本申請(qǐng)涉及細(xì)胞免疫療法。具體地，涉及一種通過(guò)向多能性干細(xì)胞中導(dǎo)入編碼期望抗原特異性t細(xì)胞受體的基因來(lái)制備細(xì)胞免疫療法用細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
：每個(gè)t細(xì)胞表達(dá)具有不同特異性的t細(xì)胞受體(tcr)。當(dāng)傳染病發(fā)展時(shí)，具有適合特異性的t細(xì)胞會(huì)增殖從而形成t細(xì)胞群(克隆集落)，這種t細(xì)胞群會(huì)與病原體進(jìn)行斗爭(zhēng)。這是獲得性免疫的基本理念。如果有可能人工擴(kuò)增具有期望特異性的t細(xì)胞，就可將擴(kuò)增的t細(xì)胞用于過(guò)繼性免疫治療。給定t細(xì)胞的擴(kuò)增被稱(chēng)為“克隆”。事實(shí)上，抗原特異性t細(xì)胞的自體移植已進(jìn)行了臨床實(shí)施，這種抗原特異性t細(xì)胞是通過(guò)擴(kuò)增取自患者的抗原特異性t細(xì)胞而制得。然而，幾乎所有的自體t細(xì)胞移植治療不使用純化到“克隆”細(xì)胞程度的細(xì)胞群。此外，細(xì)胞的重復(fù)體外繼代培養(yǎng)可能造成殺死癌細(xì)胞功能的損失。提出了一種通過(guò)使細(xì)胞不死化而能夠使其無(wú)限增殖的細(xì)胞提供方法?？墒辜?xì)胞不死化并使其增殖而形成克隆的細(xì)胞群。細(xì)胞不死化的方法可以包括細(xì)胞與癌細(xì)胞的融合以及在細(xì)胞因子存在下借助刺激tcr而進(jìn)行的長(zhǎng)期培養(yǎng)。然而，由于細(xì)胞為癌細(xì)胞，由此獲得的不死化t細(xì)胞的自體移植可能是危險(xiǎn)的。此外，克隆過(guò)程可能降低細(xì)胞功能。至今業(yè)已提出的移植t細(xì)胞的細(xì)胞免疫療法簡(jiǎn)單介紹如下。a.使用重編程技術(shù)克隆t細(xì)胞提出的方法中，通過(guò)利用重編程技術(shù)對(duì)具有編碼抗原特異性tcr的基因的干細(xì)胞進(jìn)行克隆擴(kuò)增。期望通過(guò)該方法來(lái)解決t細(xì)胞自體移植中的問(wèn)題。具體而言，通過(guò)核移植或建立ips細(xì)胞技術(shù)從t細(xì)胞生成多能性干細(xì)胞。針對(duì)該理念業(yè)已提交了專(zhuān)利申請(qǐng)(wo2008/038579和wo2011/096482)。關(guān)于該方法的論文也已在2010和2013年發(fā)表：1)wataraih，arybouchkin，nhongo，ynagata，ssakata，esekine，ndashtsoodol，ttashiro，s-ifujii，kshimizu，kmori，k.masuda，hkawamoto，hkoseki和mtaniguchi，從具有重排的不變vα14-jα18tcrα基因體外生成功能性nkt細(xì)胞，blood，115：230-237，2010。2)vizcardor，masudak，yamadad，ikawat，shimizuk，fujiis-i，kosekih和kawamotoh，從源自于cd8+t細(xì)胞的ips細(xì)胞再生人類(lèi)腫瘤抗原特異性t細(xì)胞，cellstemcell，12：31-36，2013。3)nishimurat等，cellstemcell，12：114-226，2013。在這些方法中，從患者的t細(xì)胞建立es細(xì)胞或ips細(xì)胞，從這些es或ips細(xì)胞再生t細(xì)胞，然后將再生的t細(xì)胞移植到患者(自體移植)。然而，這些方法至少存在以下三個(gè)問(wèn)題：a1)必須分別從每位患者建立ips細(xì)胞，因此預(yù)先準(zhǔn)備適用于不同人治療的ips細(xì)胞是不可能的；a2)必須分別為每位患者建立ips細(xì)胞，因此得到的ips細(xì)胞的質(zhì)量和安全性可能每次都不同，以及a3)從t-ips細(xì)胞分化的t細(xì)胞可能變癌。b.使用導(dǎo)入有編碼tcr的基因的t細(xì)胞的t細(xì)胞療法已經(jīng)在各地實(shí)施了基因療法的臨床測(cè)試，其中包括：分離出編碼抗原特異性t細(xì)胞受體(tcr)的基因并將該基因轉(zhuǎn)染到從待治療患者獲取的正常t細(xì)胞中，然后將轉(zhuǎn)染的t細(xì)胞移植到患者(自體移植)(morganr.a.等，science，314：126，2006)。得到的t細(xì)胞為各種克隆集落(clone)的聚集體。根據(jù)該方法，原來(lái)存在于正常t細(xì)胞中的tcr的表達(dá)被抑制了，例如被sirna抑制(okamotos等，cancerres，69：9003，2009)。對(duì)如此得到的只表達(dá)特異性tcr的t細(xì)胞進(jìn)行自體移植。例如，已經(jīng)分離出了編碼wt1抗原特異性t細(xì)胞受體的基因。已經(jīng)實(shí)施了使用tcr基因來(lái)治療wt1表達(dá)癌的基因療法。在方法b中，還從待治療的患者的t細(xì)胞制備出了治療用t細(xì)胞。該方法存在以下三個(gè)問(wèn)題。b1)因?yàn)槭腔虔煼?，患者的t細(xì)胞有變癌的風(fēng)險(xiǎn)；b2)編碼待移植的t細(xì)胞中的原始tcr的內(nèi)源基因的表達(dá)可能不會(huì)完全被抑制，因此存在發(fā)生非期望反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)；b3)必須從每位患者制備t細(xì)胞，因此預(yù)先制備適用于各種人治療的t細(xì)胞是不可能的。c.供體淋巴細(xì)胞輸注用于治療惡性血液病(比如白血病)的骨髓移植也有細(xì)胞移植的方面。