本發(fā)明屬于基因工程及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及CRISPR/Cas9特異性修飾人長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)-UCA1及PD-1多個(gè)基因靶點(diǎn)的創(chuàng)新設(shè)計(jì)，通過靶向敲除lncRNA UCA1的表達(dá)抑制膀胱癌細(xì)胞生長(zhǎng)，聯(lián)合應(yīng)用免疫基因(PD-1/PDL-1)治療策略可以增強(qiáng)膀胱癌的治療效果，是靶向免疫基因治療膀胱癌的新策略。

背景技術(shù)：

近年來，基因組編輯工具已被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，能夠通過改變目的基因的表達(dá)、闡明基因的功能并試圖用于臨床疾病的治療。其中，成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(CRISPR)技術(shù)由于能快速、簡(jiǎn)便、高效地靶向基因組任何基因，具有容易操作、可以同時(shí)靶向多個(gè)基因、高通量制備、造價(jià)低等特點(diǎn)而成為編輯基因的首選技術(shù)。CRISPR是自然存在于細(xì)菌DNA中的序列，與CRISPR相關(guān)核酸酶(Cas)結(jié)合，具有指導(dǎo)RNAs保護(hù)細(xì)菌基因組免受侵入性噬菌體中檢測(cè)到的靶向特異性序列攻擊的作用。該項(xiàng)技術(shù)經(jīng)過不斷改進(jìn)成為2015年科學(xué)雜志評(píng)選的十大發(fā)現(xiàn)之首，將成為功能基因組學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)領(lǐng)域中強(qiáng)有力的研究工具。

膀胱癌是我國最常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，治療后很容易復(fù)發(fā)并對(duì)治療藥物產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致患者預(yù)后不佳，5年生存率僅為50％。因此，探索膀胱癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，尋找特異性診斷標(biāo)志物和有效的治療靶點(diǎn)有望提高膀胱癌患者的生存率。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)參與人細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和代謝的調(diào)節(jié)，其表達(dá)異常與多種疾病發(fā)生有關(guān)，包括惡性腫瘤，并且可能作為某些腫瘤的特異性標(biāo)志物。故闡明這些非編碼RNA分子的功能不僅有助于揭示腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，還可以鑒定出具有臨床潛在應(yīng)用價(jià)值的分子靶點(diǎn)。尿路上皮癌相關(guān)基因1(urothelial cancer associated 1,UCA1)是采用抑制消減雜交技術(shù)分析膀胱癌細(xì)胞株BLS-211和BLZ-211而首先確定的lncRNA,其長(zhǎng)度為1442bp，位于人染色體19p13,12，有3個(gè)外顯子，定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。lncRNA-UCA1在人胚胎組織廣泛表達(dá)而在成體絕大多數(shù)正常組織中不表達(dá)，在膀胱癌組織中表達(dá)上調(diào)但在正常膀胱和腎組織良性增生的前列腺組織腎癌組織均不表達(dá)，其與人膀胱癌的發(fā)生發(fā)展、腫瘤細(xì)胞耐藥和代謝改變有關(guān)。其他研究者還發(fā)現(xiàn)lncRNA-UCA1在其他腫瘤組織中普遍表達(dá)，如結(jié)腸癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、食管癌等。這些結(jié)果證明lncRNA-UCA1表達(dá)改變參與了包括人膀胱癌在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。

程序性死亡因子-1(programmed death-1,PD-1)作為近年發(fā)現(xiàn)的CD28家族新成員，常在活化的淋巴細(xì)胞呈現(xiàn)高水平表達(dá)。PD-1與其配體PDL-1結(jié)合，通過阻斷CD28分子介導(dǎo)激活PI3K(phsphatidylinositol 3-kinase,磷酸肌醇3激酶)途徑，抑制T淋巴細(xì)胞的增殖和分化，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其在腫瘤免疫應(yīng)答過程中與病程進(jìn)展中起到了重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)兩個(gè)針對(duì)程序性死亡-1(PD-1/PDL-1)分子通路起作用的藥物，Keytruda(pembrolizumab)和MPDL3280A對(duì)晚期尿路上皮癌有明顯的治療作用。還有證據(jù)表明免疫系統(tǒng)對(duì)肌肉浸潤(rùn)性尿路上皮膀胱癌比較活躍，PD-1及配體相互作用的抑制可恢復(fù)抗腫瘤T細(xì)胞活性，增強(qiáng)細(xì)胞免疫對(duì)抗原的攻擊，提高人膀胱癌的治療效果。

