本發(fā)明涉及術(shù)語中藥材來源品種鑒定技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及利用核糖體DNA(rDNA)ITS2片段快速鑒別鐵皮楓斗的方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

鐵皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo(《中國植物志》英文版eflora中拉丁名為Dendrobium catenatum Lindley)為蘭科珍稀名貴藥用植物，有“中華九大仙草之首”之盛名。鐵皮石斛對生長環(huán)境條件要求苛刻，其自然繁殖能力低，生長緩慢，又經(jīng)長期采挖，自然資源瀕臨枯竭，被列為國家重點保護的藥材品種。鐵皮楓斗是由鐵皮石斛鮮條加工而成，已被公認為高端養(yǎng)生品。目前，我國藥用石斛約有40余種，近年來鐵皮石斛價格不斷攀升，市場上把石斛屬其他植物或蘭科某些植物也作為鐵皮石斛混入商品流通和臨床應(yīng)用，對鐵皮石斛的臨床療效和用藥安全產(chǎn)生了很多不良影響。DNA條形碼技術(shù)依賴樣品自身的基因分子信息，能夠?qū)崿F(xiàn)物種的準確鑒定。目前該技術(shù)在鐵皮楓斗的鑒定中有以下問題：(1)鐵皮石斛加工成鐵皮楓斗的過程中，多進行高溫加熱進行加工，且時間較長，造成樣品DNA的嚴重降解，影響DNA的提取效率；(2)通用引物ITS2F/3R在鐵皮楓斗ITS2序列擴增中，擴增效率低。針對以上問題，本發(fā)明提供了一種獲取rDNA ITS2序列用來對鐵皮楓斗進行鑒定的方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明第一個目的在于提供獲取鐵皮楓斗rDNA ITS2序列的PCR擴增策略、PCR擴增特異引物和體系配比。

本發(fā)明第二個目的在于提供鑒別鐵皮楓斗的鑒定方法。

本發(fā)明提供的鐵皮楓斗rDNA ITS2序列制備方法主要包括如下步驟：

(1)擴增策略：由于鐵皮楓斗DNA降解較嚴重，故對鐵皮楓斗ITS2序列進行分段擴增，即設(shè)計兩對引物DO-2F/DO-2R和DO-3F/DO-3R分別擴增更短的序列，保證擴增的成功率，將DO-2F/DO-2R和DO-3F/DO-3R獲得序列按重疊部分連接起來即得ITS2序列。

(2)PCR擴增特異引物：

用于鐵皮楓斗ITS2序列分段擴增的引物為：

正向DO-2F：5’-GCATGGTGGCTCCTCGTG-3’；

反向DO-2R：5’-ATGGATTGGGATCACCTAAAA-3’；

按以下程序擴增：95℃ 5min；94℃ 30s，54℃ 30s，72℃ 45s，40個循環(huán)；72℃ 10min；

正向DO-3F：5’-AAAGGCCTATGCTATTGTGA-3’；

反向DO-3R：5’-CGCTTATTGATATGCTTAAACTC-3’；

按以下程序擴增：95℃ 5min；94℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 45s，40個循環(huán)；72℃ 10min。

(3)PCR擴增體系配比：

由于鐵皮楓斗基因組DNA降解嚴重，通過普通植物基因組DNA提取試劑盒提取DNA濃度很低，需加大模板DNA的體積。DO-2F/DO-2R和DO-3F/DO-3R引物進行PCR擴增的體系均為25μL，包括2×Taq PCR Mix 12.5μL，特異引物正反向各1.0μL(2.5μmol·L^-1)，DNA模板溶液10.5μL。

(4)鑒定

本發(fā)明提供了應(yīng)用于鐵皮楓斗分子鑒定的標準序列SEQ ID No.1，若使用引物DO-2F/DO-2R和DO-3F/DO-3R所得樣品ITS2序列與SEQ ID No.1序列相似性大于或等于99％，則鑒定為鐵皮楓斗。

本發(fā)明適用于鐵皮楓斗市售藥材，以及基原植物、種子種苗等方面的鑒定，可有效解決鐵皮楓斗的物種鑒定以及種質(zhì)資源的開發(fā)利用等問題，適用性廣，操作簡單，易于掌握，準確性高。