也就是說(shuō)，含在移植的供體骨髓細(xì)胞中的t細(xì)胞預(yù)期攻擊受體中的白血病細(xì)胞。人們還知道的是，在供體淋巴細(xì)胞輸注中，為了提高效果而在骨髓移植之后再單獨(dú)輸注供體的t細(xì)胞。最近提出了一種新方法，其中輸注克隆擴(kuò)增的給定抗原特異性t細(xì)胞(chapuis等，scitranslmed，5:174ra27，2013)。在該方法中，輸注的t細(xì)胞源自于供體。然而，接收骨髓移植后的受體的造血系統(tǒng)變?yōu)榕c供體的造血系統(tǒng)相同。因此，骨髓移植后的t細(xì)胞輸注被認(rèn)為是一種自體移植。該方法需要骨髓移植并且患者在他/她的整個(gè)生命當(dāng)中都要服用免疫抑制劑。d.治療他人用臍帶血淋巴細(xì)胞的利用接受了臍帶血移植的患者由于免疫能力降低有時(shí)會(huì)發(fā)展病毒性傳染病。為了治療這種患者，提出了：輸注含在源自于其他人(而不是原始臍帶的提供者)的臍帶血中的病毒特異性ctl(blood，116：5045，2010)。關(guān)于移植供體(具有與患者的hla匹配至一定程度而非完全匹配的hla)的ctl的構(gòu)思已經(jīng)提交專(zhuān)利申請(qǐng)(wo2011/021503)。然而，臍帶血中的t細(xì)胞為克隆集落的聚集體，即，具有大量不同tcr的細(xì)胞的聚集體。因此，不能很好地避免發(fā)生移植物抗宿主病(gvhd)的風(fēng)險(xiǎn)。如上所述，已經(jīng)提出了使用t細(xì)胞的各種細(xì)胞免疫療法。除了d之外的療法均為自體細(xì)胞移植或被認(rèn)為是自體移植。異體細(xì)胞移植與常規(guī)技術(shù)知識(shí)相違背。在惡性血液病(比如白血病)的治療中，例如，通常進(jìn)行造血干細(xì)胞的骨髓移植。為了避免受體對(duì)供體的骨髓的排斥，使用的骨髓的供體具有與受體的hla相匹配的hla。然而，二者之間除了hla之外的各種蛋白質(zhì)的氨基酸序列不匹配，供體的t細(xì)胞可能將這些錯(cuò)誤配對(duì)識(shí)別為攻擊目標(biāo)。結(jié)果，部分移植的供體t細(xì)胞攻擊受體的身體，即可能發(fā)生移植物抗宿主反應(yīng)并導(dǎo)致受體死亡(ito等，lancet，331：413，1988)。借助具有純合的hla單倍型(頻頻發(fā)現(xiàn)于日本人中)的供體形成高通用性ips細(xì)胞銀行的項(xiàng)目正在進(jìn)行中(curanoski，nature，卷488：139，2012)。然而，在t細(xì)胞移植中，即使供體具有的hla完全與受體的hla匹配，仍然存在移植物抗宿主反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。此外，當(dāng)hla錯(cuò)誤配對(duì)時(shí)，預(yù)期發(fā)生更加嚴(yán)重的移植物抗宿主反應(yīng)。因此，這種ips細(xì)胞庫(kù)對(duì)于使用t細(xì)胞的細(xì)胞免疫療法來(lái)說(shuō)不適用?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專(zhuān)利文獻(xiàn)【專(zhuān)利文獻(xiàn)1】wo2008/038579【專(zhuān)利文獻(xiàn)2】wo2011/096482【專(zhuān)利文獻(xiàn)3】wo2011/021503非專(zhuān)利文獻(xiàn)【非專(zhuān)利文獻(xiàn)1】watarai等，blood，115：230-237，2010?！痉菍?zhuān)利文獻(xiàn)2】vizcardo等，cellstemcell，12：31-36，2013。【非專(zhuān)利文獻(xiàn)3】nishimurat等，cellstemcell，12：114-226，2013。【非專(zhuān)利文獻(xiàn)4】morganr.a.等，science，314：126，2006。【非專(zhuān)利文獻(xiàn)5】okamotos等，cancerres，69：9003，2009?！痉菍?zhuān)利文獻(xiàn)6】chapuis等，scitranslmed，5：174ra27，2013?！痉菍?zhuān)利文獻(xiàn)7】blood，116：5045，2010【非專(zhuān)利文獻(xiàn)8】ito等，lancet，331：413，1988【非專(zhuān)利文獻(xiàn)9】cyranoski，nature，卷488：139，2012【非專(zhuān)利文獻(xiàn)10】takahashi和yamanaka，cell，126：663-673，2006【非專(zhuān)利文獻(xiàn)11】takahashi等，cell，131：861-872，2007【非專(zhuān)利文獻(xiàn)12】grskovic等，nat.rev.drug.dscov，10：915-929(2011)【非專(zhuān)利文獻(xiàn)13】morganr.a.等,science，314：126，2006【非專(zhuān)利文獻(xiàn)14】timmermans等，journalofimmunology，182：6879-6888，2009【非專(zhuān)利文獻(xiàn)15】blood，111：1318，2008【非專(zhuān)利文獻(xiàn)16】natureimmunology，11：585，2010以上所列的現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)以引用的形式結(jié)合于此。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本申請(qǐng)的目的在于提供一種比常規(guī)免疫療法更有效且更安全的細(xì)胞免疫療法。