本發(fā)明涉及一種南極磷蝦中吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮,六氫-3-(2-甲基丙基)的提取純化及檢測(cè)方法，屬食品、藥品和化工領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

南極磷蝦(Euphausia superba Dana)，隸屬節(jié)肢動(dòng)物門、甲殼綱、磷蝦目，體型較小，一般體長(zhǎng)約5.5～6.0cm，體重約2g左右。南極生物種類較少，但數(shù)量龐大，食物鏈也相對(duì)簡(jiǎn)單。以浮游植物為食的南極磷蝦是鯨、海豹、企鵝等肉食動(dòng)物的主要食物，也是南極食物鏈中的基礎(chǔ)。南極磷蝦是地球上數(shù)量最大繁衍最成功的單種生物資源之一，其生物蘊(yùn)藏量約為6.5×10⁸～10×10⁸噸，最新估算量為3.79×10⁸噸。南極磷蝦營(yíng)養(yǎng)豐富，富含活性物質(zhì)。南極磷蝦蛋白及酶類、蝦青素、甲殼素等均已有研究報(bào)道。隨著南極磷蝦研究的深入，南極磷蝦產(chǎn)品也由初級(jí)的飼料、蝦粉等向高端的保健、醫(yī)藥領(lǐng)域發(fā)展。加快南極磷蝦研究進(jìn)度有利于提高我國(guó)在南極磷蝦產(chǎn)業(yè)方面占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位。

吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮,六氫-3-(2-甲基丙基)即：Cyclo(Pro-Leu)，是一種環(huán)二肽類物質(zhì)，具有較高的生物活性，主要來(lái)存在于蛋白及多肽水解物，以及動(dòng)植物、酵母、原生生物、真菌、海洋生物。目前，尚未有從南極磷蝦中發(fā)現(xiàn)有Cyclo(Pro-Leu)的研究報(bào)道。因此研究南極磷蝦中是否含有Cyclo(Pro-Leu)及其提取純化和檢測(cè)方法，對(duì)南極磷蝦資源的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用具有十分重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種南極磷蝦中吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮，六氫-3-(2-甲基丙基)的提取純化及檢測(cè)方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：

一種南極磷蝦中吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮,六氫-3-(2-甲基丙基)的提取純化方法，步驟如下：

(1)向南極磷蝦中加入甲醇進(jìn)行回流提取，過(guò)濾，得濾液；濾液蒸發(fā)濃縮得甲醇膏；

(2)向步驟(1)的甲醇膏中加入乙醚浸提，過(guò)濾得乙醚液；乙醚液蒸發(fā)后得乙醚浸膏；

(3)步驟(2)的乙醚浸膏加入適量乙醚溶解后，得乙醚浸膏液，再向其中加入硫酸水溶液攪拌萃取，萃取得酸水層；

(4)向步驟(3)所得酸水層中加入氯仿進(jìn)行萃取，靜置分液得氯仿層A；

(5)向步驟(4)所得氯仿層A中加入氫氧化鈉水溶液萃取，靜置分液得堿水層和氯仿層B；

(6)將步驟(5)所得堿水層中加入適量NH₄Cl，使得溶液pH調(diào)節(jié)至7-8，再加入等體積氯仿進(jìn)行攪拌萃取，靜置分液得氯仿層C；

(7)氯仿層C蒸發(fā)濃縮得Cyclo(Pro-Leu)樣品。

步驟(1)中，南極磷蝦在加入甲醇前先經(jīng)過(guò)冷凍干燥處理。由于南極磷蝦體內(nèi)的酶具有很高的活性，南極磷蝦被捕撈后，其體內(nèi)的內(nèi)源消化酶能高活性的降解蛋白質(zhì)，使死亡后的組織快速分解，加速了南極磷蝦的自溶、腐敗和變質(zhì)；通過(guò)對(duì)南極磷蝦進(jìn)行冷凍干燥預(yù)處理，能夠防止南極磷蝦自溶，有效的保持南極磷蝦的品質(zhì)，進(jìn)而更加有利于提取Cyclo(Pro-Leu)。

步驟(1)中，所述南極磷蝦與甲醇加入量的比為1g:(6-10)mL，提取溫度為70～85℃，優(yōu)選80℃，甲醇回流提取的次數(shù)為7-9次，每次提取的時(shí)間為1-2h，優(yōu)選1h。甲醇提取的次數(shù)選為7-9次，能夠盡可能多的分離提取出Cyclo(Pro-Leu)。

步驟(2)中，所述甲醇膏與乙醚加入量的比為1g:(4-6)mL，加入乙醚浸提的次數(shù)為4-6次，每次提取的時(shí)間為0.5-1h，優(yōu)選1h；乙醚的提取次數(shù)選為4-6次，不僅有效分離出南極磷蝦中的Cyclo(Pro-Leu)，還能盡量減少提取次數(shù)的增加所帶來(lái)的能源浪費(fèi)。

