版權(quán)通知

按照37 C.F.R. 1.71(e)，申請人注意到，本公開的一部分包含受到版權(quán)保護的材料（諸如但不限于圖、裝置照片或這個提案（其版權(quán)保護在任何管轄區(qū)中是或可能是可得到的）的任何其它方面。版權(quán)所有者不反對由專利文件或?qū)＠_的任何人的傳真復(fù)制，因為它在專利商標局專利文件或記錄中出現(xiàn)，但在其它方面無論如何保留所有版權(quán)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明在各種實施例中涉及用于使用微流控系統(tǒng)來檢測細胞的侵襲行為或其它微小物體的有關(guān)行為的化驗、系統(tǒng)和裝置。特別的實施例涉及可與各種標準自動處理系統(tǒng)、與培養(yǎng)基的主動或被動裝載和灌注一起使用并提供用于分析細胞侵襲、移動、趨化性或其它性質(zhì)的高吞吐量多化驗自動系統(tǒng)的配置。

技術(shù)背景

在這個提案（包括與本申請一起提交的任何文檔）中的任何地方對任何工作、公布物、銷售或活動的討論不應(yīng)被理解為承認任何這樣的工作構(gòu)成現(xiàn)有技術(shù)。在本文中的任何活動、工作或公布物的討論并不承認這樣的活動、工作或公布物在任何特別的管轄區(qū)中存在或是已知的。

微流控細胞培養(yǎng)是用于在藥物篩選、組織培養(yǎng)、毒性篩選和生物研究中的應(yīng)用的重要技術(shù)，并可提供改進的生物功能、較高質(zhì)量基于細胞的數(shù)據(jù)、減少的試劑消耗和較低成本。高質(zhì)量分子和細胞樣品制備對各種臨床、研究和其它應(yīng)用是重要的。體外樣品（其接近地表示其體內(nèi)特性）可潛在地有益于寬范圍的分子和細胞應(yīng)用。細胞或其它生物上或化學(xué)上活性的材料（諸如涂覆有各種生物分子的珠子）的處理、特性化、培養(yǎng)和可視化在藥物發(fā)現(xiàn)、疾病診斷和分析以及多種其它治療和實驗工作方面變得日益受重視。

在上面引用的和有關(guān)的專利申請中討論了涉及微流控系統(tǒng)、裝置、方法和制造的很多方面。雖然從那些申請到本文中呈現(xiàn)的任何權(quán)利要求中不應(yīng)讀到特別的限制，但這些合并的文檔提供關(guān)于特定實施例的有用背景材料。

在細胞化驗系統(tǒng)中的所感興趣的一個領(lǐng)域是能夠確定細胞遷移的特性的化驗。這樣的化驗在各種類型的惡性細胞的特性化中以及也在各種刺激下的其它細胞的特性化中是重要的。

已經(jīng)提出了使用微室或微流控學(xué)的一些化驗。其它系統(tǒng)使用具有各種障礙插入物的標準培養(yǎng)板來試圖檢測細胞侵襲。然而當前可用的系統(tǒng)關(guān)于對使用方便、高吞吐量或自動應(yīng)用所必要的很多方面已經(jīng)是失敗的。

如上面引用的早些時候的工作和專利申請討論了與微流控細胞培養(yǎng)有關(guān)的各種配置、方法和系統(tǒng)，且該工作和那些公布物通過引用被并入本文中。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明涉及與改進的微流控細胞培養(yǎng)裝置和系統(tǒng)——特別是用于侵襲性或以其它方式新陳代謝或能動細胞的培養(yǎng)和分析的系統(tǒng)——有關(guān)的各種部件、系統(tǒng)和方法。在一個方面中，本發(fā)明涉及具有優(yōu)于使用多培養(yǎng)室板或微流控結(jié)構(gòu)的前面提到的侵襲或遷移或移動化驗的優(yōu)點的新穎的微流控細胞培養(yǎng)裝置、系統(tǒng)和方法。在另一方面中，本發(fā)明涉及用于將多個微流控細胞培養(yǎng)和/或細胞侵襲性化驗單元集成到各種多細胞培養(yǎng)單元系統(tǒng)中，諸如到包括各種標準孔板格式（例如96孔SBS培養(yǎng)板或其它板格式，其包括具有6、12、24、96、384或1536樣品孔以及開放底部標準孔板，從而允許附接到如在本文中所述的微流控結(jié)構(gòu)）的微量滴定孔板結(jié)構(gòu)中的新穎結(jié)構(gòu)和方法。

在特別的實施例和示例中，設(shè)計特征包括以常規(guī)格式提供侵襲化驗裝置，其允許管道和到板本身的連接器的消除、使用被動重力驅(qū)動流來維持長期連續(xù)灌注細胞培養(yǎng)的能力、對微流控板的出口孔和/或細胞侵襲觀察孔或培養(yǎng)孔執(zhí)行直接分析的能力、有效地處理凝膠培養(yǎng)培養(yǎng)基的能力。

雖然在本文中詳細討論的很多示例被設(shè)計成結(jié)合標準或定制孔板來使用，但如本文中描述的各種配置的微流控結(jié)構(gòu)和培養(yǎng)單元和系統(tǒng)和方法也可獨立于任何孔板（諸如在各種集成芯片實驗室系統(tǒng)中）被采用，實施集成芯片實驗室系統(tǒng)并不被配置成結(jié)合孔板或各種其它微流控裝置或系統(tǒng)來使用。

為了清楚的目的，這個討論在特定示例方面提及裝置、方法和概念。然而，本發(fā)明及其方面可應(yīng)用于各種類型的裝置和系統(tǒng)。因此意圖是本發(fā)明并不被限制，除了如在所附權(quán)利要求和等效形式中提供的。

此外，在本領(lǐng)域中公知的，諸如在本文中描述的系統(tǒng)和實施例可以以模塊化樣式包括多種不同的部件和不同的功能。本發(fā)明的不同實施例可包括元件和功能的不同混合，并可將各種功能分組為各種元件的部分。為了清楚的目的，在包括很多不同的創(chuàng)新部件和創(chuàng)新部件及已知部件的創(chuàng)新組合的系統(tǒng)方面描述了本發(fā)明。不應(yīng)推斷的是，將本發(fā)明限制到包含在本說明書中的任何例證性實施例中列出的所有創(chuàng)新部件的組合。除非在本文中另有具體規(guī)定，本文中描述的元件的任何組合應(yīng)被理解為包括那些元件的任何子集的每個子組合以及還包括與本文中描述的任何其它元件組合的那些元件的任何子集的任何子組合，如本領(lǐng)域中的技術(shù)從業(yè)人員將理解的。

在下面的附圖和詳細描述中的一些中，在多部件裝置或系統(tǒng)的重要獨立實施例方面描述了本發(fā)明。這不應(yīng)被理解為限制本發(fā)明的各種新穎方面，其使用本文中提供的教導(dǎo)可應(yīng)用于很多其它情況。在下面的附圖和描述中的一些中，在包括與結(jié)構(gòu)的尺寸、液體的壓力或體積、溫度、電氣值、持續(xù)時間等有關(guān)的特定參數(shù)的很多特定的示例實施例方面描述了本發(fā)明。除了在所附權(quán)利要求中這樣提供的場合以外，這些參數(shù)作為示例被提供且不限制本發(fā)明，其包括具有不同尺寸的其它裝置或系統(tǒng)。為了提供更啟發(fā)性的描述的目的，特定已知的制作步驟、細胞處理步驟、試劑、化學(xué)或機械工藝和可被包括來根據(jù)本發(fā)明的特定實施例制成系統(tǒng)或制造裝置的其它已知部件作為示例被給出。本領(lǐng)域中的技術(shù)人員將理解，除了在本文中另有具體提到的以外，可在本文中描述的過程中做出各種已知的替代。

在這個提交中引用的所有參考、公布物、專利和專利申請由此為了所有目的通過引用被全部并入。

附圖說明

本專利的文件包括以彩色執(zhí)行的至少一個附圖。具有彩色附圖的本專利的副本將在請求和支付必要的費用時由美國專利和商標局提供。

圖1（A）是根據(jù)特定實施例的示例微流控板設(shè)計的示意圖，在該示例中具有在96孔板上的24個侵襲化驗單元，每個單元在該示例中包含4個孔：流入口、細胞/凝膠入口、侵襲室和流出口。（B）是示出根據(jù)本發(fā)明的特定實施例的一個侵襲培養(yǎng)單元的細節(jié)的示意圖。

圖2是用從頂部（A）和底部（B）獲取的圖像圖示填充有藍色染料的示例單個流單元的照片，其中底部圖片通過在自上而下的方向上翻過板而被獲取，使得入口孔在兩個圖片中的左側(cè)。