根據(jù)本申請(qǐng)的一種細(xì)胞免疫治療方法，其包括從具有編碼期望抗原特異性tcr的基因的多能性干細(xì)胞誘導(dǎo)t細(xì)胞祖細(xì)胞或成熟t細(xì)胞，以及將得到t細(xì)胞祖細(xì)胞或成熟t細(xì)胞同種異體地投放于患者，所述患者具有的hla與供體的hla匹配至預(yù)定程度并且從所述供體建立所述多能性干細(xì)胞。在本申請(qǐng)的所述方法中，具有編碼期望抗原特異性t細(xì)胞受體的基因的所述多能性干細(xì)胞可以通過(guò)將編碼所述抗原特異性t細(xì)胞受體的基因?qū)氲剿龆嗄苄愿杉?xì)胞中而得到。用于所述細(xì)胞免疫療法中的所述t細(xì)胞為克隆擴(kuò)增的t細(xì)胞群，因此細(xì)胞群中的所有細(xì)胞都具有單一tcr。因此，造成移植物抗宿主反應(yīng)的可能性明顯較低，并且所述細(xì)胞不僅可用于自體移植還可以用于同種異體移植。鑒于“t細(xì)胞的同種異體移植為絕對(duì)禁忌”的常識(shí)，本文提供的所述方法是現(xiàn)有技術(shù)無(wú)法預(yù)料的。【發(fā)明效果】根據(jù)本申請(qǐng)，發(fā)明人可出乎意料地在一定程度上解決上述公認(rèn)的問(wèn)題。具有以下優(yōu)點(diǎn)：1)無(wú)需為每位患者制備移植用t細(xì)胞。因此，能夠預(yù)先進(jìn)行細(xì)胞免疫療法用t細(xì)胞的制備。2)在治療之前可以檢驗(yàn)移植細(xì)胞的安全性和質(zhì)量。3)即使對(duì)于hla匹配的患者和供體之間的異體移植，一些小抗原不匹配，也會(huì)因此造成最終移植的細(xì)胞被患者的免疫反應(yīng)所排斥。可以進(jìn)行移植細(xì)胞的癌變風(fēng)險(xiǎn)明顯較小的安全治療。此外，鑒于本申請(qǐng)移植用t細(xì)胞可以通過(guò)具有將編碼期望抗原特異性t細(xì)胞受體(tcr)的基因?qū)攵嗄苄愿杉?xì)胞步驟的方法獲得的事實(shí)，還預(yù)期具有以下優(yōu)點(diǎn)：1)通過(guò)導(dǎo)入效果和安全性已經(jīng)確認(rèn)的編碼tcr的基因，可以保證移植用t細(xì)胞的質(zhì)量；2)可以識(shí)別出tcr基因插入位點(diǎn)并且可以提前確認(rèn)安全克隆集落。因此，能夠避免移植細(xì)胞的癌變問(wèn)題。3)將導(dǎo)入有編碼tcr的基因的多能性干細(xì)胞重新分化為t細(xì)胞后，導(dǎo)入的tcr將先于初始干細(xì)胞的tcr(內(nèi)源tcr)而表達(dá)，因而內(nèi)源tcr鏈不會(huì)被重排，并且可能不發(fā)生非期望的反應(yīng)。附圖說(shuō)明圖1示出了實(shí)施例1中使用的pta2載體。圖2示出了實(shí)施例1中使用的慢病毒載體。圖3示出了實(shí)施例1中從tcr-ips細(xì)胞再生了具有wt1-tcr的成熟t細(xì)胞(wt1-tcr被導(dǎo)入到ips細(xì)胞中從而得到tcr-ips細(xì)胞)。圖4示出了實(shí)施例2中得到了導(dǎo)入有編碼hla-a0201限制性wt1特異性tcr的基因的ips細(xì)胞。圖5示出了實(shí)施例2中得到了導(dǎo)入有編碼hla-a0201限制性wt1特異性tcr的基因的ips細(xì)胞的克隆集落。圖6示出了實(shí)施例3中編碼wt1特異性tcr的基因被適當(dāng)導(dǎo)入到ips細(xì)胞中。圖7示出了實(shí)施例4中編碼wt1特異性tcr的基因被適當(dāng)導(dǎo)入到ips細(xì)胞中。具體實(shí)施方式在說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中，“多能性干細(xì)胞”是指具有多能性(即能在體內(nèi)分化成為多種類(lèi)型的細(xì)胞的能力以及自我繁殖的能力)的干細(xì)胞。多能性干細(xì)胞的例子可以包括胚胎干細(xì)胞(es細(xì)胞)、核移植胚胎干細(xì)胞(ntes細(xì)胞)、生殖干細(xì)胞(gs細(xì)胞)、胚胎生殖細(xì)胞(eg細(xì)胞)、誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞(ips細(xì)胞)、培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞以及源自于髓樣干細(xì)胞的多能性細(xì)胞(muse細(xì)胞)。為了從具有特異性hla的人類(lèi)供體形成細(xì)胞免疫療法用細(xì)胞銀行，優(yōu)選使用ips細(xì)胞。在說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中，通過(guò)導(dǎo)入tcr而得到的ips細(xì)胞被稱(chēng)之為“tcr-ips細(xì)胞“。ips細(xì)胞可以是從任何體細(xì)胞建立的那些。從體細(xì)胞誘導(dǎo)ips細(xì)胞的方法是現(xiàn)有技術(shù)已知的?？梢酝ㄟ^(guò)向體細(xì)胞中導(dǎo)入山中因子(yamanakafactor)來(lái)建立ips細(xì)胞(takahashiandyamanaka，cell，126：663-673，2006；takahashi等，cell，131：861-872，2007；以及grskovic等，nat.rev.drugdscov，10：915-929，2011)。用于誘導(dǎo)ips細(xì)胞的重編程因子不限于山中因子，可采用為現(xiàn)有技術(shù)已知的任何重編程因子或方法。
背景技術(shù)：