脂質(zhì)體是具有良好的生物相容性的傳遞載體，其表面修飾配體是構(gòu)建主動(dòng)靶向脂質(zhì)體的重要方式。細(xì)胞穿膜肽(TAT)能夠穿過與之接觸的任何細(xì)胞的細(xì)胞膜，而對(duì)細(xì)胞膜沒有損傷，因而可以應(yīng)用設(shè)計(jì)的靶向腫瘤細(xì)胞給藥(如TAT修飾包裹靶向lncRNA-UCA1基因的sgRNA質(zhì)粒的脂質(zhì)體)方式抑制lncRNA-UCA1基因的表達(dá)，治療該基因異常表達(dá)的惡性腫瘤。

現(xiàn)在人膀胱癌治療存在的問題：(1)患者治療后常易復(fù)發(fā)；(2)藥物治療后容易產(chǎn)生耐藥性；(3)靶向人膀胱癌致癌基因的治療藥物很少，效果有限，副作用較明顯；(4)需要聯(lián)合用藥治療膀胱癌以提高治療效果，改善患者的預(yù)后。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供靶向人lncRNA-UCA1抑制膀胱癌的sgRNA、基因載體及其應(yīng)用。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：

靶向人lncRNA-UCA1抑制膀胱癌的sgRNA，該抑制膀胱癌的sgRNA包括在CRISPR-Cas9特異性修飾lncRNA-UCA1基因中可特異性靶向人lncRNA-UCA1基因的sgRNA，該sgRNA的序列如SEQ.ID.NO.4或SEQ.ID.NO.5所示。

靶向人lncRNA-UCA1抑制膀胱癌的基因載體，該基因載體選自重組質(zhì)粒pGL3-U6-UCA1 sgl、pGL3-U6-UCA1 sg2中的一種，pGL3-U6-UCA1 sgl由序列如SEQ.ID.NO.4所示的sgRNA的寡聚核苷酸雙鏈與線性化pGL3-U6-sgRNA質(zhì)粒連接獲得，pGL3-U6-UCA1 sg2由序列如SEQ.ID.NO.5所示的sgRNA的寡聚核苷酸雙鏈與線性化pGL3-U6-sgRNA質(zhì)粒連接獲得，通過連接使SEQ.ID.NO.4或SEQ.ID.NO.5所示序列插入至pGL3-U6-sgRNA質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)內(nèi)，或者，該基因載體為構(gòu)建于用于表達(dá)核酸酶Cas9的質(zhì)?；A(chǔ)上的重組質(zhì)粒，構(gòu)建方法為在所述用于表達(dá)核酸酶Cas9的質(zhì)粒的多克隆 位點(diǎn)內(nèi)分別插入有如SEQ.ID.NO.4、SEQ.ID.NO.5所示序列中的一種或兩種。

靶向人lncRNA-UCA1抑制膀胱癌的基因載體組合物，該組合物包括pGL3-U6-UCA1 sg質(zhì)粒，所述pGL3-U6-UCA1 sg質(zhì)粒選自重組質(zhì)粒pGL3-U6-UCA1 sgl、pGL3-U6-UCA1 sg2中的一種或兩種，pGL3-U6-UCA1 sgl由序列如SEQ.ID.NO.4所示的sgRNA的寡聚核苷酸雙鏈與線性化pGL3-U6-sgRNA質(zhì)粒連接獲得，pGL3-U6-UCA1 sg2由序列如SEQ.ID.NO.5所示的sgRNA的寡聚核苷酸雙鏈與線性化pGL3-U6-sgRNA質(zhì)粒連接獲得，通過連接使SEQ.ID.NO.4或SEQ.ID.NO.5所示序列插入至pGL3-U6-sgRNA質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)內(nèi)。

所述pGL3-U6-UCA1 sgl與pGL3-U6-UCA1 sg2的質(zhì)量比為(1～2):(1～2)。

所述組合物還包括pGL3-U6-PD1 sg質(zhì)粒，所述pGL3-U6-PD1 sg質(zhì)粒選自重組質(zhì)粒pGL3-U6-PD1-1 sg、pGL3-U6-PD1-2 sg中的一種或兩種，pGL3-U6-PD1-1 sg由序列如SEQ.ID.NO.6所示的sgRNA的寡聚核苷酸雙鏈與線性化pGL3-U6-sgRNA質(zhì)粒連接獲得，pGL3-U6-PD1-2 sg由序列如SEQ.ID.NO.7所示的sgRNA的寡聚核苷酸雙鏈與線性化pGL3-U6-sgRNA質(zhì)粒連接獲得，通過連接使SEQ.ID.NO.6或SEQ.ID.NO.7所示序列插入至pGL3-U6-sgRNA質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)內(nèi)。