圖3A-C是根據(jù)本發(fā)明的特定實施例的在裝有凝膠以示出按梯度的侵襲化驗操作和細胞遷移之后的侵襲室的區(qū)域的一系列顯微照片。

圖4A-B是示出根據(jù)本發(fā)明的特定實施例的在化驗系統(tǒng)和裝置中的按梯度的癌細胞侵襲和細胞遷移的顯微照片。

圖5A-B圖示根據(jù)本發(fā)明的特定實施例的具有多個入口的示例細胞培養(yǎng)室設(shè)計的配置和操作。

圖6A-C圖示根據(jù)本發(fā)明的特定實施例的示例大致矩形的細胞培養(yǎng)室設(shè)計和梯度室設(shè)計的配置和操作。

圖7圖示用于微流控活細胞成像的示例定制板框架的機械附圖，并且其圖示了4個獨立的單元（例如行）、用于改進的光學(xué)器件的大成像窗口、空氣進入/出來口（例如相鄰于成像窗口）和在該示例中用來改進歧管的真空密封的孔之間的擴展空間。在該示例中，在具有2個出口孔（在該示例中，一個出口孔放大以容納更多的體積）的情況下存在每單元6個入口孔，。

圖8圖示根據(jù)特定實施例的針對每一個單元有三個流入口、成像窗口、細胞入口和流出口的2個培養(yǎng)單元板。

圖9圖示根據(jù)特定實施例的針對每一個單元有三個流入口、成像窗口、細胞入口和流出口的培養(yǎng)單元板的16單元版本。

圖10圖示根據(jù)本發(fā)明的特定實施例的具有氣體灌注線的示例板歧管的附圖。

圖11A-B是圖示根據(jù)特定實施例的具有四個獨立培養(yǎng)單元的活性控制板的示例的示意圖和照片，每一個培養(yǎng)單元具有6個流入口、培養(yǎng)室和兩個流出口。

圖12A-C是圖示根據(jù)特定實施例的具有四個獨立培養(yǎng)單元的進一步的示例培養(yǎng)板的圖解，每一個培養(yǎng)單元具有可用于實踐在本文中描述的一個或多個方法的6個流入口、培養(yǎng)室和兩個流出口。

圖13圖示根據(jù)特定實施例的在暴露于穩(wěn)定梯度之后的細胞遷移的一個示例。

圖14作為示例圖示根據(jù)特定實施例的用來更好地說明梯度對在微流控細胞培養(yǎng)裝置中的細胞移動的影響的示例X/Y細胞遷移繪圖。

圖15作為示例圖示根據(jù)特定實施例的作為在微流控細胞培養(yǎng)裝置中行進的距離的函數(shù)的示例細胞遷移。

圖16作為示例圖示根據(jù)特定實施例示出在微流控細胞培養(yǎng)裝置中暴露于穩(wěn)定梯度的細胞比在穩(wěn)定培養(yǎng)基環(huán)境中的細胞移動得更快的繪圖。

圖17圖示示出根據(jù)特定實施例的對梯度的暴露刺激細胞朝著高濃度匯點的主動遷移的一個示例。

圖18A-C示出根據(jù)本發(fā)明的特定實施例的示例歧管的示意圖的頂視圖、側(cè)視圖和平面視圖。在該示例中，右邊的八個管道線用于壓縮的空氣，且每一個管道線被配置成向微流控陣列中的一列細胞入口孔的提供壓力。在圖中最左邊的線用于真空并連接到在歧管周圍的外部真空環(huán)?？椎拿恳涣幸话氵B接到單個壓力線，其中在成像區(qū)之上的孔被跳過。

圖19圖示根據(jù)本發(fā)明的特定實施例的用于操作微流控板的示例系統(tǒng)和歧管。

圖20圖示根據(jù)本發(fā)明的特定實施例的具有附加的氣體線和物鏡并示出在連接到培養(yǎng)裝置的微流控板中的五個活性孔的歧管。

圖21是示出代表性示例邏輯裝置的方框圖，其中本發(fā)明的各種方面可被體現(xiàn)。

圖22（表1）圖示根據(jù)本發(fā)明的特定實施例的可被評估或者藥物或其它治療可針對其被測試的疾病、狀況或狀態(tài)的示例。

具體實施方式

1．概述

定義

“顆粒”指生物細胞，狀如哺乳動物或細菌細胞、病毒顆?；蛑|(zhì)體或根據(jù)本發(fā)明可受到化驗的其它顆粒。這樣的顆粒具有在大約50-100 nm之間的最小尺寸，并可大至20微米或更大。當用于描述根據(jù)本發(fā)明的細胞化驗時，術(shù)語“顆粒”和“細胞”可互換地使用。

“微通道”或“通道”或“流通道”通常指的是用于流體地連接根據(jù)本發(fā)明的特定實施例的系統(tǒng)和裝置的各種部件的微米尺度通道。微通道通常具有矩形（例如正方形）或圓形橫截面，其中在優(yōu)選實施例中側(cè)邊和深度尺寸分別在10和500微米之間以及10和500微米之間。在微通道中流動的流體可展示微流控行為。當用于提及在本發(fā)明的微孔陣列裝置內(nèi)的微通道時，術(shù)語“微通道”和“通道”可互換地使用。“流通道”一般表示設(shè)計成使培養(yǎng)基、試劑或其它流體或凝膠和在一些實施例中細胞通過的通道?！芭囵B(yǎng)通道”或“細胞培養(yǎng)通道”一般表示細胞被設(shè)計成流經(jīng)的且也在細胞培養(yǎng)期間保留的細胞培養(yǎng)結(jié)構(gòu)的一部分（雖然在一些實施例中細胞可位于培養(yǎng)通道的特別的培養(yǎng)區(qū)中）?！翱諝馔ǖ馈币话惚硎居糜谠试S氣體（諸如空氣、富含氧的混合物等）在流通道或培養(yǎng)區(qū)附近通過的大致微米尺度的通道。“灌注通道”有時用于指示允許培養(yǎng)基灌注到培養(yǎng)區(qū)的流通道和任何灌注通路或結(jié)構(gòu)。

“障礙”或“擴散障礙”或“灌注障礙”或“質(zhì)量轉(zhuǎn)移障礙”指的是實心結(jié)構(gòu)和比流通道小的通路的組合，其一般使流通道與細胞培養(yǎng)區(qū)或室分離。通路一般比微通道高度和/或?qū)挾刃。ɡ绱蠹s5-50%或大約10%），且在一些實施例中被設(shè)計成防止細胞、其它培養(yǎng)物品和在一些實施例中的凝膠遷移到流通道中，同時允許通過擴散、灌注或質(zhì)量轉(zhuǎn)移機制的任何組合的一些流體流動，其一般具有比在流通道中的流體流動高得多的流體阻力。在一個示例實施例中，障礙具有4微米高且以其它方式沿著微通道的大部分長度延伸的通路。在其它實施例中，障礙具有大約與微流控通道一樣高但大約4微米寬的很多通路。障礙也可允許細胞或細胞成分穿過障礙或其它材料或小到足以穿過通路的顆粒的一些遷移。

“微流控裝置”指的是具有由微米尺度微通道連接的各種臺或孔的裝置，其中流體將在其穿過通道的流動中展示微流控行為。

“微孔陣列”指在襯底上形成的兩個或更多的微孔的陣列。

“裝置”是廣泛用在本領(lǐng)域中的并包括寬范圍的意義的術(shù)語。例如在其最基本和最不復(fù)雜的水平處，“裝置”可簡單地表示具有諸如通道、室和口的特征的襯底。在增加的復(fù)雜水平處，“裝置”還可包括圍繞所述特征的襯底或具有一致地或獨立地操作的微流控特征的其它層。在其最復(fù)雜的水平處，“裝置”可包括與促進在外部世界和襯底的微流控特征之間的交互作用的對象配合的全功能襯底。這樣的對象可以被不同地稱為支持物、外殼、殼體或如下討論的類似術(shù)語。如在本文中使用的，術(shù)語“裝置”指的是上下文可指示的這些實施例或復(fù)雜水平中的任何一個。

如在本文中使用的元件或權(quán)利要求的“任何組合”指的是元件提及物或所提及的任何個別元件的組合。

微流控系統(tǒng)提供強大的工具來引導(dǎo)生物實驗。最近，基于彈性體的微流控學(xué)由于其光學(xué)透明度、氣體滲透性和簡單的制作方法而尤其獲得普及。然而，與最終用戶的接口要求穿過彈性體穿出的勞動力密集的孔以及管道和注射器泵連接的附加步驟。

本發(fā)明涉及用于各種培養(yǎng)和化驗應(yīng)用的集成微流控。本發(fā)明還涉及用于使用這樣的板使細胞培養(yǎng)自動化的微流控和部件和系統(tǒng)的制造方法。特定實施例的優(yōu)點包括標準微量滴定板格式、無管道細胞培養(yǎng)和用于化驗侵襲、遷移或趨化性細胞行為的仿生微環(huán)境的使用。

可使用用于處理標準微量滴定板的標準技術(shù)和裝備來操作根據(jù)本發(fā)明的特定實施例的系統(tǒng)（例如使用96孔標準板），如在本領(lǐng)域中公知的。例如，用標準吸移管機構(gòu)來實現(xiàn)液體和/或凝膠或細胞分配，且可進行與現(xiàn)有的培養(yǎng)箱和板閱讀器兼容的細胞培養(yǎng)和分析。