“b“中所述的t細(xì)胞療法中臨床使用的編碼各種抗原特異性t細(xì)胞受體的基因是現(xiàn)有技術(shù)已知的并且也被確認(rèn)是安全的。例如，編碼wt1抗原特異性tcr的基因已為人們所知。編碼tcr的基因可以是現(xiàn)有技術(shù)已知的那些以及從現(xiàn)在開(kāi)始即將被識(shí)別出的tcr基因。編碼tcr的基因還可以從帶有期望抗原特異性的t細(xì)胞分離得到，這些t細(xì)胞是從患有癌癥或傳染性疾病的患者分離或誘導(dǎo)而得的。根據(jù)本申請(qǐng)的方法，可以識(shí)別出導(dǎo)入基因的位點(diǎn)并且在使用之前可以檢驗(yàn)治療用克隆集落的安全性。因此，能夠避免癌變的風(fēng)險(xiǎn)。在本申請(qǐng)的方法中，可以將tcr基因?qū)雐ps細(xì)胞中。用于將tcr基因?qū)雐ps細(xì)胞中的方法可以是任何本領(lǐng)域已知的方法并且可以按照文獻(xiàn)(morganr.a.等，science，314：126，2006)教導(dǎo)的方法來(lái)進(jìn)行。尤其是，可以將載有tcr基因的適合載體導(dǎo)入到ips細(xì)胞中。例如，可以通過(guò)載體(比如病毒、質(zhì)粒和人工染色體載體)或通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體或顯微注射來(lái)導(dǎo)入tcr基因。病毒載體的例子包括逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體以及仙臺(tái)(sendai)病毒載體。人工染色體載體的例子包括人類(lèi)人工染色體(hac)、酵母人工染色體(yac)以及細(xì)菌人工染色體(bac和pac)。可利用的質(zhì)粒的例子包括用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的質(zhì)粒。載體可以含有調(diào)控序列，比如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、核糖體結(jié)合序列，終止子和/或多聚腺苷酸化位點(diǎn)，用以使tcr基因能夠表達(dá)。如有需要，載體還可以含有選擇標(biāo)記(selectionmarker)和報(bào)告基因(reporter)；選擇標(biāo)記比如有耐藥基因(例如，卡那霉素抗性基因、氨芐青霉素抗性基因或嘌呤霉素抗性基因)、胸苷激酶基因或白喉毒素基因；報(bào)告基因比如有綠色熒光蛋白(gfp)、β-葡萄糖苷酸酶(gus)或flag。如上所述，當(dāng)通過(guò)使用載體將編碼tcr的基因?qū)氲絠ps細(xì)胞中時(shí)，tcr基因是被導(dǎo)入到基因組上的位點(diǎn)上而不是編碼內(nèi)源tcr的位點(diǎn)?？商娲兀蚪M上的tcr位置可以被編碼期望tcr的基因置換。為了使用載體導(dǎo)入編碼tcr的基因，優(yōu)選從體細(xì)胞而不是從t細(xì)胞誘導(dǎo)的那些ips細(xì)胞。可替代地，當(dāng)通過(guò)“置換“的方法導(dǎo)入tcr基因時(shí)，優(yōu)選從t細(xì)胞建立的ips細(xì)胞。例如，通過(guò)基因組編輯的方式可以用期望的tcrα和tcrβ置換已經(jīng)重排的tcrα和tcrβ基因。這個(gè)方法的優(yōu)點(diǎn)可包括1)能夠調(diào)節(jié)導(dǎo)入的tcr表達(dá)的時(shí)間和水平，從而使其近似于內(nèi)源tcr，因此能夠生成高質(zhì)量t細(xì)胞，以及2)能夠不損害基因組的條件下導(dǎo)入tcr?？梢酝ㄟ^(guò)將編碼tcr的基因?qū)氲絠ps細(xì)胞中來(lái)得到tcr-ips細(xì)胞，然后將tcr-ips細(xì)胞分化為t細(xì)胞祖細(xì)胞或成熟t細(xì)胞。將多能性干細(xì)胞分化為t細(xì)胞的方法可以是文獻(xiàn)(timmermans等，journalofimmunology，182：6879-6888，2009)公開(kāi)的方法。在說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中，“t細(xì)胞祖細(xì)胞“可以涵蓋t細(xì)胞發(fā)展的任何階段中的細(xì)胞，即從與造血干細(xì)胞對(duì)應(yīng)的未分化細(xì)胞到剛好在細(xì)胞經(jīng)歷陽(yáng)性選擇/陰性選擇之前階段的細(xì)胞。t細(xì)胞分化的細(xì)節(jié)介紹于文獻(xiàn)(blood，111：1318，2008；以及natureimmunology，11：585，2010)中。在從tcr-ips細(xì)胞再分化的t細(xì)胞祖細(xì)胞或成熟t細(xì)胞中，將會(huì)表達(dá)導(dǎo)入的tcr而不表達(dá)內(nèi)源tcr。因此，可以不發(fā)生不期望的反應(yīng)并能提供一種安全療法。在另一實(shí)施例中，可以敲除ips細(xì)胞中的rag1和/或rag2基因，從而完全避免內(nèi)源tcr的重排。通過(guò)采用如此制備的細(xì)胞能夠提供更加安全的治療。敲除rag1基因和rag2基因中的一個(gè)即足夠。此外，可以同時(shí)導(dǎo)入抑制內(nèi)源tcr表達(dá)的sirna。本申請(qǐng)?zhí)峁┑募?xì)胞免疫療法可用于治療與抗原有關(guān)的疾病，其中導(dǎo)入的tcr特異性結(jié)合于該抗原。例子可以包括癌癥、傳染病、自身免疫性疾病和過(guò)敏性疾病。在本申請(qǐng)的方法中，再生的t細(xì)胞分散在適合的介質(zhì)中，比如生理鹽水或pbs；然后將分散液投藥給患者(具有與供體匹配至一定水平的hla)，其中從該供體的細(xì)胞建立多能性干細(xì)胞。供體與患者的匹配水平可以是完全匹配。當(dāng)供體為hla單倍型純合性(以下稱(chēng)之為“hla單倍型純合子”)并且患者為hla單倍型雜合性(以下稱(chēng)之為“hla單倍型雜合子”)，患者的hla單倍型其中之一需要與供體的純合的hla單倍體相匹配。