(jù)與pactamide A的核磁數(shù)據(jù)很相似，不同的地方是pactamide F缺少雙峰的甲基，多一個(gè)亞甲基，推測(cè)pactamide F中H₃-31中1個(gè)H被OH或Cl原子取代。OH-11到C-10，C-12的HMBC相關(guān)將OH定位于C-11，這說(shuō)明H₃-31中的H被Cl原子取代。pactamide F的相對(duì)構(gòu)型由偶合常數(shù)(ZΔ^2,3J_2,3 10.6Hz；EΔ^17,18J₁₇,18 15.2Hz)和NOESY相關(guān)來(lái)歸屬。根據(jù)NOESY相關(guān)，H-5/H-13歸屬為同一側(cè)，H-6/H-8/H-10/H-12/H-16/H₃-31歸屬為另一側(cè)。通過(guò)比較pactamide F與lysobacteramide B的CD譜，將pactamide F的絕對(duì)構(gòu)型確定為5R，6S，8R，10S，11S，12S，13S，16R，23S。

表4和表5中的No.11、No.12、No.13化合物依次分別表示pactamide A、pactamide B、pactamide C。表6和表7中的No.14、No.15、No.16化合物依次分別表示pactamide D、pactamide E、pactamide F。

表4pactamide A-C的¹H(500MHz)NMR數(shù)據(jù)

^ameasured in 90％CDCl₃/methanol-d₄；^bmeasured in DMSO-d₆.

表5pactamide A-C的¹³C(125MHz)NMR數(shù)據(jù)

^ameasured in 90％CDCl₃/methanol-d₄；^bmeasured in DMSO-d₆.

表6pactamide D-F的¹H NMR數(shù)據(jù)

^ameasured at 500MHz in DMSO-d₆；^bmeasured at 600MHz in DMSO-d_6.

表7pactamide D-F的¹³C NMR數(shù)據(jù)

^ameasured at 500MHz in DMSO-d₆；^bmeasured at 600MHz in DMSO-d₆.

由此確定化合物pactamide A-F的結(jié)構(gòu)如下式所示：

9.環(huán)化酶PtmC體外酶催化體系的構(gòu)建

使用PCR技術(shù)、酶切連接等分子生物學(xué)方法(所用引物為：EptmCF/EptmCR，限制性內(nèi)切酶為NdeI和BamHI；見(jiàn)表2)，將ptmC基因克隆到大腸桿菌表達(dá)載體pET-28a，得到環(huán)化酶PtmC的表達(dá)載體pET-28a(pCSG3641)。將環(huán)化酶PtmC的表達(dá)載體pET-28a(pCSG3641)轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)后，收集細(xì)胞，超聲破碎獲取粗酶液；鎳柱親和層析純化、SDS-PAGE和Bradford法蛋白濃度測(cè)定等，最終獲得高純度PtmC重組酶(圖5)。每100μl PtmC酶催化體系反應(yīng)體系包含200μm的化合物pactamide C(化合物13)、2mM NADPH、10μg純化的PtmC重組酶。該反應(yīng)于pH8.0的磷酸鹽緩沖液中28℃溫育10小時(shí)完成。利用該體系成功將前體化合物13(pactamide C)催化成化合物11(pactamide A)(圖6)。

10.pactamide A-F對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒活性

本發(fā)明人通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，化合物pactamide A–F對(duì)人癌細(xì)胞包括乳腺癌MCF-7、人肝癌HepG2、人肺癌H460和人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞SF-268有細(xì)胞毒活性(表8)，其中pactamide A對(duì)人癌細(xì)胞包括乳腺癌MCF-7、人肺癌H460細(xì)胞、人肝癌HepG2和人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞SF-268的IC₅₀分別是0.26μM、0.24μM、0.37μM和0.51μM。

以下進(jìn)一步提供實(shí)施實(shí)例，這些實(shí)施實(shí)例有助于理解本發(fā)明，僅用作說(shuō)明而不限制本發(fā)明的應(yīng)用范圍。