根據(jù)本發(fā)明的另外的實施例，新穎的細胞裝載系統(tǒng)使用氣動歧管和氣動壓力來將細胞放置在微培養(yǎng)區(qū)中。在添加這個細胞裝載系統(tǒng)的情況下，可使用存在來用于處理標準滴定板的其它自動設(shè)備來完全自動化微流控細胞培養(yǎng)和分析。

在另外的實施例中，重力驅(qū)動流培養(yǎng)配置利用在入口和出口孔之間的培養(yǎng)基水平差以及設(shè)計流體阻力來實現(xiàn)在nL/min狀況中的期望流率。這提供能夠使培養(yǎng)基“被動地”流動長時間段（例如多達4天）的顯著優(yōu)點，而不使用龐大的外部泵或管，其在侵襲化驗的情況下允許在培養(yǎng)開始之后的一個或多個時間段的分析的容易建立和侵襲化驗結(jié)構(gòu)的容易讀取。

在另外的實施例中，本發(fā)明涉及用來允許對粘附和/或侵襲或遷移細胞的長期時間推移顯微鏡檢查的細胞培養(yǎng)環(huán)境的控制的微流控系統(tǒng)。根據(jù)本發(fā)明的特定實施例，本發(fā)明提供了允許時間推移顯微鏡檢查實驗和在其它化驗當中的細胞侵襲的檢查的多重微流控流體室。微流控室使用灌注障礙來分離細胞與流通道和侵襲障礙以研究在培養(yǎng)室和侵襲室之間的細胞的侵襲性質(zhì)。示例實施例被格式化到標準孔板，其允許液體和細胞/凝膠樣品使用標準裝備直接被吸移到適當?shù)娜肟趦ζ髦小?/p>

在一些實施例中，定制氣動流控制器可用于將細胞裝載到培養(yǎng)區(qū)中以及在不同的暴露溶液之間切換。數(shù)字軟件接口可用于允許用戶對特定的輸入（脈沖、斜面等）隨著時間的編程以使細胞在時間推移成像期間暴露于復(fù)雜功能。

在活細胞中的動態(tài)響應(yīng)是用于現(xiàn)象（諸如生物信號處理、基因表達調(diào)節(jié)、區(qū)分和細胞分裂）的基礎(chǔ)。在特定的實施例中，本發(fā)明涉及能夠以與當前細胞培養(yǎng)方法兼容的多重格式控制細胞微環(huán)境的系統(tǒng)?？墒褂酶叻糯舐薀晒怙@微鏡來量化細胞響應(yīng)以得到具有子細胞分辨率的動力學(xué)信息。這個能力在細胞系統(tǒng)生物學(xué)中具有廣泛的應(yīng)用，其中動態(tài)單細胞響應(yīng)實驗當前是不實際的。雖然根據(jù)特定實施例的一些侵襲化驗實施例可使用在暴露于僅僅一個培養(yǎng)基/試劑混合物的情況下的大部分或完全被動系統(tǒng)，可使用復(fù)雜的試劑調(diào)度利用如本文中所述的歧管來執(zhí)行根據(jù)特定實施例的其它侵襲化驗。

2．微流控培養(yǎng)系統(tǒng)和陣列

上面提到的申請討論了多種不同的細胞培養(yǎng)配置和制作技術(shù)。細胞培養(yǎng)區(qū)的操作的部分和材料作為本討論的背景是有用的。在其中的一些示例中，一個或多個微培養(yǎng)區(qū)經(jīng)由流體通路的柵格（或擴散入口或?qū)Ч埽┻B接到培養(yǎng)基或試劑通道，其中柵格包括多個交叉高流體阻力灌注通路。在一個所討論的示例中，柵格中的通路在高度上是大約1到4 μm、在長度上是大約25到50 μm和在寬度上是大約5到10 μm，柵格允許在培養(yǎng)基或試劑通道和培養(yǎng)區(qū)之間的更均勻的擴散，并允許更容易的制造和更均勻的擴散。還討論了在微室和灌注/擴散通路或柵格之間的高流體阻力比（例如在大約10:1、20:1到30:1的范圍內(nèi)的比）較早的申請?zhí)峁┘毎囵B(yǎng)的很多優(yōu)點，諸如：（1）細胞的大小排除；（2）在微室內(nèi)部的細胞的定位；（3）促進用于細胞生長的統(tǒng)一流體環(huán)境；（4）配置微室或培養(yǎng)區(qū)的陣列的能力；（4）制作的容易，以及（5）沒有大規(guī)模閥網(wǎng)絡(luò)的試劑的操縱。圖示了示例，其中根據(jù)本發(fā)明的特定實施例，柵格狀灌注障礙可以比培養(yǎng)區(qū)短得多或可接近于相同的高度或在相同的高度處，且另外其中圖示了培養(yǎng)裝置的各種配置。

3．侵襲化驗單元

在特定實施例中，本發(fā)明還包括用于3D癌細胞侵襲化驗的微流控板。在特定的示例實現(xiàn)中，板使用具有由微流控通道連接的4個孔的標準96孔板格式來創(chuàng)建每一個個別的流動和侵襲化驗單元（在特定實施例中每板具有例如24個單元）。在一些實施例中，流由如在本文中其它地方討論的毛細管力和重力驅(qū)動，其在細胞和培養(yǎng)基的最初引入之后允許板在標準培養(yǎng)箱中操作而沒有外部連接。在特定的實施例中，本發(fā)明的裝置將在3D凝膠中的細胞接收到培養(yǎng)室內(nèi)。培養(yǎng)室通過侵襲障礙與侵襲室分離，且這兩者都通過一組例如8x8微米橫截面微流控孔隙或通路（在本文中有時被稱為侵襲障礙）與流通道分離，因而模仿腫瘤侵襲的體內(nèi)環(huán)境。

圖1（A）是根據(jù)特定實施例的示例微流控板設(shè)計的示意圖，其在該示例中具有在96孔板上的24個侵襲化驗單元的，每一個單元在該示例中包含4個孔：流入口、細胞/凝膠入口、侵襲室和流出口。在這個實施例中，在流入口、細胞/凝膠入口和流出口中的液體與微通道接觸。在侵襲室之上的孔為了更好的成像質(zhì)量而保持空。板的底表面是玻璃載玻片。每板有24個流單元（每一個單元是1孔乘4孔，在8x12孔板上形成8x3陣列）。

返回到圖1A-B所示的示意圖，該圖提供三個放大水平。在圖1A-B中被標記為F7以指示在示例96孔板中的特別孔位置的最放大的區(qū)示出根據(jù)特定實施例的一個侵襲室的細節(jié)。這個侵襲化驗/培養(yǎng)區(qū)可被理解為包括5個主要區(qū)域。

細胞/凝膠裝載通道被示出在圖的底部處。根據(jù)特定的實施例，混合在凝膠（例如基質(zhì)膠、膠原、纖維蛋白等）中的細胞通過毛細管流或使用如本文中所述的其它主動或被動裝載裝置被裝載到底部通道中。在操作中，通道被設(shè)計成使得凝膠填充裝載通道并且也填充侵襲障礙和侵襲室的部分或全部，但不通過灌注障礙。在一個示例實施例中，裝載通道在寬度上是550 μm且在高度上是50 μm。

根據(jù)特定實施例，裝載通道通過侵襲障礙與侵襲室分離。在特定的示例中，侵襲障礙由近似50x8x8μm（LxWxH）尺寸的通道的網(wǎng)絡(luò)組成。這些在一些實施例中是或變得填充有凝膠或液體，并模仿在組織中的內(nèi)皮障礙。侵襲癌細胞能夠穿過侵襲障礙的窄通道移動到侵襲室內(nèi)。在該示例中的侵襲室在尺寸（LxWxH）上大約是4.8 x 0.5 x .05 mm，且用于對侵襲或從裝載通道遷移通過侵襲障礙的細胞的數(shù)量計數(shù)。在化驗操作期間，在這個室中的細胞可通過手動或自動顯微鏡或其它裝置被計數(shù)并被量化以確定孔的侵襲索引。

灌注障礙在特定的實施例中是100x4x2 μm（LxWxH）的尺寸的通道的網(wǎng)絡(luò)，其分離侵襲室與流通道。窄橫截面防止細胞和凝膠穿過灌輸障礙。培養(yǎng)基（和在培養(yǎng)基中攜帶的藥物，包括化學(xué)引誘劑、染料或在侵襲化驗中或在細胞培養(yǎng)中使用的其它材料）跨越灌注障礙擴散并對侵襲細胞形成梯度，模仿在脈管系統(tǒng)中的腫瘤環(huán)境。

100x50 μm（WxH）流通道攜帶從流入口孔通過侵襲室的流體，并倒空到流出口孔。來自通過灌注障礙的流的營養(yǎng)物的擴散喂養(yǎng)細胞。這個通道刺激身體中的血流。在特定的示例實施例中，重力驅(qū)動流率被設(shè)置到~20 μl/天，其允許大于3天的連續(xù)流實驗而不重新填充孔。

如上陳述的，本文中提供的尺寸用于示例培養(yǎng)單元。根據(jù)各種特定的實施例，適合于特別的培養(yǎng)基或培養(yǎng)物品的任何尺寸可根據(jù)本文中提供的其它教導(dǎo)來使用。

