本發(fā)明涉及與不綴合至免疫球蛋白Fc片段的生理活性蛋白或肽的溶解度相比，改善生理活性蛋白或肽的溶解度的方法，該方法包括將生理活性蛋白或肽綴合至免疫球蛋白Fc片段的步驟，并且涉及用于改善生理活性蛋白或肽的溶解度的組合物，其包含免疫球蛋白Fc片段，其中與不含免疫球蛋白Fc片段的組合物相比，該組合物改善溶解度。
背景技術(shù)：
：只有當(dāng)藥物被溶解時(shí)，它們才展現(xiàn)藥理作用，因而藥物的溶解度與效力密切相關(guān)。水溶性藥物容易被制備為可注射制劑，并且當(dāng)作為片劑被攝入時(shí)在胃腸道中溶解。但是，當(dāng)在不增溶的情況下攝入時(shí)，水溶性差的藥物作為聚集體比如沉淀物(pellet)存在于胃腸道中，并且它們不溶解為單個(gè)分子并且難以被吸收。進(jìn)一步，當(dāng)水溶性差的藥物在不增溶的情況下被用作可注射制劑時(shí)，血管阻塞造成血液凝結(jié)。因此，水溶性差的藥物不能被用作可注射制劑。藥物溶解度是藥物制劑中的主要挑戰(zhàn)。已知的藥物增溶方法中的一種是使用表面活性劑作為增溶劑。表面活性劑在每個(gè)分子中具有疏水和親水基團(tuán)二者。在水中，疏水烴鏈被隔絕在內(nèi)部并且親水基團(tuán)暴露于水以形成球形膠團(tuán)。藥物可以通過(guò)封裝在膠團(tuán)中溶解。但是，當(dāng)在該方法中使用高濃度的表面活性劑時(shí)，藥物可能不適合于靜脈內(nèi)施用。進(jìn)一步，將微乳液稀釋低于表面活性劑的臨界膠團(tuán)濃度可能引起藥物在膠團(tuán)中的沉淀(JournalofAdvancedPharmacyEducation&Research2(1)32-67(2012)ISSN2249-3379)。因此，對(duì)于不管制劑的濃度如何不使用表面活性劑持續(xù)增加藥物溶解度的方法存在需要。公開內(nèi)容技術(shù)問(wèn)題在這種背景下，本發(fā)明人已經(jīng)進(jìn)行了許多努力來(lái)研發(fā)能夠改善藥物比如生理活性蛋白或肽的溶解度的方法。結(jié)果，他們發(fā)現(xiàn)了當(dāng)免疫球蛋白Fc片段綴合至生理活性蛋白或肽時(shí)，生理活性蛋白或肽的溶解度有效地增加從而容易地制備包含藥學(xué)上有效濃度的生理活性蛋白或肽的制劑，從而完成本發(fā)明。技術(shù)方案本發(fā)明的目標(biāo)是提供與不綴合至免疫球蛋白Fc片段的生理活性蛋白或肽的溶解度相比，改善生理活性蛋白或肽的溶解度的方法，其中該方法包括將生理活性蛋白或肽綴合至免疫球蛋白Fc片段。本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是提供用于改善生理活性蛋白或肽的溶解度的組合物，其包含免疫球蛋白Fc片段，其中與不含免疫球蛋白Fc片段的組合物相比，該組合物改善溶解度。有益效果當(dāng)根據(jù)本發(fā)明生理活性蛋白或肽與免疫球蛋白Fc片段綴合時(shí)，生理活性蛋白或肽的溶解度可以被有效地改善，并且因而在各種藥物的制劑中是有效的。附圖描述圖1示出了胰島素和長(zhǎng)效胰島素綴合物的標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)曲線。圖2示出了檢查根據(jù)表1的組合物的胰島素和長(zhǎng)效胰島素綴合物的溶解度的結(jié)果，其中胰島素示出了0.628mg/mL的溶解度，并且長(zhǎng)效胰島素綴合物以胰島素為基礎(chǔ)示出了15mg/mL的溶解度。圖3示出了SEQIDNO：27的泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物和泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物-PEG-免疫球蛋白Fc片段綴合物的標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)曲線。圖4示出了檢查根據(jù)表4的組合物的SEQIDNO：27的泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物和泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物-PEG-免疫球蛋白Fc片段綴合物的溶解度的結(jié)果，其中泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物示出了0.188mg/mL的溶解度，并且綴合物以泌酸調(diào)節(jié)肽為基礎(chǔ)示出了11mg/mL的溶解度。最佳方式本發(fā)明的方面提供了與不綴合至免疫球蛋白Fc片段的生理活性蛋白或肽的溶解度相比，改善生理活性蛋白或肽的溶解度的方法，其中該方法包括將生理活性蛋白或肽綴合至免疫球蛋白Fc片段。在具體實(shí)施方式中，應(yīng)用于根據(jù)本發(fā)明的方法的免疫球蛋白Fc片段是源自IgG、IgA、IgD、IgE或IgM的Fc片段。