實(shí)施例1

鏈霉菌(Streptomyces pactum)SCSIO 02999總DNA的提?。?/p>

將新鮮鏈霉菌(Streptomyces pactum)SCSIO 02999的菌絲體按照5％的接種量接種于50mL的TSB培養(yǎng)基(胰蛋白胨17g，植物蛋白胨3g，氯化鈉5g，磷酸氫二鉀2.5g，葡萄糖2.5g，加水至1L，pH 7.2-7.4)中，28-30℃，振蕩培養(yǎng)約3-4天，4000rpm離心10分鐘收集菌絲體。菌絲體用STE溶液(NaCl 75mM，EDTA 25mM，Tris-Cl 20mM)洗滌兩次，向洗滌后的菌絲體中加入30mL STE溶液和終濃度3mg/mL的溶菌酶，渦旋均勻，37℃溫浴3小時(shí)，加入至終濃度0.1-0.2mg/mL的蛋白酶K，混勻，37℃溫浴10分鐘，加入至終濃度1-2％的SDS，混勻，放入55℃水浴約1小時(shí)，期間顛倒數(shù)次。加入等體積的酚-氯仿-異戊醇(V/V/V＝25:24:1)，混合均勻，置于冰上冷卻30分鐘。12000rpm，4℃離心10分鐘，然后用剪過(guò)的大口徑槍頭小心吸取上清到新的離心管中，用同樣的方法反復(fù)處理3次，然后用等體積的氯仿洗滌兩次，12000rpm，4℃離心10分鐘。用剪過(guò)的大口徑槍頭將水相吸出轉(zhuǎn)移至新的離心管，加入1/10體積3mol/L NaAc(pH5.2)，混勻后再加入等體積的異丙醇，混勻后冰上放置，沉淀DNA。小心地用玻璃棒將DNA纖維團(tuán)轉(zhuǎn)移至新的離心管中，用70％乙醇洗滌兩次，將液體傾出，在37℃下略微烘干，加5mL TE溶解，并加入3-5U的RNA酶。由此得到鏈霉菌(Streptomyces pactum)SCSIO 02999總DNA。

實(shí)施例2

鏈霉菌(Streptomyces pactum)SCSIO 02999全基因組文庫(kù)的建立：

首先通過(guò)一系列的稀釋實(shí)驗(yàn)來(lái)確定限制性核酸內(nèi)切酶Sau3A I的用量，在20μL體系中，含有17μL的鏈霉菌(Streptomyces pactum)SCSIO 02999總DNA，2μL的10×反應(yīng)緩沖液和1μL不同稀釋度的Sau3A I，其終止反應(yīng)為4μL 0.5mol/L EDTA和合適的上樣緩沖液。通過(guò)摸索確定了0.025-0.05U的酶活單位比較合適。在此基礎(chǔ)上通過(guò)大量部分酶切得到略大于40kb的基因組DNA片段，用去磷酸化酶進(jìn)行去磷酸化處理。

用于構(gòu)建文庫(kù)的載體SuperCos l質(zhì)粒先用限制性核酸內(nèi)切酶Xba I從兩個(gè)cos序列中間切開(kāi)，然后進(jìn)行去磷酸化處理，再?gòu)亩嗫寺∥稽c(diǎn)處用限制性核酸內(nèi)切酶Bam HI切開(kāi)，獲得兩個(gè)臂。處理后的載體與之前制備的部分酶切的約40kb的基因組DNA片段連接過(guò)夜，連接體系為10μL，含有1.25μg制備的基因組DNA和0.5μg處理后的SuperCos 1質(zhì)粒，1μL的10×Buffer，0.3U的連接酶。連接產(chǎn)物與65℃處理15分鐘，使連接酶失活。從-80℃冰箱中取出一管包裝混合物(50μL)置于冰上，將包裝混合物在指間迅速融化，小心吸取一半包裝混合物(25μL)至一個(gè)新的離心管中，加入10μL熱處理后的連接產(chǎn)物，其余包裝混合物于-80℃保存。小心混勻，30℃溫浴90分鐘，加入另外一半包裝混合物(25μL)，30℃溫浴繼續(xù)90分鐘。加入500μL噬菌體稀釋緩沖液(100mmol/L NaCl,10mmol/L MgCl₂,10mmol/L pH 8.3Tris-HCl)，再加入25μL氯仿，輕輕混勻，于4℃保存。