4．侵襲化驗板

根據(jù)特定的實施例，如上所述的侵襲化驗單元被配置到標準培養(yǎng)孔板中以允許多個侵襲化驗實驗的同時運行。這些實驗可包括單個對象——相同或不同的組織樣品——的多個化驗、來自不同對象的多個化驗，并可包括將細胞暴露于不同的培養(yǎng)基、激素或其它刺激物、藥物、化學(xué)引誘劑等的化驗。

雖然示出在96孔板上的4孔化驗單元，但不同的單元大小和不同的培養(yǎng)板大小也可體現(xiàn)本發(fā)明，如從本文中提供的討論和在有關(guān)的并入的申請中將是清楚的。

圖2是用從頂部（A）和底部（B）獲取的圖像圖示填充有藍色染料的示例單流單元的照片，其中底部圖片通過在自上而下的方向上翻過板而被獲取，使得入口孔都在兩個圖片中的左側(cè)。

5．示例操作

圖3A-C是根據(jù)本發(fā)明的特定實施例的在裝有凝膠以示出按梯度的侵襲化驗操作和細胞遷移之后的侵襲室的區(qū)域的一系列顯微照片。與熒光染料（紅色）混合的基質(zhì)膠通過毛細管流裝載到裝載通道中并在37C下聚合15分鐘。圖3A圖示侵襲室的40倍放大，其示出凝膠填充裝載通道、侵襲障礙和侵襲室的部分。圖3B示出侵襲障礙的200倍放大。聚合凝膠可在侵襲障礙內(nèi)部以及在侵襲室中被看到。圖3C示出灌注障礙的200倍放大，其示出凝膠不能越過窄通道網(wǎng)絡(luò)。如將從本文中的教導(dǎo)進一步理解的，“凝膠”可具有在特定的實施例和特定的測試中降至流體粘度的各種粘度。在特定的實施例中，灌注障礙允許根據(jù)本發(fā)明使用較寬范圍的凝膠粘度。

圖4A-B是示出根據(jù)本發(fā)明的特定實施例的在化驗系統(tǒng)和裝置中的按梯度的癌細胞侵襲和細胞遷移的顯微照片。在該示例中，HT-1080侵襲性人類胸癌細胞被裝載在3D基質(zhì)膠中并灌注有包含10%血清的培養(yǎng)基。圖4A示出緊接著在凝膠的裝載和聚合之后的細胞位于侵襲障礙的底側(cè)上。圖4B示出在用包含培養(yǎng)基的血清（HT-1080侵襲的已知信號）的灌注培養(yǎng)的24小時之后的細胞，細胞中的一些細胞穿過基質(zhì)膠和侵襲障礙遷移以占據(jù)侵襲室。在40倍放大下用相襯獲取圖像。

在另外的實施例中，各種策略可用于移除在侵襲室中的所有細胞中的一些細胞，以進行另外的分析。根據(jù)特定的實施例，本發(fā)明還通過在維持細胞的侵襲室中提供培養(yǎng)環(huán)境來促進此，直到它們被移除。

在另外的實施例中，可通過如在本文中其它地方描述的空氣通路和氣孔來促進穿過限定微流控通道（諸如硅酮彈性體聚二甲基硅氧烷（PDMS））結(jié)構(gòu)的材料進入培養(yǎng)區(qū)中的空氣擴散。

如在其它地方討論的，可對如上所述的細胞培養(yǎng)區(qū)進行各種修改。各種配置對灌注障礙（諸如柵格狀通路結(jié)構(gòu)）是可能的。對于具有本文中提供的教導(dǎo)的本領(lǐng)域中的技術(shù)人員而言將暗示其它變化。

上面公開的結(jié)構(gòu)也可適于使用在標準微量滴定孔板或完全定制或部分定制的板上的更多或更少的孔的系統(tǒng)，諸如在所引用的文檔中和在本文中的其它示例中描述的系統(tǒng)。

如在本文中所述的板和系統(tǒng)可與如在上面引用的專利申請中描述的細胞培養(yǎng)區(qū)和侵襲室及微流控流結(jié)構(gòu)的其它配置一起使用。在一個修改的設(shè)計中，所提供的細胞培養(yǎng)區(qū)是本質(zhì)上矩形的細胞培養(yǎng)室。細胞培養(yǎng)室具有在右邊的細胞入口和出口通路，以及在右邊的流出口。在該示例中，細胞通路是成對的，其中中心對用于細胞流裝載，而在任一側(cè)上的對用作細胞流出口。

一旦細胞被裝載，在任何侵襲性細胞有足夠的時間來穿過侵襲障礙移動之后，侵襲化驗就如上面概述的繼續(xù)進行。

圖5A-B圖示根據(jù)本發(fā)明的特定實施例的具有多個入口的示例細胞培養(yǎng)室設(shè)計的配置和操作。該示例包括具有交叉艙口灌注通路設(shè)計的細胞/凝膠灌注障礙和如上面討論的侵襲障礙。交叉艙口設(shè)計允許在凝膠基質(zhì)中的細胞流到室中并允許培養(yǎng)基的灌注。雖然交叉艙口灌注障礙目前在一些設(shè)計中是優(yōu)選的，但根據(jù)特定的實施例也實現(xiàn)具有不同的灌注障礙或沒有灌注障礙的培養(yǎng)室。在培養(yǎng)基的通道周圍的流包括在障礙的同一側(cè)上的出口和入口。圖5A圖示一般實施例，其中出口和入口開口被示出在右邊。圖5B圖示左邊的入口通道和右邊的出口通道，該配置在使用如本文中所述的孔板的一些示例系統(tǒng)中更適合。該圖還提供根據(jù)本發(fā)明的特定實施例的樣品設(shè)計的詳細示例尺寸。因此在另外的實施例中，細胞培養(yǎng)室被修改以允許在3D凝膠基質(zhì)中的細胞的更容易培養(yǎng)。在這個設(shè)計中，灌注障礙分離如所示的細胞培養(yǎng)區(qū)和流通道。障礙被設(shè)計成將3D凝膠保持在培養(yǎng)室中。使障礙與上面描述的3通道細胞/凝膠入口設(shè)計耦合是提供改進的性能的重要特征。通過在障礙的每一側(cè)上具有分開的流入口/出口，可能將流體凝膠定位在培養(yǎng)室中，且不使它堵塞流通道。

如上所述的侵襲障礙被放置在由圖中的虛線指示的區(qū)域中，并用于使細胞進入和培養(yǎng)室與侵襲室分離，如從本文中的教導(dǎo)中將理解的。在替換的實施例中，可提供灌注通道，使得它們只相鄰于侵襲室。

如在其它地方討論的，在特定的實施例中，本發(fā)明提供了例如使用溫度敏感凝膠培養(yǎng)基質(zhì)（諸如Matrigel?、Geltrex?、骨膠原等）的生物細胞培養(yǎng)和侵襲化驗的3D凝膠環(huán)境。示例凝膠在4C下是液體，其例如在室溫或37C下聚合。在一個示例方法中，細胞最初與在冰上的細胞懸浮液混合。溶液然后被吸移到細胞入口孔中，并經(jīng)由毛細管流被運送到微流控室以及培養(yǎng)和侵襲室中。在特定的示例中，板被保持在室溫下。流率允許足夠的細胞/凝膠溶液在聚合之前完全填充培養(yǎng)室，同時細胞在流體流動期間由于侵襲通路的大小而不進入侵襲室中。灌注障礙防止任何凝膠溶液漏到流通道中。當凝膠變暖時，它聚合到半固體質(zhì)量中，其中細胞被嵌入培養(yǎng)區(qū)中。在流通道中的培養(yǎng)基的流通過侵襲室并通過凝膠擴散到細胞培養(yǎng)室中，并滋養(yǎng)細胞以進行培養(yǎng)，同時為侵襲性細胞提供引誘劑以穿過侵襲障礙移動到侵襲室。這個新穎設(shè)計允許本發(fā)明提供在微流控裝置中的3D凝膠培養(yǎng)系統(tǒng)，同時避免使凝膠堵塞流通道的問題。

在圖5B所示的示例中，藍色區(qū)指示空氣流，并且是可選的且不存在于所有實施例中。灰色區(qū)指示具有大約40 μm的示例高度的流通道，紅色區(qū)指示具有大約200 μm的示例高度的細胞培養(yǎng)和侵襲區(qū)，且綠色區(qū)指示具有大約2 μm的示例高度的灌注障礙。黃色侵襲障礙一般具有與培養(yǎng)區(qū)（例如200 μm）相同的高度或相似的高度，但將具有如上所述的侵襲障礙結(jié)構(gòu)。

一旦細胞被裝載，在任何侵襲性細胞有足夠的時間穿過侵襲障礙移動之后，侵襲化驗就如上概述的繼續(xù)進行。

3D凝膠系統(tǒng)