可以通過(guò)靜脈來(lái)投放細(xì)胞。例如，ips細(xì)胞可以是具有與待治療的患者的hla單倍型中的至少一個(gè)相匹配的hla單倍型并且選自ips細(xì)胞銀行的那些，其中，從具有純合的hla單倍型的供體的細(xì)胞建立的ips細(xì)胞與每個(gè)供體的hla信息相關(guān)聯(lián)地存儲(chǔ)在ips細(xì)胞銀行中。投放的細(xì)胞的數(shù)量沒(méi)有限制并且可基于，例如患者的年齡、性別、身高和體重以及待治療的疾病和病情來(lái)確定。最佳細(xì)胞數(shù)量可以通過(guò)臨床研究來(lái)確定。t細(xì)胞可以靶向各種抗原，因此本申請(qǐng)的方法可以應(yīng)用于針對(duì)各種疾病的細(xì)胞免疫療法，這些疾病包括但不限于癌癥、傳染病、自身免疫性疾病和過(guò)敏性疾病。例如，高比例的造血器官腫瘤(比如白血病、骨髓增生異常綜合征、多發(fā)性骨髓瘤和惡性淋巴瘤)以及實(shí)體瘤(比如胃癌、結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌、生殖細(xì)胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前列腺癌、子宮癌、宮頸癌和卵巢癌)表達(dá)wt1基因。因此，當(dāng)通過(guò)將wt1抗原特異性tcr基因?qū)雐ps細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生tcr-ips細(xì)胞并且然后從tcr-ips細(xì)胞再生ctl細(xì)胞時(shí)，這樣的ctl細(xì)胞對(duì)于治療wt1基因表達(dá)癌的細(xì)胞免疫療法就是有效的。在提出的各種療法(其中從ips細(xì)胞分化的各種細(xì)胞或組織被移植，而不是t細(xì)胞被移植)中，期望移植的細(xì)胞在患者的整個(gè)生命當(dāng)中都會(huì)固定在他/她的體內(nèi)。在使用從同種異體移植用ips細(xì)胞庫(kù)再生的細(xì)胞或組織的再生性治療中，患者在其整個(gè)生命當(dāng)中都需要服用免疫抑制藥。相比于自體移植，這是一種缺點(diǎn)。另一方面，根據(jù)本申請(qǐng)從tcr-ips細(xì)胞再生的t細(xì)胞，同種異體移植的t細(xì)胞在一定時(shí)間段之后最終被排斥。也就是說(shuō)，基于甚至hla匹配的供體和受體中小的組織相容性抗原中的錯(cuò)誤配對(duì)，同種異體移植物最終會(huì)被排斥。鑒于此，本申請(qǐng)?zhí)峁┑募?xì)胞免疫療法優(yōu)于從ips細(xì)胞再生的細(xì)胞或組織的其它同種異體移植。此外，本方法不需要為每位患者制備細(xì)胞?？梢源鎯?chǔ)并使用預(yù)先制備的具有期望抗原特異性的tcr-ips細(xì)胞，或從tcr-ips細(xì)胞再生的t細(xì)胞祖細(xì)胞或成熟t細(xì)胞。因此，本方法的優(yōu)點(diǎn)不僅在于縮短了細(xì)胞免疫療法的準(zhǔn)備時(shí)間還能夠在移植之前檢驗(yàn)細(xì)胞的質(zhì)量。例如，可以提供靶向癌抗原的t細(xì)胞制備。例如，將編碼tcr的基因(已經(jīng)證實(shí)為在癌癥的tcr基因療法中安全有效)導(dǎo)入ips細(xì)胞(從具有純合的hla單倍體的供體建立的)中?？梢杂眠@些tcr-ips細(xì)胞形成ips細(xì)胞銀行。對(duì)于患有表達(dá)抗原(會(huì)被導(dǎo)入的tcr識(shí)別)的癌癥并具有雜合的hla單倍型的患者的治療來(lái)說(shuō)，可以從選自tcr-ips細(xì)胞銀行的tcr-ips細(xì)胞重新分化t細(xì)胞并將t細(xì)胞同種異體地投放于患者。為了提供更快的治療，可以預(yù)先從tcr-ips細(xì)胞再生t細(xì)胞祖細(xì)胞或t細(xì)胞并將其冷凍保存?？捎糜诒旧暾?qǐng)方法中的tcr基因的例子包括編碼wt1抗原特異性tcr的基因，該基因由愛(ài)媛大學(xué)的masakiyasukawa教授從tak-1細(xì)胞克隆而得(blood，95：286，2000；blood，118：1495，2011)。ips細(xì)胞可以是獲取自由ips細(xì)胞研究和應(yīng)用中心存儲(chǔ)在ips細(xì)胞庫(kù)項(xiàng)目下的那些。存在rikenbioresourcecenter(rikenbrc)的ips細(xì)胞株hps0077可以用作具有頻繁出現(xiàn)于日本人中的純合的hla單倍型的ips細(xì)胞。通過(guò)以下所示實(shí)施例將對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更加詳細(xì)的解釋?！緦?shí)施例1】其中導(dǎo)入有i類(lèi)限制性wt1抗原特異性tcr的ips細(xì)胞的建立本文使用的原始ips細(xì)胞為在日本京都的京都大學(xué)前沿醫(yī)藥科學(xué)研究所免疫學(xué)系制備的lmp2-t-ips細(xì)胞(克隆集落lmp2#1)。本文使用的hla-a2402限制性wt1特異性tcr是從克隆集落b10獲得，克隆集落b10是在日本大阪吹田市大阪大學(xué)的醫(yī)藥研究生學(xué)院免疫學(xué)系的免疫和造血實(shí)驗(yàn)室克隆得到的(anticancerresearch，32(12)：5201-5209，2012)。tcr以hla-a2402限制性方式識(shí)別具有氨基酸序列cmtwnqmnl(序列id號(hào)：4)的肽。1)通過(guò)cdna端的快速擴(kuò)增(race)來(lái)克隆wt1特異性tcr基因?qū)膚t1-t-ips細(xì)胞誘導(dǎo)的wt1特異性ctl克隆集落或ctl克隆集落進(jìn)行擴(kuò)增并且獲取細(xì)胞的rna。