所述pGL3-U6-UCA1 sg質(zhì)粒與pGL3-U6-PD1 sg質(zhì)粒的質(zhì)量比為(1～3):(1～2)；所述pGL3-U6-PD1-1 sg與pGL3-U6-PD1-2 sg的質(zhì)量比為(1～2):(1～2)。

所述組合物還包括用于表達(dá)核酸酶Cas9的質(zhì)粒，所述用于表達(dá)核酸酶Cas9的質(zhì)粒:pGL3-U6-UCA1 sg質(zhì)粒的質(zhì)量比為(1～4):(1～3)，所述用于表達(dá)核酸酶Cas9的質(zhì)粒:pGL3-U6-UCA1 sg質(zhì)粒:pGL3-U6-PD1 sg質(zhì)粒的質(zhì)量比為(1～4):(1～3):(1～2)。

上述靶向人lncRNA-UCA1抑制膀胱癌的sgRNA在制備用于治療人膀胱癌的藥物中的應(yīng)用。

上述靶向人lncRNA-UCA1抑制膀胱癌的基因載體組合物在制備用于治療人膀胱癌的藥物中的應(yīng)用。

可特異性靶向人PD-1基因的sgRNA在制備用于治療人膀胱癌的藥物中的應(yīng)用，所述的應(yīng)用包括僅使用所述可特異性靶向人PD-1基因的sgRNA或者與可特異性靶向人lncRNA-UCA1基因的sgRNA聯(lián)合使用。

本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：

本發(fā)明提出了適合CRISPR-Cas9靶向剪輯的lncRNA-UCA1基因的sgRNA序列，其與CRISPR-Cas9靶向剪輯的人PD-1基因的sgRNA序列，可用于構(gòu)建表達(dá)抑制人 lncRNA-UCA1和人PD-1基因的sgRNA質(zhì)粒載體，共同轉(zhuǎn)入膀胱癌移植瘤小鼠體內(nèi)，可以明顯降低lncRNA-UCA1的表達(dá)，并抑制腫瘤的生長(zhǎng)。本發(fā)明基因載體制備的方法步驟簡(jiǎn)單、sgRNA靶向性好，CRISPR-Cas9系統(tǒng)的敲除效率高。

本發(fā)明制備的特異性靶向人膀胱癌lncRNA-UCA1和PD-1基因的sgRNA載體，不僅能夠精確靶向剪接人膀胱癌lncRNA-UCA1和PD-1基因，高效降低人膀胱癌lncRNA-UCA1的基因表達(dá)，聯(lián)合應(yīng)用可以明顯抑制腫瘤的生長(zhǎng)，既顯示出免疫基因方法治療惡性腫瘤的優(yōu)效性，還將成為制備靶向治療膀胱癌新型藥物的核心成分。

本發(fā)明可應(yīng)用于CRISPR/Cas9快速、簡(jiǎn)便、高效、特異性剪接lncRNA-UCA1基因和人PD-1基因的方法，并為將來采用脂質(zhì)體包裹表達(dá)靶向人膀胱癌lncRNA-UCA1基因的sgRNA及其他給藥方式奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)，展現(xiàn)出可有效清除人膀胱癌lncRNA-UCA1的表達(dá)，抑制膀胱癌細(xì)胞的生長(zhǎng)并能解決目前膀胱癌治療中存在問題的誘人前景。本發(fā)明具有(1)概念新，利用CRISPR/Cas9剪輯lncRNA-UCA1和PD-1基因；(2)效率高，在體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)可明顯降低lncRNA-UCA1的表達(dá)，抑制腫瘤的生長(zhǎng)；(3)多靶點(diǎn)，可以同時(shí)敲除修飾多個(gè)靶點(diǎn)基因的突出特點(diǎn)。

附圖說明

圖1為Cas9實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)切割導(dǎo)致DNA及雙鏈斷裂過程示意圖；

圖2為sgRNA/Cas9介導(dǎo)的UCA1特異性切割造成UCA1表達(dá)變化情況；

圖3為sgRNA/Cas9介導(dǎo)的PD-1特異性切割造成PD-1基因表達(dá)變化情況；

圖4為用ELISA檢測(cè)建立人化小鼠lgG的表達(dá)情況；

圖5為人化荷瘤小鼠模型內(nèi)，聯(lián)合敲除UCA1和PD-1后，DC表型的變化情況；

圖6為人化荷瘤小鼠模型內(nèi)，聯(lián)合敲除UCA1和PD-1后，腫瘤細(xì)胞凋亡的變化情況；

圖7為觀察腫瘤體積(Tumor Volume)的變化的結(jié)果圖；

圖8為PgL3-U6-sgRNA質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)；

圖9為載體pST1374-NLS-flag-cas9-ZF質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)說明。