在有時在本文中被稱為3D:M的一個示例系統(tǒng)中，可在3D凝膠基質(zhì)中執(zhí)行細胞的多重灌注成像。示例板包含可裝有如用戶選擇的細胞/凝膠的24個獨立的培養(yǎng)單元。在示例系統(tǒng)中，板的每一行（A-H）包含3個完全獨立的流單元（每一個流單元有4個孔），其由培養(yǎng)基入口（例如列1、5、9）、細胞培養(yǎng)/侵襲/成像孔（例如列2、6、10）、細胞/凝膠入口（列3、7、10）和出口（列4、8、12）組成?？諝鈹U散通道（藍色）向細胞提供氣體轉(zhuǎn)移。入口被設(shè)計成允許培養(yǎng)基經(jīng)由重力驅(qū)動過程以40 μl/天連續(xù)流到細胞。在該示例中，每一個室在大小上是1.5 x 0.5 mm，具有200 μm的高度。灌注障礙確保通過凝膠基質(zhì)的均勻營養(yǎng)物轉(zhuǎn)移，且薄覆蓋玻璃底部（170 μm）允許最佳成像質(zhì)量。侵襲障礙提供在培養(yǎng)區(qū)域和侵襲區(qū)域之間的分離?？扇缭谏厦婧驮诓⑷氲膮⒖贾兴龅膱?zhí)行在這樣的系統(tǒng)中的3D凝膠裝載。

如在本文中的其它地方討論的，各種新穎微流控細胞培養(yǎng)室和相關(guān)聯(lián)的微流控結(jié)構(gòu)中的任何一個可根據(jù)本發(fā)明的特定實施例與孔滴定板裝置集成，如通常在宏細胞培養(yǎng)化驗中使用的。下面提供了很多特定的示例，雖然本發(fā)明包括用于與微流控裝置集成的其它系統(tǒng)。

在這個設(shè)計中，每一個培養(yǎng)單元由4個孔位置組成。第一孔用于灌注培養(yǎng)基，第二孔用于細胞入口，第三孔用于使微流控室成像，且第四孔是出口。細胞障礙/灌注通道將細胞定位到細胞區(qū)，并在連續(xù)灌注培養(yǎng)期間改進營養(yǎng)物運輸。細胞入口到出口路徑的低流體阻力使細胞能夠經(jīng)由重力或表面張力方法被快速裝載，而沒有外部細胞裝載機制。灌注入口流通道的高流體阻力允許經(jīng)由重力流的培養(yǎng)基的長期連續(xù)灌注，而沒有任何外部泵機制。侵襲障礙操作以使經(jīng)培養(yǎng)的細胞與侵襲區(qū)域分離，以進行侵襲化驗。

在示例特定系統(tǒng)中，細胞室被設(shè)計成模仿空隙組織環(huán)境，其中細胞被嵌入或覆蓋在生理細胞外基質(zhì)（ECM）中，并經(jīng)由擴散從連續(xù)灌注的毛細管通道被饋送。細胞微環(huán)境使得能夠進行在例如200微米厚凝膠層中的長期生長。氧合通道維持足夠的氣體運輸，且玻璃蓋玻片底部允許高質(zhì)量細胞成像。標準布局允許高級微流控單元恰好像典型96孔板一樣操作。重力驅(qū)動灌注設(shè)計消除了對泵或管道連接的需要，如上所述。

在示例系統(tǒng)中，每單元細胞的預(yù)期數(shù)量是大約500個細胞。示例灌注速率對于單個單元是40 ul/天。細胞室體積是150 nL，且室尺寸是1.5x0.5x0.2 mm。氣體擴散膜是具有底表面#1.5厚度蓋玻片的50 um硅酮。

用于連續(xù)灌注的開放頂部微流控細胞培養(yǎng)室也可使用使侵襲區(qū)與培養(yǎng)區(qū)分離的第二障礙被修改。

6．示例梯度培養(yǎng)室

圖6A-C圖示根據(jù)本發(fā)明的特定實施例的示例大致矩形的細胞培養(yǎng)室設(shè)計和梯度室設(shè)計的配置和操作。在示例設(shè)計中，所提供的細胞培養(yǎng)區(qū)是本質(zhì)上矩形的細胞培養(yǎng)室。如在圖6A和圖6B中圖示的細胞培養(yǎng)室具有在右邊示出的細胞入口和出口通路E2以及也在右邊示出的流出口E1。在該示例中，細胞通路是成對的，其中中心對用于細胞流裝載，且在任一側(cè)上的對用作細胞流出口。多個分離的流入口被示出在左邊，被標記為A1、A2、B1、B2、C1、C2，且在這個示例設(shè)計中流入口具有柵格圖案以防止被細胞堵塞?？諝鈹U散通道被示為圍繞室。出口E1提供部分地與培養(yǎng)室隔離的流體流的出口。

圖6B圖示如圖6A所示的培養(yǎng)單元的細胞裝載。細胞經(jīng)由低阻力流體路徑（具有流動路徑中的較高阻力）被裝載。細胞通過阻力比（細胞優(yōu)先流到細胞出口而不是流通道）被防止堵塞流路徑。在這個特別的實施例中的通道被布置成使得細胞進入和細胞出來通道在室的右側(cè)上。這導(dǎo)致唯一的特征，其中細胞的流進入室內(nèi)，進行180度轉(zhuǎn)彎，并流出來，如由圖6B所示的從細胞進入到細胞出來通路的急劇彎曲的流線圖示的。因此，根據(jù)本發(fā)明的特定實施例，細胞從一個或多個中心右通道被裝載（經(jīng)由毛細管力）并從頂部和底部右通道出來。非常少量的流朝著側(cè)出口通道被引導(dǎo)（圖6B所示的較長的較不彎曲的流線在室的左邊緣退出）。側(cè)流對于細胞裝載不是重要的，但用來幫助將細胞更均勻地分布在室中。由于流的低粘度，細胞自然停在室地面上，而不需要任何物理障礙。細胞出口路徑幫助使裝載變得對稱，以及增加裝載到室內(nèi)的細胞的數(shù)量。這個裝載機制可用于裝載細胞、微粒、珠子、凝膠、具有細胞的凝膠等。

圖6C示出諸如在圖6A-B中的設(shè)計的使用以在根據(jù)本發(fā)明的特定實施例的細胞培養(yǎng)室設(shè)計中建立穩(wěn)定的梯度。圖6C中的示例設(shè)計只稍微不同于圖6A-B的設(shè)計，且對本文中的這兩種設(shè)計之一描述的操作模式應(yīng)用于其它設(shè)計。在圖6C的示例中，細胞通路是不成對的。三個不成對的流入口被示出在左邊，且這些也具有柵格圖案來防止被細胞堵塞?？諝鈹U散通道一般被放置在室附近，雖然沒有在這個圖中示出。圖6C還圖示根據(jù)本發(fā)明的特定實施例在如上所述的微流控裝置中通過使2（或更多）種溶液流動來在培養(yǎng)室中創(chuàng)建梯度。

7．活動控制灌注板

圖7圖示用于微流控活細胞成像的示例定制板框架的機械附圖，并且其圖示了4個獨立的單元（例如行）、用于改進的光學(xué)器件的大成像窗口、空氣進入/出來口（例如相鄰于成像窗口）和在該示例中用來改進歧管的真空密封的孔之間的擴展空間。在該示例中，在具有2個出口孔（在該示例中，一個出口孔放大以容納更多的體積）的情況下存在每單元6個入口孔，。

圖8圖示根據(jù)特定實施例的每單元有三個流入口、成像窗口、細胞入口和流出口的2個培養(yǎng)單元板。

圖9圖示根據(jù)特定實施例的每單元有三個流入口、成像窗口、細胞入口和流出口的培養(yǎng)單元板的16單元版本。

圖10圖示根據(jù)本發(fā)明的特定實施例的具有氣體灌注線的示例板歧管的附圖。

圖11A-B是圖示根據(jù)特定實施例的具有四個獨立培養(yǎng)單元的活性控制板的示例的示意圖和照片，每一個培養(yǎng)單元具有6個流入口、培養(yǎng)室和兩個流出口。圖11A示出具有4個獨立流單元（板的行）的板設(shè)計，其具有6個入口溶液、開放室或其它培養(yǎng)室、出口和重力流通道。圖11B示出四個開放室（綠色圓圈），其具有在開放室之上的入口流和之下的出口流。該設(shè)計允許流從入口通傳遞到出口通道，而沒有溢出開放室。多個液體或試劑入口的可用性提供對活細胞成像和在細胞生物學(xué)中的其它實驗和化驗特別好的系統(tǒng)。在這樣的系統(tǒng)中，研究可研究胰臟或其它器官細胞或癌細胞的培養(yǎng)，以確定它們?nèi)绾螌Σ煌乃幬锘蚪?jīng)由入口引入的其它刺激物做出響應(yīng)。在這個設(shè)計的特定實施例中，重力孔也提供來在實驗被執(zhí)行之前促進維持（例如喂養(yǎng)）細胞。板可被密封到氣動歧管，從而允許對6個入口溶液的壓力驅(qū)動控制。這允許實驗，其中溶液在細胞上快速改變。由于在入口和培養(yǎng)室之間的大阻力區(qū)域，高達10 PSI的壓力驅(qū)動流是可能的，從而導(dǎo)致在室附近的小于輸入壓力的1/1000的壓力。

圖圖示了具有4個獨立單元（行）、6個上游入口（A1-A6、B1-B6、C1-C6、D1-D6）、帶有四個培養(yǎng)室的中央成像窗口、大出口孔（橢圓形，A7、B7、C7、D7）和重力灌注孔（最后一列，A8、B8、C8、D8）的活性控制板的布局。