步驟(3)中，所述乙醚浸膏與乙醚加入量的質(zhì)量體積比為1g:10mL，加入乙醚可以增加與酸水的接觸面積，保證堿性物質(zhì)充分溶于酸水層。

步驟(3)中，所述乙醚浸膏液與硫酸水溶液加入量的體積比為1：(10-30)；所述硫酸水溶液的體積分?jǐn)?shù)為1～3％，優(yōu)選2％，選擇所述濃度的硫酸水溶液既能保證足夠的酸性以去除酸性雜質(zhì)，又防止硫酸濃度過(guò)高引起目的物的氧化分解。

步驟(4)中，所述酸水層與氯仿體積比為1：1；所述氯仿與酸水層攪拌萃取次數(shù)為3-4次，每次攪拌時(shí)間為0.5～1.5h，優(yōu)選的，攪拌時(shí)間為1h；充分使二者混勻能夠盡可能使弱堿性成分溶于氯仿層。

步驟(5)中，所述氯仿層A和氫氧化鈉水溶液的體積比為1～2：1，優(yōu)選的，所述氯仿層A和氫氧化鈉水溶液的體積比為1：1；所述氫氧化鈉水溶液的體積分?jǐn)?shù)為1～3％；所述氯仿層A與所述氫氧化鈉水溶液攪拌萃取次數(shù)為6-7次，每次攪拌時(shí)間為0.5～1.5h，優(yōu)選的，攪拌時(shí)間為1h；充分使二者混勻能夠盡可能除去弱酸性雜質(zhì)。

步驟(6)中，加入氯仿與堿水的攪拌萃取次數(shù)為3-4次，每次為1h。攪拌萃取次數(shù)選為3-4次，不僅有效分離出南極磷蝦中的目標(biāo)物質(zhì)，還能盡量減少萃取次數(shù)的增加而引入更多的雜質(zhì)；加入NH₄Cl的目的是保護(hù)氮原子，并降低pH值，使弱堿性目標(biāo)物能被有機(jī)溶劑萃取出。

本發(fā)明還公開(kāi)了由上述提取純化方法制備得到吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮,六氫-3-(2-甲基丙基)。

此外，本發(fā)明提供一種由上述提取純化方法制備得到的吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮,六氫-3-(2-甲基丙基)的檢測(cè)方法，所述方法采用氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)分析檢測(cè)，檢測(cè)條件為：DB-1色譜柱(30m×0.25mm×0.25μm)；載氣：氦氣；流速：1mL/min，溶劑延遲2.06min；升溫程序：初始溫度為50℃，以2℃/min升溫到60℃，再以30℃/min升到250℃，保持8min。離子化方式：EI，70eV；離子源溫度：250℃；載氣：氦氣；柱流速：1.0mL/min。

本發(fā)明的有益效果：

(1)本發(fā)明以南極磷蝦為原料，首次從中提取純化并檢測(cè)出吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮,六氫-3-(2-甲基丙基)即：Cyclo(Pro-Leu)，對(duì)南極磷蝦開(kāi)發(fā)具有重要意義；

(2)本發(fā)明針對(duì)南極磷蝦這一特殊海洋資源，經(jīng)過(guò)申請(qǐng)人不斷摸索實(shí)驗(yàn)最終得到一種提取純化吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮,六氫-3-(2-甲基丙基)的方法，該方法具有提取純化步驟簡(jiǎn)單，所需試劑廉價(jià)易得，不需要昂貴復(fù)雜設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)；同時(shí)通過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)和分析，選擇氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)對(duì)提取的Cyclo(Pro-Leu)進(jìn)行分析檢測(cè)，該檢測(cè)方法能有效、準(zhǔn)確的檢測(cè)出Cyclo(Pro-Leu)及其含量。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例1樣品的質(zhì)譜及結(jié)構(gòu)圖；

圖2為實(shí)施例2樣品的質(zhì)譜及結(jié)構(gòu)圖；

圖3為實(shí)施例3樣品的質(zhì)譜及結(jié)構(gòu)圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，應(yīng)該說(shuō)明的是，下述說(shuō)明僅是為了解釋本發(fā)明，并不對(duì)其內(nèi)容進(jìn)行限定。

實(shí)施例1：

稱取100g冷凍干燥的南極磷蝦，加入甲醇800ml，70℃回流提取7次，每次1h，至浸提液無(wú)色。過(guò)濾，濾液旋蒸后得甲醇膏。向甲醇膏中加入乙醚浸提4次，每次1h，過(guò)濾得乙醚浸提液；乙醚浸提液旋蒸濃縮后得乙醚浸膏。乙醚浸膏加適量乙醚溶解，得乙醚浸膏液，所述乙醚浸膏與乙醚的質(zhì)量體積比為1g：10ml；再加入10倍于乙醚浸膏液體積的體積分?jǐn)?shù)為2％的H₂SO₄水溶液攪拌萃取，分液得酸水層。向酸水層加入等體積的氯仿，磁力攪拌萃取3次，每次1h，靜置分液得氯仿層A。向氯仿層A中加入等體積的體積分?jǐn)?shù)為2％NaOH水溶液，磁力攪拌萃取6次，每次1h，靜置分液得氯仿層B和堿水層。堿水層加入NH₄Cl使pH調(diào)至7，再加入等體積氯仿萃取3次，每次1h，靜置分液得氯仿層C。氯仿層C旋蒸濃縮得Cyclo(Pro-Leu)樣品7.52mg。