如圖1所示，CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)基因的定向識(shí)別和剪切是由sgRNA和Cas9實(shí)現(xiàn)的，sgRNA決定了Cas9的靶向性，也決定了Cas9的切割活性。本發(fā)明旨在應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)，以高表達(dá)lncRNA-UCA1的人膀胱癌細(xì)胞和荷膀胱癌移植瘤小鼠模型為研究對(duì)象，采用靶致病基因lncRNA-UCA1，以及協(xié)同靶向腫瘤免疫調(diào)節(jié)分子PD-1的基因編輯策略。 首先，通過體內(nèi)外篩選針對(duì)lncRNA-UCA1基因的sgRNA序列，實(shí)現(xiàn)lncRNA-UCA1基因的有效敲除；然后，通過體內(nèi)外篩選針對(duì)PD-1的sgRNA序列，通過共轉(zhuǎn)染實(shí)現(xiàn)多基因協(xié)同編輯效應(yīng)，進(jìn)而考察聯(lián)合干預(yù)不同靶點(diǎn)的治療策略是否對(duì)膀胱癌小鼠移植瘤治療具有“1+1>2”的協(xié)同效應(yīng)。本發(fā)明是采用cas9能夠?qū)崿F(xiàn)多重基因敲除的優(yōu)勢(shì)，采取特異性靶向“單一基因”或“協(xié)同作戰(zhàn)”的方法，針對(duì)與腫瘤發(fā)生的癌基因和機(jī)體免疫抑制的分子靶點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行干預(yù)，能夠聯(lián)合發(fā)揮抑制致癌lncRNA基因和主動(dòng)免疫的治療作用，從而為人膀胱癌lncRNA-UCA1清除和膀胱癌的有效治療提供新的策略。

本發(fā)明在除了直接靶向剪接lncRNA-UCA1基因，還利用CRISPR/Cas9聯(lián)合特異性敲除lncRNA-UCA1和人PD-1基因的方法，對(duì)小鼠膀胱癌的移植瘤實(shí)施免疫基因治療的策略。首先分別設(shè)計(jì)和合成特異性靶向lncRNA-UCA1基因的sgRNA1和特異性靶向PD-1基因的sgRNA2，將sgRNA1和sgRNA2與線性的pGL3-U6-sgRNA質(zhì)粒連接成pGL3-U6-UCA1 sg質(zhì)粒和pGL3-U6-PD1 sg質(zhì)粒。在驗(yàn)證除了將pGL3-U6-UCA1 sg質(zhì)粒和pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF質(zhì)粒轉(zhuǎn)入膀胱癌的5637細(xì)胞后可以明顯抑制lncRNA-UCA1基因表達(dá)，還將pGL3-U6-UCA1 sg質(zhì)粒和pGL3-U6-PD1 sg質(zhì)粒聯(lián)合轉(zhuǎn)入荷膀胱癌移植瘤的小鼠體內(nèi)，獲得高效敲除lncRNA-UCA1基因表達(dá)并明顯抑制移植瘤生長(zhǎng)的效果。

一、靶向lncRNA-UCA1的sgRNA1和靶向PD-1的sgRNA2寡核苷酸的設(shè)計(jì)和選擇，如無特殊說明，文中sgRNA1是靶向lncRNA-UCA1的序列；sgRNA2是靶向人PD-1的序列。

1、在lncRNA-UCA1基因上選擇5’-GGN(19)GG的序列，如果沒有5’-GGN(19)GG的序列，5’-GN(20)GG或者5’-N(21)GG也可以。在PD-1基因上選擇5’-GGN(19)GG的序列，如果沒有5’-GGN(19)GG的序列，5’-GN(20)GG或者5’-N(21)GG也可以。

2、sgRNA1在lncRNA-UCA1的靶向位點(diǎn)分別位于lncRNA-UCA1的啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域。sgRNA2在人PD-1基因上的靶點(diǎn)位于基因的外顯子，這樣更容易引起片段的缺失或移框突變，從而達(dá)到基因完全失活的目的。sgRNA2在人PD-1基因上的靶位點(diǎn)位于不同的各種剪切形式的共有外顯子上。

3、在UCSC數(shù)據(jù)庫中用BLAT或NCBI數(shù)據(jù)庫中用BLAST，確定sgRNA1和sgRNA2的靶序列的唯一性，以減少潛在的脫靶位點(diǎn)。