通過(guò)使用smarterracecdna擴(kuò)增試劑盒(clontechlaboratories,inc.)獲取全長(zhǎng)度cdna并將其用作模板。通過(guò)使用靶向tcrα鏈的3'端或tcrβ鏈的3'端的引物擴(kuò)增tcr基因，從而得到雙鏈wt1-tcrcdna，其中tcrα鏈為：cacaggctgtcttacaatcttgcagatc(序列id號(hào)：1)，tcrβ鏈為：ctccacttccagggctgccttca(序列id號(hào)：2)或tgacctgggatggttttggagcta(序列id號(hào)：3)。將如此獲得的雙鏈cdna插入pta2載體中(toyobo，見(jiàn)圖1)，然后將載體導(dǎo)入細(xì)胞株中。使用轉(zhuǎn)染細(xì)胞來(lái)評(píng)價(jià)wt1tcr的性能，其中包括wt1tcr特異性。2)結(jié)合有wt1-tcr的慢病毒載體的制備從日本茨城筑波的rikenbioresourcecenter的細(xì)胞命運(yùn)操縱分組獲得cs-ubc-rfa-ires2-venus載體(圖2)。采用gateway系統(tǒng)將wt-tcr基因結(jié)合到載體中從而得到cs-ubc-rfa-ires2-venus/wt1-tcr。3)導(dǎo)入有wt1-tcr的慢病毒的上清液的制備用x-treamgene9(roche)將cs-ubc-rfa-ires2-venus/wt1-tcr導(dǎo)入lentix-293t包裝細(xì)胞中。在第二天更換培養(yǎng)液，并且在第二天收集培養(yǎng)上清液并將其用作慢病毒上清液。4)轉(zhuǎn)染了wt1-tcr的t-ips細(xì)胞的建立用trypleselect(lifetechnologies)處理lmp2-t-ips細(xì)胞從而得到完全單細(xì)胞懸浮液。離心分離懸浮液并用慢病毒上清液將沉淀(pellet)分散，然后，將得到的懸浮液在32℃以3000rpm離心一個(gè)小時(shí)，從而感染慢病毒，之后，將wt1-tcr導(dǎo)入lmp2-t-ips細(xì)胞中。感染之后，將細(xì)胞懸浮在ips細(xì)胞用培養(yǎng)液中，然后接種在飼養(yǎng)細(xì)胞上?；诎谳d體中的venus蛋白的表達(dá)，將導(dǎo)入有wt1-tcr的lmp2-t-ips細(xì)胞(wt1-tcr/lmp2-t-ips細(xì)胞)進(jìn)行透視篩選。c.從培養(yǎng)物中拾取wt1-tcr/lmp2-t-ips細(xì)胞集落1.導(dǎo)入山中因子兩周后，目視觀察ips細(xì)胞集落。2.使用200μl的吸量頭機(jī)械拾取集落。3.單獨(dú)建立數(shù)個(gè)克隆集落。3)從ips細(xì)胞誘導(dǎo)t細(xì)胞。使用的培養(yǎng)液如下：【表1】培養(yǎng)液a：用于維持op9基質(zhì)細(xì)胞內(nèi)含物添加量最終濃度αmem培養(yǎng)液500mlfcs125ml20％青霉素-鏈霉素溶液*6.25ml1％總量631.25ml*青霉素(10000u/ml)和鏈霉素(10000μg/ml)的混合物。最終濃度分別為100u/ml和100μg/ml。【表2】培養(yǎng)液b：用于誘導(dǎo)t細(xì)胞的分化內(nèi)含物添加量最終濃度αmem培養(yǎng)液500mlfcs125ml20％青霉素-鏈霉素溶液*5ml1％hril-7(stock:10μg/ml)315μl5ng/mlhrflt-3l(stock:10μg/ml)315μl5ng/mlhrscf(stock:10μg/ml)630μl10ng/ml總量631.26ml*青霉素(10000u/ml)和鏈霉素(10000μg/ml)的混合物。最終濃度分別為100u/ml和100μg/ml?！颈?】培養(yǎng)液c：用于將未成熟t細(xì)胞誘導(dǎo)為成熟t細(xì)胞內(nèi)含物添加量最終濃度αmem培養(yǎng)液500mlfcs125ml20％青霉素-鏈霉素溶液*5ml1％hril-7(stock:10μg/ml)315μl5ng/ml總量630.315ml*青霉素(10000u/ml)和鏈霉素(10000μg/ml)的混合物。最終濃度分別為100u/ml和100μg/ml。a.op9細(xì)胞的制備將六毫升(6ml)的0.1％明膠溶液(在pbs中)添加到一個(gè)10cm的培養(yǎng)皿(falcon)并在37℃下培養(yǎng)30分鐘。然后去除明膠溶液并向培養(yǎng)皿中添加10ml培養(yǎng)液a。從一匯合培養(yǎng)物中獲取op9基質(zhì)細(xì)胞并將其接種到上述培養(yǎng)皿中。四天后，向培養(yǎng)皿中再添加10ml的培養(yǎng)液a(總量20ml)。b.從ips細(xì)胞誘導(dǎo)造血祖細(xì)胞吸出共培養(yǎng)用op9基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物中的培養(yǎng)液并用新鮮培養(yǎng)液a更換。吸出人類(lèi)ips細(xì)胞培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，然后加入10ml的新鮮培養(yǎng)液a。使用ez-passage輥切割ips細(xì)胞塊(ipscellmass)。使用帶有200μl吸頭的吸管將切割得到的ips細(xì)胞塊懸置。目測(cè)計(jì)算ips細(xì)胞簇(ipscellcluster)的數(shù)量，并將約600個(gè)細(xì)胞簇接種于op9細(xì)胞上。人類(lèi)ips細(xì)胞的每個(gè)克隆集落使用三個(gè)或更多培養(yǎng)皿，當(dāng)進(jìn)行繼代培養(yǎng)時(shí)，將所有培養(yǎng)皿中的細(xì)胞一次匯集在一個(gè)培養(yǎng)皿中，然后重新分配到相同數(shù)目的培養(yǎng)皿中，從而降低不同培養(yǎng)皿之間的差異。