將凍存于-80℃的菌株E.coli LM392MP涂布在LB培養(yǎng)基上復(fù)蘇。包裝反應(yīng)前一天，挑取單克隆接種于LB培養(yǎng)基中(添加0.2％麥芽糖和10mM MgSO₄)，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，包裝反應(yīng)當(dāng)天，取5mL過(guò)夜培養(yǎng)的菌液加入到50mL新鮮的LB培養(yǎng)基中(添加0.2％麥芽糖和10mM MgSO₄)，37℃，200rpm振蕩至培養(yǎng)物OD₆₀₀達(dá)到0.8-1時(shí)，4℃保存?zhèn)溆?。?00μL如上處理的宿主菌液和100μL適度稀釋的包裝液輕輕混勻，于37℃溫浴15分鐘，然后涂布于含有100μg/mL氨芐青霉素和50μg/mL卡那霉素的LB平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。將長(zhǎng)出來(lái)的單個(gè)克隆子，用無(wú)菌牙簽點(diǎn)種于25塊含合適抗生素的LB的96孔板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，加入終濃度為20％的甘油，混合均勻，置于-80℃保存。由此得到鏈霉菌(Streptomyces pactum)SCSIO 02999全基因組文庫(kù)。

實(shí)施例3：pactamide A-F的細(xì)胞毒活性測(cè)定

pactamide A-F針對(duì)四種腫瘤細(xì)胞株：人乳腺癌MCF-7細(xì)胞、人肝癌細(xì)胞HepG2、人肺癌H460細(xì)胞和人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞SF-268進(jìn)行了活性測(cè)定，實(shí)驗(yàn)方法參考文獻(xiàn)[Wu,Z.C.；Li,D.L.；Chen,Y.C.；Zhang,W.M.,A new isofuranonaphthalenone and benzopyrans from the endophytic fungus Nodulisporium sp.A4from Aquilaria sinensis.Helv.Chim.Acta 2010,93,(5),920-924.]，以順鉑(Cisplatin)作為對(duì)照，其對(duì)人癌細(xì)胞包括乳腺癌MCF-7、人肺癌H460細(xì)胞、人肝癌HepG2和人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞SF-268的IC₅₀分別是9.2μM、1.5μM、1.4μM和3.9μM。結(jié)果表明pactamide A對(duì)人癌細(xì)胞包括乳腺癌MCF-7、人肺癌H460細(xì)胞、人肝癌HepG2和人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞SF-268的IC₅₀分別是0.26μM、0.24μM、0.37μM和0.51μM；pactamide B對(duì)人癌細(xì)胞包括乳腺癌MCF-7、人肺癌H460細(xì)胞、人肝癌HepG2和人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞SF-268的IC₅₀分別是24.4μM、21.9μM、26.1μM和25.5μM；pactamide C對(duì)人癌細(xì)胞包括乳腺癌MCF-7、人肺癌H460細(xì)胞、人肝癌HepG2和人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞SF-268的IC₅₀分別是0.71μM、0.74μM、1.71μM和2.42μM；pactamide D對(duì)人癌細(xì)胞包括乳腺癌MCF-7、人肺癌H460細(xì)胞、人肝癌HepG2和人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞SF-268的IC₅₀分別是14.56μM、17.4μM、17.2μM和19.2μM；pactamide E對(duì)人癌細(xì)胞包括乳腺癌MCF-7、人肺癌H460細(xì)胞、人肝癌HepG2和人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞SF-268的IC₅₀分別是5.1μM、5.2μM、6.8μM和8.7μM；pactamide F對(duì)人癌細(xì)胞包括乳腺癌MCF-7、人肺癌H460細(xì)胞、人肝癌HepG2和人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞SF-268的IC₅₀分別是2.66μM、2.85μM、2.66μM和2.65μM；pactamide A-F對(duì)所測(cè)的四種細(xì)胞的表現(xiàn)有細(xì)胞毒活性，通過(guò)生物工程或化學(xué)修飾可望開(kāi)發(fā)成為抗腫瘤新藥。

表8pactamide A-F的細(xì)胞毒活性