圖12A-C是圖示根據(jù)特定實施例的具有四個獨立培養(yǎng)單元的另一示例培養(yǎng)板的圖，每一個培養(yǎng)單元具有可用于實踐在本文中描述的一個或多個方法的6個流入口、培養(yǎng)室和兩個流出口。在2010年6月首次銷售的這個板具有4個獨立的培養(yǎng)室（例如A-D），每一個培養(yǎng)室具有重力流入口（1）、四個溶液入口（2-5）、細胞入口（6）和兩個共享出口孔（7和8）。如在孔的每一行（A-D）中處理對應(yīng)的培養(yǎng)室。（b）所有四個培養(yǎng)室位于單個成像窗之下以最小化高放大相物鏡的行進距離。（c）室由在頂部和底部邊緣上的灌注障礙約束以分離室與流通道。入口孔2和3使培養(yǎng)基流到上通道中，而4和5使培養(yǎng)基流經(jīng)下通道。通過使不同成分的培養(yǎng)基同時流經(jīng)上和下通道來建立梯度。由于連續(xù)灌注，穩(wěn)定的梯度可被維持延長的時間段（> 2天）。

8．應(yīng)用注解，在微流控培養(yǎng)裝置中的穩(wěn)定梯度中的細胞遷移

一般，細胞遷移通過細胞與細胞外基質(zhì)（ECM）、相鄰細胞或化學(xué)引誘劑的交互作用而被引導(dǎo)和刺激。在胚胎形成期間，細胞遷移參與范圍從原腸形成到神經(jīng)發(fā)育的幾乎所有的形態(tài)成因過程。在成人有機體中，細胞遷移有助于生理和病理疾病，并且對影響傷口愈合和腫瘤轉(zhuǎn)移的治療學(xué)的發(fā)展是重要的。最終，可通過分析對遷移調(diào)節(jié)劑（抑制劑或活化劑）的細胞響應(yīng)來理解遷移的機制。因此，用于遷移細胞的量化和可視化的技術(shù)對生命科學(xué)研究已經(jīng)變得重要。

最廣泛接受的細胞遷移化驗是使用兩室多孔板的博伊登（Boyden）室化驗，其中在每一個孔中的膜提供在兩個室之間的多孔界面?；瘜W(xué)引誘劑被放置在下室中，且系統(tǒng)被允許平衡，其中期望的是，梯度將在上孔和下孔之間形成。然而實際上，非常陡的梯度可沿著垂直于膜的表面的單軸形成，導(dǎo)致在上孔和下孔之間的化學(xué)引誘劑濃度中的低于預(yù)期的差異。作為結(jié)果，該方法不適合于使特定的細胞響應(yīng)與特別的梯度特性（即，斜率、濃度、時間發(fā)展等）相關(guān)且不適合于研究多梯度信號積分。此外，梯度在“靜止”細胞培養(yǎng)狀況下不是非常穩(wěn)定的，從而阻止活細胞成像。

根據(jù)特定的實施例，諸如在上面的圖中示出的細胞培養(yǎng)室或系統(tǒng)還可用于創(chuàng)建在數(shù)天的過程期間對長期活細胞成像足夠穩(wěn)定的在數(shù)量上限定的擴散梯度。根據(jù)本文中描述的特定實施例和方法的板的這樣的微流控梯度培養(yǎng)室使得在整個灌注障礙上的精度控制的化學(xué)引誘劑擴散能夠在培養(yǎng)區(qū)中創(chuàng)建空間梯度。

根據(jù)特定的實施例，培養(yǎng)室的流入口和出口形成維持穩(wěn)定的濃度梯度分布幾天的連續(xù)流“無限源/匯點”。在上面的示例系統(tǒng)中的一些示例系統(tǒng)中，在梯度方向性中的改變開啟和關(guān)閉梯度并在梯度和單個溶液暴露之間切換是可能的。

根據(jù)另外的實施例，在穩(wěn)定的化學(xué)引誘劑梯度上的長期活細胞成像可用于研究惡性細胞或能夠移動或遷移的其它細胞。在下面討論的很多示例中，根據(jù)特定實施例的血清梯度對轉(zhuǎn)移性胸癌細胞遷移距離、速度和趨化性程度的影響被詳細地表征。

血清梯度對轉(zhuǎn)移性胸癌細胞遷移距離、速度和趨化性程度的影響

在一個示例實驗中，MDA-MB-231 (HTB-26?, ATCC?)、從轉(zhuǎn)移性胸膜溢出部位得到的人類胸癌系被維持在完全培養(yǎng)基（用1O°/ov/v胎牛血清（FBS）、1%非必需氨基酸、2 mM L-谷氨酰胺和抗生素（全EMD微孔）補充的杜氏改良培養(yǎng)基（DMEM））中，并通過胰蛋白酶消化（TrypLE?Select, GIBCO）常規(guī)地傳代以確保對數(shù)期生長。

對于實驗，細胞被胰蛋白酶化、通過離心法被收獲并在完全培養(yǎng)基中重新懸浮。10 uL的每一個細胞樣品與190 uL的guava ViaCount?試劑（EMD微孔）混合并在室溫（RT）下培養(yǎng)5分鐘。樣品數(shù)據(jù)在guava easyCyte? HT儀器上被獲取并使用guava ViaCount?軟件（EMD微孔）被分析。

圖13圖示根據(jù)特定實施例的在暴露于穩(wěn)定梯度之后的細胞遷移的一個示例。在這個特定的示例中，示出在使用上面描述的多個梯度培養(yǎng)室之一暴露于穩(wěn)定的FBS梯度之后的MDA-MB-231細胞遷移。這個示例示出來自細胞室的代表性圖像（10倍放大率），其中細胞在完全培養(yǎng)基中被培養(yǎng)并暴露于沿著Y軸（垂直平面）建立的0-10% FBS梯度。頂面板包含在細胞裝載之后24小時捕獲的圖像。中間面板示出裝載后96小時的細胞；培養(yǎng)時間在完全培養(yǎng)基中分成三天，后面是24小時的血清饑餓（無FBS）。從圖像中明顯的是，細胞膨脹和移動都在三天間隔期間出現(xiàn)。在底面板中的圖像在梯度引入之后12小時被獲取。

圖13示出在三天的過程中響應(yīng)于FBS梯度的單MDA-MB-231細胞的遷移。細胞膨脹和移動都在頂部行和中間行之間在三天間隔期間出現(xiàn)。在底面板中的圖像在梯度引入后12小時被獲取。一般，對于暴露于FBS梯度的那些培養(yǎng)物，存在細胞沿著Y軸朝著細胞室的上部障礙的明顯移動。相反，在沒有空間血清梯度時培養(yǎng)的控制細胞以多得多的隨機方向性質(zhì)展示較少的移動。在中間和底面板中的框（編號為1-8）用于識別特定的細胞并展示它們在12小時時間幀內(nèi)的總移動。總的來說，暴露于FBS梯度的細胞傾向于優(yōu)先朝著較高的FBS濃度的源移動。

圖14作為示例圖示根據(jù)特定實施例的用來更好地說明梯度對在微流控細胞培養(yǎng)裝置中的細胞移動的影響的示例X/Y細胞遷移繪圖。在該示例中，該繪圖是用來圖示在微流控培養(yǎng)單元中的穩(wěn)定梯度（例如在MDA-MB-231上的FBS梯度）對細胞移動的影響的X/Y遷移繪圖。在這個特定示例中示出的是四個繪圖：（a）0/0 FBS（無梯度），（b）10/10 FBS（無梯度），（c）10/0 FBS（底部到頂部梯度），以及（d）0/10 FBS（頂部到底部梯度）。對于這個特別的示例，每一個數(shù)據(jù)集合從來自單個細胞培養(yǎng)室的50個代表性細胞得到，對于時間推移視頻（12小時）的最初36個圖像幀，這50個代表性細胞被跟蹤。在每一個繪圖中，黑線和紅線指定相對于Y軸分別擁有凈“向上”或“向下”移動的細胞。

圖像J軟件用于跟蹤在各種培養(yǎng)條件下個別細胞的遷移性質(zhì)。在這些示例中的一些示例中，50個細胞被監(jiān)控總共12個小時；將結(jié)果呈現(xiàn)在圖14的X/Y繪圖中。分析示出了：（1）細胞傾向于在穩(wěn)定培養(yǎng)基中比在暴露于營養(yǎng)物梯度時移動少得多的程度，以及（2）當梯度在培養(yǎng)室內(nèi)被建立時，細胞遷移明顯更受引導(dǎo)。

為了區(qū)分朝著FBS的趨化性與無方向性遷移，我們與y軸（平行于梯度）移動分開地分析了在x方向（垂直于梯度）上的移動（圖6）。顯著的趨化性只由暴露于FBS梯度（10/0 FBS A-C和0/10 FBS）的細胞展示。在空間恒定的FBS中的細胞展示非常小的總移動。