對(duì)樣品采用GC-MS法對(duì)物質(zhì)成分進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)條件如下：

檢測(cè)儀器：Agilent 7890GC-5975MS；

GC-MS條件：DB-1色譜柱(30m×0.25mm×0.25μL)；載氣：氦氣；流速：1mL/min，溶劑延遲2.06min；升溫程序：初始溫度為50℃，以2℃/min升溫到60℃，再以30℃/min升到250℃，保持8min。離子化方式：EI，70eV；離子源溫度：250℃；載氣：氦氣；柱流速：1.0mL/min；進(jìn)樣方式：分流，比例50：1；進(jìn)樣體積：0.2μL。

經(jīng)檢測(cè)，在保留時(shí)間為11.848min處的色譜峰檢索對(duì)應(yīng)物質(zhì)為Cyclo(Pro-Leu)，其相對(duì)含量為18.49％。分析檢測(cè)對(duì)應(yīng)質(zhì)譜及結(jié)構(gòu)如圖1所示。

實(shí)施例2：

稱取100g冷凍干燥的南極磷蝦，加入甲醇1000ml，85℃回流提取8次，每次1h，至浸提液無(wú)色。過(guò)濾，濾液旋蒸后得甲醇膏。向甲醇膏中加入乙醚浸提5次，每次1h，過(guò)濾得乙醚浸提液；乙醚浸提液旋蒸濃縮后得乙醚浸膏。乙醚浸膏加適量乙醚溶解，得乙醚浸膏液，所述乙醚浸膏與乙醚的質(zhì)量體積比為1g：10ml；再加入30倍于乙醚浸膏液體積的體積分?jǐn)?shù)為1％的H₂SO₄水溶液進(jìn)行攪拌萃取，分液得酸水層。向酸水層加入等體積的氯仿，磁力攪拌萃取4次，每次1h，靜置分液得氯仿層A。向氯仿層A中加入等體積的體積分?jǐn)?shù)為1％NaOH水溶液，磁力攪拌萃取7次，每次1h，靜置分液得氯仿層B和堿水層。堿水層加入NH₄Cl使pH調(diào)至7，再加入等體積氯仿萃取3次，每次1h，靜置分液得氯仿層C。氯仿層C旋蒸濃縮得Cyclo(Pro-Leu)樣品7.56mg。

對(duì)樣品采用GC-MS法對(duì)物質(zhì)成分進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)方法同實(shí)施例1。經(jīng)檢測(cè)，在保留時(shí)間為11.857min處的色譜峰檢索對(duì)應(yīng)物質(zhì)為Cyclo(Pro-Leu)，其相對(duì)含量18.70％。分析檢測(cè)對(duì)應(yīng)質(zhì)譜及結(jié)構(gòu)如圖2所示。

實(shí)施例3：

稱取100g冷凍干燥的南極磷蝦，加入甲醇600ml，80℃回流提取9次，每次1h，至浸提液無(wú)色。過(guò)濾，濾液旋蒸后得甲醇膏。向甲醇膏中加入乙醚浸提6次，每次1h，過(guò)濾得乙醚浸提液；乙醚浸提液經(jīng)旋蒸濃縮后得乙醚浸膏。乙醚浸膏加入乙醚溶解得乙醚浸膏液，所述乙醚浸膏與乙醚的質(zhì)量體積比為1g：10ml；再加入30倍于乙醚浸膏液體積的體積分?jǐn)?shù)為3％的H₂SO₄水溶液攪拌萃取，分液得酸水層。向酸水層加入等體積的氯仿，磁力攪拌萃取3次，每次1h，靜置分液得氯仿層A。向氯仿層A中加入等體積的體積分?jǐn)?shù)為3％NaOH水溶液，磁力攪拌萃取6次，每次1h，靜置分液得氯仿層B和堿水層。堿水層加入NH₄Cl使pH調(diào)至8，再加入等體積氯仿萃取3次，每次1h，靜置分液得氯仿層C。氯仿層C旋蒸濃縮得Cyclo(Pro-Leu)樣品7.59mg。

對(duì)樣品采用GC-MS法對(duì)物質(zhì)成分進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)方法同實(shí)施例1。經(jīng)檢測(cè)對(duì)樣品采用GC-MS法對(duì)物質(zhì)成分進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)方法同實(shí)施例1。經(jīng)檢測(cè)，在保留時(shí)間為11.852min處的色譜峰檢索對(duì)應(yīng)物質(zhì)為Cyclo(Pro-Leu)，相對(duì)含量18.96％。分析檢測(cè)對(duì)應(yīng)質(zhì)譜及結(jié)構(gòu)如圖3所示。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。