4、如果用針對(duì)lncRNA-UCA1不同區(qū)域的sgRNA1來實(shí)現(xiàn)聯(lián)合靶向UCA1，即可更有效的敲低UCA1基因。

5、如果用靶向lncRNA-UCA1不同區(qū)域的兩個(gè)sgRNA1聯(lián)合靶向人PD-1基因的sgRNA2，能更有效的抑制小鼠膀胱癌移植瘤的生長(zhǎng)。

二、構(gòu)建sgRNA的寡聚核苷酸雙鏈

根據(jù)選擇的sgRNA1s和sgRNA2s，在其5’加上CCGG得到正向寡核苷酸(Forward oligo)，如果序列本身在5’端已經(jīng)有1或者2個(gè)G，那么就對(duì)應(yīng)的省略1或者2個(gè)G；根據(jù)選擇的sgRNA，獲得其對(duì)應(yīng)DNA的互補(bǔ)鏈，并且在其5’加上AAAC得到反向寡核苷酸(Reverse oligo)，分別合成上述正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，將合成的sgRNA寡聚核苷酸的Forward oligo和Reverse oligo成對(duì)退火。

退火反應(yīng)體系如下：

在PCR儀中按照以下touch down程序運(yùn)行：95℃，5min；95-85℃at-2℃/s；85-25℃at-0.1℃/s；hold at 4℃

退火之后形成可以連入U(xiǎn)6真核表達(dá)載體的雙鏈，序列如下：

Forward oligo:5’-CCGGNNNNNNNNNNNNNNNNNN

Reverse oligo:NNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA-5’。

三、sgRNA寡聚核苷酸質(zhì)粒的構(gòu)建

1.線性化pGL3-U6-sgRNA質(zhì)粒(如圖8所示，Addgene(Cambridge,MA,USA))酶切體系和條件如下：2μg pGL3-U6-sgRNA(400ng/μL)；1μL CutSmart Buffer；1μL BsaI(NEB).補(bǔ)水至50μL，37℃孵育3-4小時(shí)；酶切完成后用AxyPrep PCR Clean up Kit(AP-PCR-250)純化回收至20-40μL滅菌水中。

2.將退火的sgRNA1寡聚核苷酸雙鏈和退火的sgRNA2寡聚核苷酸雙鏈與線性化pGL3-U6-sgRNA質(zhì)粒分別連接，獲得pGL3-U6-UCA1 sg質(zhì)粒和pGL3-U6-PD1 sg質(zhì)粒。

3.轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，并涂Amp+平板(50μg/mL)。

4.用SEQ.ID.NO.1的通用引物U6測(cè)序的方法鑒定陽性克隆。

5.37℃搖床搖菌過夜培養(yǎng)陽性克隆并用AxyPrep Plasmid Miniprep Kit(AP-MN-P-250)抽提pGL3-U6-UCA1 sg質(zhì)粒和pGL3-U6-PD1 sg質(zhì)粒。

四、轉(zhuǎn)染人膀胱癌5637細(xì)胞

1.按Lipofectamine 2000Transfection Reagent(Invitrogen,11668-019)的操作手冊(cè)，將分別帶有對(duì)應(yīng)UCA1基因的sgRNA寡聚核苷酸的pGL3-U6-UCA1 sg質(zhì)粒(單獨(dú)靶向UCA1啟動(dòng)子或轉(zhuǎn)錄起始區(qū))與用于表達(dá)核酸酶Cas9的pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF質(zhì)粒(結(jié)構(gòu)如圖9所示，Addgene(Cambridge,MA,USA))混勻，共轉(zhuǎn)染5637細(xì)胞。具體如下：

2.為提高基因敲除效率，在靶向UCA1基因的sgRNA寡核苷酸設(shè)計(jì)、選擇和合成之后，將靶向UCA1基因的sgRNA1寡聚核苷酸(即靶向UCA1啟動(dòng)子以及轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的sgRNA UCA1-1以及UCA1-2)分別與線性化pGL3-U6-sgRNA質(zhì)粒連接分別獲得含靶向UCA1啟動(dòng)子以及轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的sgRNA寡聚核苷酸的載體pGL3-U6-UCA1 sg1以及pGL3-U6-UCA1 sg2，按如下操作轉(zhuǎn)染5637細(xì)胞：按照Lipofectamine 2000Transfection Reagent(Invitrogen,11668-019)的操作手冊(cè)，將兩組(第一組：靶向UCA1啟動(dòng)子區(qū)的sgRNA的寡聚核苷酸的載體pGL3-U6-UCA1 sg1，對(duì)應(yīng)的sgRNA為序列表的SEQ.ID.NO.4；第二組：靶向UCA1轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的sgRNA的寡聚核苷酸的載體pGL3-U6-UCA1 sg2，對(duì)應(yīng)的sgRNA參照序列表中的SEQ.ID.NO.5)按混合質(zhì)量比例1:1(病人類型不同，對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)的量也可調(diào)整)混合，將混合質(zhì)粒與pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF質(zhì)?；靹?，共轉(zhuǎn)染5637細(xì)胞。