圖15作為示例圖示根據(jù)特定實施例的作為在微流控細胞培養(yǎng)裝置中行進的距離的函數(shù)的示例細胞遷移。在這個示例中，示出作為所行進的距離的函數(shù)的MDA-B-231細胞遷移。對于六個條件中的每一個條件（對于每一個條件，n = 50個代表性細胞），所遷移的平均距離（以μm為單位）被測量為總距離（a）和歐幾里得距離（b）的函數(shù)，其中后者表示從開始到結(jié)束位置的直線。

使用從遷移繪圖計算的遷移距離，在圖15A中示出相對于梯度條件的總遷移距離和歐幾里得距離。如所示，與在穩(wěn)定環(huán)境中的細胞比較，針對梯度培養(yǎng)存在所行進的總距離的小的增加。有趣地，在0/0（血清饑餓）和10/10（完全培養(yǎng)基）條件之間幾乎不存在差異。相反，當凈（歐幾里得）距離在圖15B中被評估時，大差異在這兩個條件（穩(wěn)定相對于梯度）之間被找到。在這種情況下，暴露于FBS梯度的細胞比在恒定的培養(yǎng)基狀態(tài)中的那些細胞遷移得離其起源部位3倍遠。這樣的發(fā)現(xiàn)暗示細胞在梯度的高FBS濃度端處主動尋求富含營養(yǎng)物的培養(yǎng)基，且因此展示更大程度的方向性遷移。

圖16作為示例圖示根據(jù)特定實施例示出在微流控細胞培養(yǎng)裝置中暴露于穩(wěn)定梯度的細胞比在穩(wěn)定培養(yǎng)基環(huán)境中的細胞移動得更快的繪圖。這個示例示出在一些情況下，暴露于梯度（例如FBS）的細胞比在穩(wěn)定培養(yǎng)基環(huán)境中的那些細胞移動得更快。這個圖表展示在該示例中在四個培養(yǎng)條件當中的遷移速度（μm/min）中的差異?；谒w移的平均總距離來計算速度。

通常，細胞以稍微更高的速度在建立了FBS梯度的室中遷移，。有名地，在四個梯度培養(yǎng)物之一（10/0 FBS（Q））中的遷移細胞比其它示例展示大得多的遷移速度。從在這個實驗期間進行的觀察中，存在兩個因素，其可潛在地有助于加速的細胞遷移：（1）細胞在較低細胞密度的培養(yǎng)物中傾向于遷移得更遠，以及（2）細胞群的成員傾向于比隔離的配對物遷移得更快。這后一響應(yīng)潛在地由在微環(huán)境內(nèi)的局部化細胞間通信引起，如前面在分析細胞間交互作用和遷移速率之間的關(guān)系的研究中報告的。

圖17圖示示出根據(jù)特定實施例的對梯度的暴露刺激細胞朝著高濃度匯點的主動遷移的一個示例。在該示例中，對FBS梯度的暴露刺激MDAMB-231細胞朝著高濃度匯點的主動遷移。遷移索引提供在X（垂直于梯度）和Y（平行于梯度）方向上的細胞的移動（相對于它們的原點位置）的測量。對于六個化驗中的每一個化驗，兩個平面移動的值都被顯示（每一個條表示在單個細胞室內(nèi)的50個個別跟蹤的細胞的平均值）。

示例建立

在上面描述的特定實驗之前，在細胞培養(yǎng)室內(nèi)的環(huán)境溫度使用CellASIC? ONIX微培養(yǎng)箱控制器、溫度校準板和DirecTemp?溫度監(jiān)控軟件（EMD微孔）被校準到37 ℃。細胞室使用磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）溶液來弄整齊，磷酸鹽緩沖鹽水溶液從CellASIC?板的孔1、6、7和8被吸出，且10 uL培養(yǎng)基被吸移到孔6中。該過程對微板上的全室單元重復(fù)。板被真空密封到F84歧管。通過使用CellASIC? ONIX FG軟件，培養(yǎng)基被設(shè)置成以0.25 psi從孔6灌注2分鐘。

對于細胞裝載，胰蛋白酶化的MDA-MB-231細胞以2 x 10⁶/mL的速度重新懸浮在完全培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基從孔1和6中的PTFE環(huán)吸出?？?用10 uL培養(yǎng)基代替，且孔6用10 uL的細胞懸浮液代替。板被真空密封到F84歧管并被放置在EVOS?fl倒置顯微鏡（高級顯微鏡檢查組）的臺上以監(jiān)控裝載過程。使用CellASIC? ONIX FG軟件通過以0.4 psi同時從孔1和6流動0.3分鐘（18秒）來裝載細胞。板被放置在標準37 ^#C / 5% C0₂培養(yǎng)箱中一個小時以在自動培養(yǎng)基灌注之前允許細胞附著。

對于這些示例實驗，每一個實驗涉及三個不同的階段——完全培養(yǎng)基饋送（從入口孔2和4，以1 psi流動48小時）、血清饑餓（從入口孔3和5，以1 psi流動24小時）和暴露于0-10% FBS梯度。為了建立在培養(yǎng)室內(nèi)的梯度，300 uL完全培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基減FBS分別被裝載到入口孔2和4內(nèi)，并以1 psi同時流動。在特定實例中，在24小時之后，梯度的定向通過切換源孔而反轉(zhuǎn)以進行灌注。在這種情況下，完全培養(yǎng)基減FBS和完全培養(yǎng)基分別被裝載到孔3和5內(nèi)，并以1 psi同時流動。使用CellASIC? ONIX微流控系統(tǒng)來完成在這個系統(tǒng)中的培養(yǎng)基灌注。

在10倍放大率下使用EVOS?fl倒置顯微鏡來捕獲圖像。在每一個實驗的FBS梯度部分期間執(zhí)行時間推移成像；在梯度暴露時間的長度內(nèi)以20分鐘間隔捕獲圖像。結(jié)合手動跟蹤（NIH）和趨化性工具（ibid.）插件使用圖像J軟件（NIH）來分析來自MDA-MV-231細胞遷移化驗的圖像。在每一種情況下，針對在整個連續(xù)的一系列36個圖像（在培養(yǎng)中12個小時）上的遷移性質(zhì)跟蹤50個代表性細胞。

實驗展示了在高度控制的細胞遷移研究期間的實時活細胞成像可用于觀察并研究在成為病理現(xiàn)象（諸如傷口愈合和腫瘤轉(zhuǎn)移）的基礎(chǔ)的機制中涉及的細胞的遷移和侵襲過程。

9．氣動歧管

雖然重力或被動裝載對一些微流控細胞培養(yǎng)裝置是有效的且在一些實施例中是期望的，如在本文中和在上面引用的申請中所述的專用氣動歧管可與板匹配，且氣動壓力可施加到細胞入口區(qū)，以進行細胞裝載并進行在侵襲化驗期間的培養(yǎng)。

根據(jù)本發(fā)明的另外的實施例，新穎的細胞裝載系統(tǒng)使用氣動歧管和氣動壓力來將細胞放置在微培養(yǎng)區(qū)中。在添加這個細胞裝載系統(tǒng)的情況下，可使用存在來處理標準滴定板的其它自動化裝置來完全自動化微流控細胞培養(yǎng)和分析。

在另外的實施例中，本發(fā)明涉及允許控制用于附著細胞的長期時間推移顯微鏡檢查的細胞培養(yǎng)環(huán)境的微流控系統(tǒng)。因為朝著“系統(tǒng)生物學(xué)”的趨勢繼續(xù)，研究在個別的活細胞中的動態(tài)行為以及改進高吞吐量活細胞篩選的功能和經(jīng)濟性將變得日益重要。根據(jù)本發(fā)明的特定實施例，本發(fā)明提供了允許在其它化驗當中的時間推移顯微鏡檢查實驗的多重微流控流動室。微流控室使用人工內(nèi)皮障礙來使細胞與流通道分離。裝置被格式化到標準孔板，從而允許液體和細胞樣品使用標準裝置被直接吸移到適當?shù)娜肟趦ζ髦?。定制氣動流控制器然后用于將細胞裝載到培養(yǎng)區(qū)域內(nèi)以及在不同的暴露溶液之間切換。數(shù)字軟件接口可用于允許用戶對特定的輸入（脈沖、斜面等）隨著時間的編程以在時間推移成像期間將細胞暴露于復(fù)雜功能。

在活細胞中的動態(tài)響應(yīng)是用于現(xiàn)象（諸如生物信號處理、基因表達調(diào)節(jié)、區(qū)分和細胞分裂）的基礎(chǔ)。在特定的實施例中，本發(fā)明涉及能夠以與當前細胞培養(yǎng)方法兼容的多重格式控制細胞微環(huán)境的系統(tǒng)。細胞響應(yīng)可使用高放大率熒光顯微鏡檢查來量化以得到具有亞細胞分辨率的動力學(xué)信息。這個能力在細胞系統(tǒng)中有廣泛的應(yīng)用。