第1天：(更換培養(yǎng)液)確認(rèn)ips細(xì)胞塊是否粘附到培養(yǎng)皿以及是否開(kāi)始細(xì)胞分化。用20ml的新鮮培養(yǎng)液a更換細(xì)胞培養(yǎng)物中的培養(yǎng)液。第5天：(更換一半的培養(yǎng)液)用10ml的新鮮培養(yǎng)液a更換一半的細(xì)胞培養(yǎng)物中的培養(yǎng)液。第9天：(更換一半的培養(yǎng)液)用10ml的新鮮培養(yǎng)液a更換一半的細(xì)胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)液。第13天：(將誘導(dǎo)的中胚層細(xì)胞從op9細(xì)胞層轉(zhuǎn)移到op9/dll1細(xì)胞層)吸取去除細(xì)胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)液，并使用hbss(+mg+ca)洗掉培養(yǎng)細(xì)胞表面的培養(yǎng)液。將10ml的膠原酶iv250u(在hbss(+mg+ca)溶液中)添加到培養(yǎng)皿中，然后在37℃培養(yǎng)45分鐘。吸取去除膠原酶溶液并使用10mlpbs(-)清洗細(xì)胞。然后，將0.05％胰蛋白酶/edta溶液添加到培養(yǎng)皿中，在37℃培養(yǎng)20分鐘。培養(yǎng)之后，從培養(yǎng)皿的底部剝離片狀細(xì)胞聚集體，然后通過(guò)吹吸(pipetting)將細(xì)胞聚集體機(jī)械破碎至較小的尺寸。將如此處理的細(xì)胞加入20ml新鮮培養(yǎng)液a，并在37℃培養(yǎng)45分鐘。將含有漂浮細(xì)胞的培養(yǎng)液過(guò)100μm篩并收集細(xì)胞。然后將細(xì)胞在4℃以1200rpm離心7分鐘。將得到的沉淀懸浮于10ml的培養(yǎng)液b中。分離出十分之一的懸浮液用于facs分析。將剩余的細(xì)胞懸浮液接種到含有op9/dll1細(xì)胞的多個(gè)新培養(yǎng)皿上。將數(shù)個(gè)培養(yǎng)皿的細(xì)胞懸浮液進(jìn)行匯集，然后重新分配到相同數(shù)目的培養(yǎng)皿。為了確認(rèn)得到的細(xì)胞當(dāng)中是否含有造血祖細(xì)胞，使用抗cd34抗體和抗cd43抗體進(jìn)行facs分析。當(dāng)可以確認(rèn)足夠數(shù)量的細(xì)胞是在cd34lowcd43+細(xì)胞分級(jí)時(shí)，即確認(rèn)誘導(dǎo)形成了造血祖細(xì)胞。c.從造血祖細(xì)胞誘導(dǎo)t細(xì)胞。然后，得到的細(xì)胞接種于op9/dll1細(xì)胞上。在這一步驟中，不進(jìn)行cd34lowcd43+細(xì)胞分級(jí)的細(xì)胞分選。相比于不進(jìn)行分選的情況，當(dāng)此分級(jí)被分選時(shí)，由于分選造成的細(xì)胞減少或損失，t細(xì)胞的分化效率可能會(huì)降低。在培養(yǎng)期間，進(jìn)行數(shù)次facs分析用以確認(rèn)分化階段。在培養(yǎng)期間觀察到大量的死亡細(xì)胞。優(yōu)選地，在facs分析之前，通過(guò)使用例如碘化丙啶(pi)或7-aad將死亡細(xì)胞消除。第16天：(細(xì)胞的繼代培養(yǎng))通過(guò)輕輕數(shù)次吹吸將松散地粘附于op9/dll1細(xì)胞的細(xì)胞解離。將細(xì)胞過(guò)100μm篩，并收集到一個(gè)50ml錐形管中。將錐形管在4℃以1200rpm離心7分鐘。將沉淀分散在10ml培養(yǎng)液b中。然后將制得的細(xì)胞接種到的op9/dll1細(xì)胞上。第23天：(細(xì)胞的繼代培養(yǎng))血細(xì)胞集落開(kāi)始出現(xiàn)通過(guò)輕輕數(shù)次吹吸將松散地粘附于op9/dll1細(xì)胞的細(xì)胞解離。將細(xì)胞過(guò)100μm篩，并收集到一個(gè)50ml錐形管中。將錐形管在4℃以1200rpm離心7分鐘。將沉淀分散在10ml培養(yǎng)液b中。然后將制得的細(xì)胞接種到的op9/dll1細(xì)胞上。第30天：(細(xì)胞的繼代培養(yǎng))通過(guò)輕輕數(shù)次吹吸將松散地粘附于op9/dll1細(xì)胞的細(xì)胞解離。將細(xì)胞過(guò)100μm篩，并收集到一個(gè)50ml錐形管中。將錐形管在4℃以1200rpm離心7分鐘。將沉淀分散在10ml培養(yǎng)液b中。然后將制得的細(xì)胞接種到的op9/dll1細(xì)胞上。第37天：細(xì)胞的繼代培養(yǎng)通過(guò)輕輕數(shù)次吹吸將松散地粘附于op9/dll1細(xì)胞的細(xì)胞解離。將細(xì)胞過(guò)100μm篩，并收集到一個(gè)50ml錐形管中。將錐形管在4℃以1200rpm離心7分鐘。將沉淀分散在10ml培養(yǎng)液b中。然后將制得的細(xì)胞接種到的op9/dll1細(xì)胞上。第44天：cd4+cd8+t細(xì)胞被確認(rèn)并開(kāi)始誘導(dǎo)為cd8sp細(xì)胞為了確認(rèn)t細(xì)胞正如期望地被誘導(dǎo)，在第44天用抗cd4抗體和抗cd8抗體對(duì)細(xì)胞進(jìn)行facs分析。確認(rèn)生成了cd4+cd8+細(xì)胞。然后，將抗cd3/28抗體和huil-2加入細(xì)胞中。以3×105個(gè)細(xì)胞/孔的密度將含有cd4+cd8+細(xì)胞的t細(xì)胞接種到24孔板的每個(gè)孔中的新鮮op9/dll1細(xì)胞層上。將抗cd3抗體(50ng/ml)、抗cd28抗體(2ng/ml)和huil-2(200u/ml)一起添加個(gè)每個(gè)孔中。第50天：觀察到了cd4-cd8+細(xì)胞。