附圖說明

圖1所示為引物DO-2F/2R與ITS2F/3R對鐵皮楓斗ITS2序列擴增對比電泳圖CK為空白對照；1-6為引物ITS2F/3R擴增；7-12為引物DO-2F/2R擴增；M為分子量標準(條帶由上到下依次為：2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。

實施例1鐵皮楓斗的鑒定

1.實驗材料

本案例共收集69份鐵皮楓斗樣本，具體信息見表1。

表1鐵皮楓斗樣品信息

2.實驗儀器

臺式高速離心機、PTC-100基因擴增儀、電泳儀、紫外凝膠成像分析系統(tǒng)、MM400球磨儀(德國Retsch)。

3.DNA提取

取鐵皮楓斗干燥藥材20-30mg，切碎后使用MM400球磨儀粉碎，加入核分離液500-1000μL，充分混勻，7000r/min離心5min，棄上清，加入核分離液500-1000μL，重復(fù)此步驟3-5遍至上清不粘稠。其余步驟參照植物基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)標準操作方法進行。核分離液的配方為：Tris-HCl(pH8.0)終濃度100mM，EDTA(pH8.0)終濃度20mM，NaCl終濃度0.7M，2％PVP-40(W/V)，以上各物質(zhì)配成溶液后滅菌，使用之前加入β-巰基乙醇0.4％(V/V)。

4.PCR擴增

(1)均按以下擴增體系進行PCR擴增：反應(yīng)體系25μL，包括2×Taq Master Mix 12.5μL(北京艾德萊生物技術(shù)有限公司)，正反向引物各1.0μL(2.5μmol·L^-1)，DNA模板溶液10.5μL。

(2)引物由生工生物工程公司有限公司(北京)合成，用無菌去離子溶解并稀釋至2.5μmol·L^-1。引物序列及PCR反應(yīng)參數(shù)為：

DO-2F：5’-GCATGGTGGCTCCTCGTG-3’；

DO-2R：5’-ATGGATTGGGATCACCTAAAA-3’；

PCR反應(yīng)參數(shù)：95℃5min；94℃ 30s，54℃30s，72℃ 45s，40個循環(huán)；72℃ 10min。

DO-3F：5’-AAAGGCCTATGCTATTGTGA-3’；

DO-3R：5’-CGCTTATTGATATGCTTAAACTC-3’，

PCR反應(yīng)參數(shù)：95℃ 5min；94℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 45s，40個循環(huán)；72℃ 10min。

5.DNA測序

PCR產(chǎn)物直接進行雙向測序，測序引物同PCR擴增引物(DO-2F/DO-2R、DO-3F/DO-3R)。

6.序列拼接

本實施例采用軟件CodonCode Aligner 5.1(CodonCode Co.，USA)進行序列拼接及校對。首先，利用該軟件去除序列兩端的引物區(qū)，然后進行測序質(zhì)量評估及預(yù)處理，即去除測序結(jié)果兩端的低質(zhì)量部分，并對剩余部分進行質(zhì)量評估。具體步驟是：以20bp的窗口分別從序列5’端和3’端進行滑動，如果窗口內(nèi)有多于2個堿基的Q值小于20，則刪除一個堿基，窗口繼續(xù)滑動，如果窗口內(nèi)堿基Q值小于20的數(shù)目小于或等于2個，窗口停止滑動，即去除了低質(zhì)量的區(qū)域。

序列拼接獲得的兩段序列，按重疊部分連接起來，也可以一條完整的鐵皮石斛ITS2作為參考序列進行比對連接。

7.序列比對

用DNAMAN軟件對獲得各樣品的ITS2序列與Seq ID No.1進行比對，序列相似性均大于或等于99％。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。

實施例2鐵皮石斛基原植物的鑒定

基本同實施例1，所不同的是以鐵皮石斛基原植物為樣品，按上述方法提取DNA，擴增ITS2序列，結(jié)果也能成功獲得目標序列，完成鑒定。

實施例3鐵皮石斛種子種苗的鑒定

基本同實施例1，所不同的是鐵皮石斛種子和種苗為樣品，按上述方法提取DNA，擴增ITS2序列，結(jié)果也能成功獲得目標序列，完成鑒定。