圖18A-C示出根據(jù)本發(fā)明的特定實施例的示例歧管的示意圖的頂視圖、側(cè)視圖和平面視圖。在該示例中，右邊的八個管道線用于壓縮的空氣，且每一個管道線被配置成向微流控陣列中的細胞入口孔的列提供壓力。在圖中最左邊的線用于真空并連接到在歧管周圍的外部真空環(huán)?？椎拿恳涣幸话氵B接到單個壓力線，其中在成像區(qū)域之上的孔被跳過。歧管被放置在標準孔板或板的其它配置的頂部上。橡膠墊圈位于板和歧管之間，其中孔與歧管（未示出）匹配。真空線在孔之間的腔中創(chuàng)建真空，從而將板和歧管保持在一起。壓力被施加到孔以將液體驅(qū)動到微流控通道（未示出）中。使用1 psi的典型壓力，因此真空強度足以維持氣密密封。在一個示例中存在到壓力控制器的9個管道線：8個線用于壓縮空氣，以及1個線用于真空（最左邊）。在特定的示例實施例中，每一列連接到單個壓力線。在細胞成像區(qū)之上的列被跳過。

在根據(jù)本發(fā)明的特定實施例的系統(tǒng)中的增壓細胞裝載被發(fā)現(xiàn)在制備聚集的細胞（例如實心腫瘤、肝、肌肉等）的培養(yǎng)物中特別有效。增壓細胞裝載也允許具有細長培養(yǎng)區(qū)的結(jié)構(gòu)有效地被裝載。用于細胞裝載的增壓歧管和用于灌注操作和侵襲化驗的被動流的使用允許本發(fā)明利用相當簡單的兩入口設(shè)計，而不需要如在其它設(shè)計中使用的附加的入口孔和/或閥。

修改的歧管

在另外的實施例中，板歧管包括用于將細胞浸在具有特定的氣體環(huán)境（例如5% CO₂）的微流控裝置中的附加“氣體管線”。其它示例包括氧和氮控制，但任何氣態(tài)混合物可被發(fā)送到細胞。氣體通過歧管流到在細胞培養(yǎng)區(qū)之上的密封孔中，并且在微流控裝置中的孔使氣體能夠流到指定的微流控空氣通道中，如上所述。氣體可透過裝置層（PDMS）在暴露細胞之前允許氣體擴散到培養(yǎng)基中。通過使氣體連續(xù)流經(jīng)微流控板，穩(wěn)定的氣體環(huán)境被維持。

這提供用于控制氣體環(huán)境以將微流控板放置在培養(yǎng)箱中的可選裝置。在這個修改的歧管中，歧管可用于獨立于周圍空氣而創(chuàng)建“微培養(yǎng)箱”。

圖19圖示根據(jù)本發(fā)明的特定實施例的用于操作微流控板的示例系統(tǒng)和歧管。

10．自動化系統(tǒng)

因為板被設(shè)計成使用符合SBS的儀器來處理，各種“現(xiàn)成的”機器可用于創(chuàng)建自動化系統(tǒng)。這個示意圖示出這如何被完成的示例。機器人臂（板處理器）將微流控板從一個臺移動到另一臺。自動化培養(yǎng)箱在適當?shù)臏囟群蜌怏w環(huán)境下存儲板，以進行經(jīng)由重力流的長期灌注。吸移管管理器將液體（培養(yǎng)基、藥物、化驗試劑等）分配到入口孔，并從出口孔移除液體。板閱讀器用于化驗。細胞裝載器可選地用于在實驗開始時將細胞引入微流控化驗中。特別是，細胞裝載器一般不是“現(xiàn)成的”，并通過將氣動壓力施加到陣列板的指定孔以引起流來操作。標準或定制計算機軟件可用來使操作完整。

基本過程包括：1）將板從培養(yǎng)箱移除，2）經(jīng)由吸移管管理器將液體從出口孔移除，3）從“板疊層”移動培養(yǎng)基/藥物存儲板，4）經(jīng)由吸移管管理器將液體從培養(yǎng)基/藥物板轉(zhuǎn)移到微流控板，5）將微流控板放置在培養(yǎng)箱中，6）對每一個板進行重復(fù)，7）在指定的時間間隔（例如24小時）之后重復(fù)。

96孔板標準允許微流控系統(tǒng)使用標準技術(shù)和裝置來操作。例如，液體分配用標準吸移管機械來實現(xiàn)，且細胞培養(yǎng)和分析與現(xiàn)有的培養(yǎng)箱和板閱讀器兼容。定制建立的細胞裝載系統(tǒng)可用于使用如上所述的空氣壓力來裝載細胞。重力驅(qū)動流培養(yǎng)配置利用在入口和出口孔之間的培養(yǎng)基水平差以及設(shè)計流體阻力來實現(xiàn)在nL/min狀況的期望流率。這提供能夠“被動地”使培養(yǎng)基流動長時間段（例如多達4天）的顯著優(yōu)點，而不使用龐大的外部泵。

集成系統(tǒng)

用于細胞和其它數(shù)據(jù)的收集和分析以及用于本發(fā)明的數(shù)據(jù)庫的編譯、存儲和訪問的集成系統(tǒng)一般包括數(shù)字計算機，其具有包括用于序列搜索和/或分析的指令集的軟件，和可選地高吞吐量樣品控制軟件、圖像分析軟件、已收集數(shù)據(jù)解釋軟件、用于將溶液從源轉(zhuǎn)移到目的地（諸如檢測裝置）的可操作地鏈接到數(shù)字計算機的機器人控制電樞、用于將主題數(shù)據(jù)輸入到數(shù)字計算機或用來控制分析操作或由機器人控制電樞進行的高吞吐量樣品轉(zhuǎn)移的輸入裝置（例如計算機鍵盤）。可選地，集成系統(tǒng)還包括閥、濃度梯度、流體多重通道和/或用于與如所述的微室交互作用的其它微流控結(jié)構(gòu)。

使用標準操作系統(tǒng)的容易可得的計算硬件資源可被采用并根據(jù)本文中提供的教導(dǎo)而被修改，例如在本發(fā)明的集成系統(tǒng)中使用的PC（英特爾x86或兼容奔騰芯片的DOS?、OS2?、WINDOWS?、WINDOWS NT?、WINDOWS95?、WINDOWS98?、LINUX或甚至Macintosh、Sun 或PCs將足夠了）。在軟件技術(shù)中的當前技術(shù)足以允許在計算機系統(tǒng)上實現(xiàn)本文中教導(dǎo)的方法。因此，在特定的實施例中，本發(fā)明可包括用于執(zhí)行如在本文中教導(dǎo)的方法中的一種或多種方法的一組邏輯指令（軟件或硬件編碼的指令）。例如，用于提供數(shù)據(jù)和/或統(tǒng)計分析的軟件可由技術(shù)人員使用標準編程語言（諸如Visual Basic、Fortran、Basic、Java等）來構(gòu)造。這樣的軟件也可利用多種統(tǒng)計編程語言、工具箱或庫來構(gòu)造。

圖21示出可被理解為可從介質(zhì)717和/或網(wǎng)絡(luò)端口719讀取指令的邏輯設(shè)備的信息儀器（或數(shù)字裝置）700，網(wǎng)絡(luò)端口719可以可選地連接到具有固定介質(zhì)722的服務(wù)器720。設(shè)備700可在下文中使用那些指令來指導(dǎo)服務(wù)器或客戶端邏輯，如在本領(lǐng)域中理解的，以體現(xiàn)本發(fā)明的方面?？审w現(xiàn)本發(fā)明的一種類型的邏輯設(shè)備是如在700中所示的計算機系統(tǒng)，其包含CPU 707、可選的輸入裝置709和711、磁盤驅(qū)動器715和可選的監(jiān)視器705。固定介質(zhì)717或在端口719之上的固定介質(zhì)722可用于對這樣的系統(tǒng)編程并可表示磁盤型光或磁介質(zhì)、磁帶、固態(tài)動態(tài)或靜態(tài)存儲器等。在特定的實施例中，本發(fā)明可全部或部分地體現(xiàn)為被記錄在這個固定介質(zhì)上的軟件。通信端口719也可用于最初接收用來對這樣的系統(tǒng)編程并可表示任何類型的通信連接的指令。

各種編程方法和算法——包括遺傳算法和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)——可用于執(zhí)行數(shù)據(jù)收集、關(guān)聯(lián)和存儲功能以及其它期望功能的方面，如在本文中所述的。此外，數(shù)字或模擬系統(tǒng)（諸如數(shù)字或模擬計算機系統(tǒng)）可控制多種其它功能，諸如輸入和輸出文件的顯示和/或控制。用于執(zhí)行本發(fā)明的電氣分析方法的軟件也包括在本發(fā)明的計算機系統(tǒng)中。

其它實施例

雖然已經(jīng)在各種特定的實施例方面描述了本發(fā)明，但意圖不是本發(fā)明被限制到這些實施例。在本發(fā)明的精神內(nèi)的修改對本領(lǐng)域中的技術(shù)人員而言將是明顯的。

理解的是，本文中描述的示例和實施例是為了例證性目的，以及根據(jù)其的各種修改或改變對本領(lǐng)域中的技術(shù)人員而言將通過本文中的教導(dǎo)來暗示，且將被包括在本申請的精神和范圍以及權(quán)利要求的范圍內(nèi)。

在本文中引用的或與這個提案一起提交的所有公布物、專利和專利申請——包括作為信息公開陳述的部分被提交的任何參考資料——通過引用被全部并入。