在轉(zhuǎn)染后二天，提取細(xì)胞RNA，用RT-PCR的方法檢測(cè)UCA1基因的表達(dá)。

如圖2所示，對(duì)照組(gRNA empty vector)是轉(zhuǎn)入了沒有切割活性的sgRNA載體pGL3-U6-UCA1 sg(對(duì)應(yīng)的sgRNA為SEQ.ID.NO.2)；處理組是單獨(dú)加入針對(duì)UCA1-1的sgRNA載體pGL3-U6-UCA1 sg1(圖2中UCA1-1組)或針對(duì)UCA1-2的sgRNA載體pGL3-U6-UCA1 sg2(圖2中UCA1-2組)，或者聯(lián)合加入針對(duì)UCA1-1以及UCA1-2的sgRNA載體pGL3-U6-UCA1 sg1+2(圖2中UCA1-(1+2)組)；圖2中的Blank組是不加任何質(zhì)粒的細(xì)胞，圖2結(jié)果表明：用RT-PCR方法檢測(cè)UCA1基因的表達(dá)情況，相比較Blank組和對(duì)照組，單獨(dú)敲除可以有效降低UCA1的表達(dá)，聯(lián)合敲除相比較單獨(dú)敲除有更好的效果。

五、敲除人PD-1基因，檢測(cè)PD-1基因的表達(dá)水平

1.取新鮮血液，用枸櫞酸鈉(ACD)抗凝，如果不馬上分離，將血液先保存于4℃，六小時(shí)之內(nèi)分離PBMC(人外周血單個(gè)核細(xì)胞)。(如果需要保存血清備用，先將血液2500rpm/min離心5min，將上層血清吸出)

2.用等體積的生理鹽水稀釋血液或血漿。1：1稀釋血液可降低紅細(xì)胞的凝聚，提高淋巴細(xì)胞的收獲量。

3.取稀釋后血液的二分之一體積的淋巴細(xì)胞分離液(每一份淋巴細(xì)胞分離液加兩份稀釋后的血液)，加入玻璃管管底，并升溫到室溫。

4.用塑料吸管吸取稀釋后的血液樣品，沿管壁緩慢鋪到淋巴細(xì)胞分離液上面，勿打亂液層界面。

5. 2000rpm/min離心20min，室溫約20℃。存放2h以上的血液應(yīng)離心30min。

6.離心后管底是紅細(xì)胞，中間層是分離液，最上層是血漿。血漿層與分離液之間是一薄層較致密的白色霧狀層，含單個(gè)核細(xì)胞(包括淋巴細(xì)胞和單核粒細(xì)胞)。用吸管直接插入到單個(gè)核細(xì)胞層并吸取該層，放入另一試管中。

7.加10mL生理鹽水稀釋分離的PBMC(人外周血單個(gè)核細(xì)胞)，2500rpm/min離心10min，棄上清。重復(fù)洗滌1-2次，除去血小板和抗凝物質(zhì)。

8.按Lipofectamine 2000Transfection Reagent(Invitrogen,11668-019)的操作手冊(cè)，將分別帶有對(duì)應(yīng)PD-1基因的sgRNA寡聚核苷酸的pGL3-U6-PD1 sg質(zhì)粒(sgRNA分別如SEQ.ID.NO.6或SEQ.ID.NO.7所示)與用于表達(dá)核酸酶Cas9的pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF質(zhì)粒(結(jié)構(gòu)如圖9所示，Addgene(Cambridge,MA,USA))混勻，轉(zhuǎn)染PBMC細(xì)胞，用RT-PCR的方法檢測(cè)PD-1的變化。