在添加抗cd3抗體的第6天，生成了成熟的cd8單陽(yáng)性細(xì)胞。用wt1四聚體和抗cd3抗體使生成的細(xì)胞染色(圖3)。確認(rèn)生成了表達(dá)導(dǎo)入的wt1-tcr的t細(xì)胞。【實(shí)施例2】導(dǎo)入有i類(lèi)限制性wt1抗原特異性tcr且?guī)в屑兒系膆la的ips細(xì)胞的建立原始ips細(xì)胞是在日本京都的京都大學(xué)前沿醫(yī)藥科學(xué)研究所免疫學(xué)系從健康供體的末梢血單核細(xì)胞建立的。ips細(xì)胞克隆集落具有純合的hla單倍型：hla-a*33:03；b*44:03；c*140:3；drb1*1302。hla-a0201限制性wt1特異性tcr源自于opt3e2，是在日本大阪吹田市的大阪大學(xué)藥學(xué)研究生院免疫學(xué)系的免疫和造血實(shí)驗(yàn)室克隆而來(lái)的。tcr識(shí)別具有氨基酸序列rmfpnapyl(序列id號(hào)：5)的肽。制備載體并將其按照與實(shí)施例1相同的方式轉(zhuǎn)染到ips細(xì)胞中。1.使用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)染有所述基因的ips細(xì)胞的單細(xì)胞懸浮液進(jìn)行分析。確認(rèn)了：編碼hla-a0201限制性wt1特異性tcr的基因被有效地導(dǎo)入了ips細(xì)胞中(圖4)。2.將轉(zhuǎn)染有tcr基因的ips細(xì)胞接種在培養(yǎng)皿上進(jìn)行克隆擴(kuò)增。圖5示出了一周培養(yǎng)后的ips細(xì)胞集落。確認(rèn)了導(dǎo)入有所述基因的ips細(xì)胞集落為熒光陽(yáng)性集落。圖5確認(rèn)得到了導(dǎo)入有編碼hla-a0201限制性wt1特異性tcr的基因的ips細(xì)胞克隆集落。然后，拾取陽(yáng)性集落?！緦?shí)施例3】導(dǎo)入有ii類(lèi)限制性wt1抗原特異性tcr且?guī)в屑兒系膆la的ips細(xì)胞的建立按照與實(shí)施例2中相同的方法，原始ips細(xì)胞是在日本京都的京都大學(xué)前沿醫(yī)藥科學(xué)研究所免疫學(xué)系從健康供體的末梢血單核細(xì)胞建立的。ips細(xì)胞系具有純合的hla。ii類(lèi)限制性wt1特異性tcr基因源自于克隆集落k和克隆集落10，是在日本大阪吹田市的大阪大學(xué)藥學(xué)研究生院免疫學(xué)系的免疫和造血實(shí)驗(yàn)室克隆而來(lái)的?？寺〖鋕和克隆集落10分別限于hla-drb1*0405和hla-dpb1*0501，并且識(shí)別肽序列wt1-332(kryfklshlqmhsrkh(序列id號(hào)：6)(microbiolimmunol，52：591-600，2008)制備載體并將其按照與實(shí)施例1相同的方式轉(zhuǎn)染到ips細(xì)胞中。1.使用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)染有所述基因的ips細(xì)胞的單細(xì)胞懸浮液進(jìn)行分析。結(jié)果如圖6中所示。確認(rèn)了：源自于克隆集落10和克隆集落k的wt1特異性tcr正如期望地被導(dǎo)入到了ips細(xì)胞中?！緦?shí)施例4】導(dǎo)入有i類(lèi)限制性wt1抗原特異性tcr且?guī)в屑兒系膆la的ips細(xì)胞的建立按照與實(shí)施例2中相同的方法，原始ips細(xì)胞是在日本京都的京都大學(xué)前沿醫(yī)藥科學(xué)研究所免疫學(xué)系從健康供體的末梢血單核細(xì)胞建立的。ips細(xì)胞株具有純合的hla。i類(lèi)限制性wt1特異性tcr基因是在日本京都的京都大學(xué)前沿醫(yī)藥科學(xué)研究所免疫學(xué)系從克隆集落wt1#9和克隆集落wt1#3-3克隆而來(lái)。制備載體并將其按照與實(shí)施例1相同的方式轉(zhuǎn)染到ips細(xì)胞中。2.使用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)染有所述基因的ips細(xì)胞的單細(xì)胞懸浮液進(jìn)行分析。結(jié)果如圖7中所示。確認(rèn)了：源自于克隆集落#9和克隆集落#3-3的wt1特異性tcr基因正如期望地被導(dǎo)入ips細(xì)胞中。sequencelisting<110>河本宏<120>用于建立具有編碼抗原特異性t細(xì)胞受體的基因的多能性干細(xì)胞的方法<130>672488<150>62/026336<151>2014-07-18<160>6<170>patentinversion3.5<210>1<211>28<212>dna<213>人工<220><223>pcr引物<400>1cacaggctgtcttacaatcttgcagatc28<210>2<211>23<212>dna<213>人工<220><223>pcr引物<400>2ctccacttccagggctgccttca23<210>3<211>24<212>dna<213>人工sequence<220><223>pcr引物<400>3tgacctgggatggttttggagcta24<210>4<211>9<212>prt<213>homosapiens<400>4cysmetthrtrpasnglnmetasnleu15<210>5<211>9<212>prt<213>homosapiens<400>5argmetpheproasnalaprotyrleu15<210>6<211>16<212>prt<213>homosapiens<400>6lysargtyrphelysleuserhisleuglnmethisserarglyshis151015當(dāng)前第1頁(yè)12