如圖3所示，對(duì)照組(gRNA empty vector)是轉(zhuǎn)入了沒有切割活性的sgRNA載體pGL3-U6-PD1 sg(對(duì)應(yīng)的sgRNA為SEQ.ID.NO.3)，處理組是單獨(dú)加入針對(duì)PD1-1(SEQ.ID.NO.6)的sgRNA載體pGL3-U6-PD1-1 sg(圖3中g(shù)RNA PD1-1組)和聯(lián)合加入針對(duì)PD1-1以及PD1-2(SEQ.ID.NO.7)的sgRNA載體pGL3-U6-PD1-1 sg以及 pGL3-U6-PD1-2 sg(圖3中g(shù)RNA PD1-(1+2)組)。用RT-PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，PD-1基因的表達(dá)情況。圖3結(jié)果表明：相比較對(duì)照組，單獨(dú)敲除可以有效降低PD-1的表達(dá)，聯(lián)合敲除相比較單獨(dú)敲除有更好的效果。

六、建立人化荷瘤移植瘤模型，觀察聯(lián)合靶向剪接UCA1和PD-1基因抑制腫瘤的效果

1、建立人化小鼠模型

培養(yǎng)SCID完全免疫缺陷小鼠，然后腹腔注射4x10⁷人PBMC，按時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)小鼠靜脈血內(nèi)人lgG水平。取小鼠尾靜脈血，按照(ELISA)使用說明書測(cè)量人lgG。

(1)配制工作濃度洗滌液(以純化水做25倍稀釋，充分混勻后待用)；

(2)根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，選擇一定量的反應(yīng)板條；

(3)加入75μL待測(cè)樣本和陰性陽性對(duì)照于反應(yīng)孔中；

(4)用封片紙覆蓋反應(yīng)板后，將反應(yīng)板置于37℃孵育60分鐘；

(5)取出反應(yīng)板，撕去封片，在已加入待測(cè)樣本和陰性，陽性對(duì)照孔中加入50μL酶結(jié)合物；

(6)在微孔振蕩器上震蕩10秒鐘；

(7)用封片紙覆蓋反應(yīng)板后，將反應(yīng)板置于37℃孵育30分鐘；

(8)取出反應(yīng)板，撕去封片紙，洗滌反應(yīng)板5次；

(9)洗滌結(jié)束后立即在所有孔內(nèi)加入顯色劑A，顯色劑B各50μL，混勻；

(10)在微孔振蕩器上震蕩10秒鐘；

(11)用封片紙覆蓋反應(yīng)板后，將反應(yīng)板置于37℃孵育30分鐘；

(12)在所有孔內(nèi)加入50μL終止液，震蕩反應(yīng)5秒鐘，使之充分混勻；

(13)用酶標(biāo)儀讀數(shù)(波長(zhǎng)450nm)，并計(jì)算獲得人lgG含量。

2、建立小鼠荷膀胱癌移植瘤模型

培養(yǎng)膀胱癌5637細(xì)胞，按每個(gè)注射點(diǎn)2×10⁶個(gè)細(xì)胞的數(shù)量接種人化小鼠背部皮下。如圖4所示，空白組是不注射PBMC的小鼠，圖4結(jié)果表明：隨著時(shí)間點(diǎn)的變化，人化荷瘤組小鼠lgG水平相比較空白組水平明顯增高，表明人化荷瘤小鼠模型建立成功。

待移植瘤長(zhǎng)至2mm³大小，將其分為5組進(jìn)行體內(nèi)聯(lián)合免疫基因治療實(shí)驗(yàn)，即對(duì)照組(Control或gRNA empty vector)、陽性對(duì)照組(LPS)、敲低UCA1組(gRNA-UCA1)、敲低PD-1組(gRNA-PD1)以及聯(lián)合敲低UCA1+PD-1組(gRNA-(UCA1+PD1))。采用電穿孔注射靶向UCA1和人PD-1基因質(zhì)粒的方法，每組給的劑量分別為對(duì)照組：40μg pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF+10μg沒有切割活性的sgRNA載體(含SEQ.ID.NO.2)+10μg 沒有切割活性的sgRNA載體(含SEQ.ID.NO.3)；敲低UCA1組：40μgpST1374-NLS-flag-Cas9-ZF+10μg pGL3-U6-UCA1 sg1+10μg pGL3-U6-UCA1 sg2；敲低PD1組：40μg pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF+10μg pGL3-U6-PD1-1 sg+10μg pGL3-U6-PD1-2 sg；聯(lián)合敲低UCA1+PD1組：40μg pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF+10μg pGL3-U6-UCA1 sg1+10μg pGL3-U6-UCA1 sg2+10μg pGL3-U6-PD1-1 sg+10μg pGL3-U6-PD1-2 sg。

3、分析小鼠DC表型的變化

3.1.DC細(xì)胞的分離，誘導(dǎo)

(1)小鼠外周血加PBS稀釋到3-5mL，加Ficoll 5mL，離心1600*20min，小心取出白膜層，用PBS 12mL重懸，離心1600*8min，PBS 10mL重懸，計(jì)數(shù)，離心1600*8min，10mL DC無血清培養(yǎng)基重懸，鋪六孔板，每孔5X10⁶，空隙中加入PBS，放入培養(yǎng)箱。剩余單個(gè)核細(xì)胞凍存，凍存液為9:1的血清和DMSO；

(2)3h后，觀察貼壁情況，吸出未貼壁細(xì)胞，用PBS洗兩遍，離心1500*5min，這些細(xì)胞合并起來凍存，凍存液為9:1的血清和DMSO；

(3)貼壁細(xì)胞中加入1.5mL DC完全培養(yǎng)基；

3.2.DC表型的檢測(cè)

(1)收集各組DC，用生理鹽水沖洗2遍；

(2)將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至流式試管，用100μL的生理鹽水重懸，要求細(xì)胞量不少于5x10⁵/管，加入10％正常小鼠血清常溫封閉30min；

(3)分別加入流式抗體HLA-DR(APC)，CD80(FITC)，CD83(PE)常溫避光孵育30min；

(4)用生理鹽水洗細(xì)胞2次，最后用200μL的生理鹽水重懸；

(5)流式細(xì)胞儀分析。

如圖5所示，根據(jù)人化荷瘤小鼠模型內(nèi)DC表型的變化，單獨(dú)敲除UCA1可以有效提高DC的抗原遞呈作用，聯(lián)合敲除UCA1+PD-1相比較單獨(dú)敲除有更好的效果。

4.檢測(cè)體內(nèi)腫瘤細(xì)胞凋亡的變化

(1)去除瘤塊不需要的組織，使用無菌的解剖刀和剪刀把剩余組織切成3-4mm小片，通過懸浮在無鈣鎂的平衡鹽溶液中清晰組織碎片。讓組織碎片沉淀，去除上清液，重復(fù)清晰2-3次；

(2)將盛有組織碎片的容器置于冰上，去除殘留的上清液。加入0.25％溶解在無鈣鎂的平衡鹽溶液中的胰蛋白酶(100mg組織加入1mL胰蛋白酶)；

(3)在4℃孵育6到18小時(shí)，胰蛋白酶充分作用；

(4)移棄組織碎片中的液體，在37℃孵育包含殘留胰蛋白酶的組織碎片20到30分鐘；

(5)在組織碎片加入熱的完全培養(yǎng)基，用移液管輕輕地分散組織。如果使用無血清培養(yǎng)基，要加入大豆胰蛋白酶抑制劑；

(6)通過無菌不銹鋼絲網(wǎng)(100～200mm)過濾，分散所有剩余組織，將分離得單細(xì)胞計(jì)數(shù)；

(7)調(diào)整待檢測(cè)細(xì)胞濃度為10⁶/mL，取200uL、1000rpmX5min(4℃)；

(8)預(yù)冷的PBS潤(rùn)洗2次；

(9)將細(xì)胞重懸于100uL bind buffer，加入2uL Annexin-V-FITC(20ug/mL)，輕輕混勻，避光冰上放置15分鐘；

(10)轉(zhuǎn)至流式檢測(cè)管，加入400ulPBS，每個(gè)樣品臨上級(jí)前加入1uL PI(50ug/mL)，2分鐘后經(jīng)流式細(xì)胞儀迅速檢測(cè)；

(11)同時(shí)以不加Annexin-V-FITC和PI的一管作為陰性對(duì)照。

如圖6所示，根據(jù)人化荷瘤小鼠模型內(nèi)細(xì)胞凋亡的變化，相比較對(duì)照組，單獨(dú)敲除UCA1可以有效增加腫瘤細(xì)胞的凋亡，聯(lián)合敲除相比較單獨(dú)敲除有更好的效果。

5、觀察移植瘤生長(zhǎng)變化

于給藥后3d/7d/14d分別用游標(biāo)卡尺測(cè)量移植瘤大小(3次)，計(jì)算、觀察移植瘤變化情況，在給藥后于22d脫臼處死小鼠，稱量移植瘤。如圖7所示，相比較于對(duì)照組(gRNA empty vector)，單獨(dú)敲除PD-1(gRNA-PD1)或UCA1(gRNA-UCA1)有很好的抑制腫瘤生長(zhǎng)效果；聯(lián)合敲除UCA1+PD-1(gRNA-(UCA1+PD1))相比較對(duì)照組和單獨(dú)敲除組有更好的抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。