在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，應(yīng)用于根據(jù)本發(fā)明的方法的免疫球蛋白Fc片段是結(jié)構(gòu)域的混合物(hybrid)，其中每個(gè)結(jié)構(gòu)域具有源自免疫球蛋白的不同起源，該免疫球蛋白選自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM。在仍另一個(gè)具體實(shí)施方式中，應(yīng)用于根據(jù)本發(fā)明的方法的免疫球蛋白Fc片段是由相同起源的單鏈免疫球蛋白組成的二聚體或多聚體。在仍另一個(gè)具體實(shí)施方式中，應(yīng)用于根據(jù)本發(fā)明的方法的免疫球蛋白Fc片段是人無(wú)糖基化的(aglycosylated)IgG4Fc片段。在仍另一個(gè)具體實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的綴合步驟包括經(jīng)由非肽基聚合物將生理活性蛋白或肽連接至免疫球蛋白Fc片段。在仍另一個(gè)具體實(shí)施方式中，通過(guò)根據(jù)本發(fā)明的方法制備的與免疫球蛋白Fc片段綴合的生理活性蛋白或肽是融合蛋白的形式。在仍另一個(gè)具體實(shí)施方式中，應(yīng)用于根據(jù)本發(fā)明的方法的非肽基聚合物是聚乙二醇。在仍另一個(gè)具體實(shí)施方式中，應(yīng)用于根據(jù)本發(fā)明的方法的非肽基聚合物選自聚丙二醇、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚氧乙烯化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯乙醚、生物可降解聚合物比如聚乳酸(PLA)和聚乳酸-乙醇酸(PLGA)、脂質(zhì)聚合物、幾丁質(zhì)、透明質(zhì)酸和其組合。在仍另一個(gè)具體實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的方法是為了改善生理活性蛋白或肽在水溶液中的溶解度。在仍另一個(gè)具體實(shí)施方式中，應(yīng)用于根據(jù)本發(fā)明的方法的水溶液包括檸檬酸或醋酸緩沖液、作為非離子型表面活性劑的聚山梨醇酯、作為糖醇的甘露醇和作為等滲劑的氯化鈉或甲硫氨酸。在仍另一個(gè)具體實(shí)施方式中，應(yīng)用于根據(jù)本發(fā)明的方法的水溶液具有從5.0到7.0的pH。在仍另一個(gè)具體實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的方法中的生理活性蛋白或肽是毒蜥外泌肽-4(exendin-4)、胰高血糖素、胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)、胰高血糖素樣肽-2(GLP-2)、甲狀旁腺激素(PTH)、降鈣素、胰島素或泌酸調(diào)節(jié)肽。在仍另一個(gè)具體實(shí)施方式中，應(yīng)用于根據(jù)本發(fā)明的方法的水溶液進(jìn)一步包含表面活性劑。另一個(gè)方面提供了用于改善生理活性蛋白或肽的溶解度的組合物，其包含免疫球蛋白Fc片段，其中與不包含免疫球蛋白Fc片段的組合物相比，該組合物改善溶解度。在具體實(shí)施方式中，該組合物包括生理活性蛋白或肽和免疫球蛋白Fc片段的綴合物，其中生理活性蛋白或肽作為活性成分經(jīng)由肽基連接體或非肽基連接體連接至免疫球蛋白Fc片段。發(fā)明的方式本發(fā)明提供了與不綴合至免疫球蛋白Fc片段的生理活性蛋白或肽的溶解度相比，改善生理活性蛋白或肽的溶解度的方法，其中該方法包括將生理活性蛋白或肽綴合至免疫球蛋白Fc片段。甚至在不添加表面活性劑至溶劑的情況下，本發(fā)明的方法展示了改善生理活性蛋白或肽的溶解度的效果。在生理活性蛋白或肽——具體而言，胰島素、泌酸調(diào)節(jié)肽等——是已知蛋白藥物的成分的情況下，其展示了在從5到7的pH范圍中的低溶解度，該pH范圍是用于身體施用的制劑的一般pH范圍。因此，困難在于將生理活性蛋白或肽制備成期望濃度的制劑。問(wèn)題還在于其可注射制劑可能引起在身體中的沉淀以產(chǎn)生意外的副作用。出人意料地，本發(fā)明確認(rèn)了當(dāng)生理活性蛋白或肽與免疫球蛋白Fc片段綴合時(shí)，其顯示了在上述pH范圍中的增加的溶解度。即，本發(fā)明的方法具有改善在5到7的弱酸性pH范圍中顯示低溶解度的肽或蛋白質(zhì)——比如胰島素或泌酸調(diào)節(jié)肽——的溶解度的效果。如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“溶解度(solubility)”指的是生理活性蛋白或肽在適合于人體施用的溶劑中溶解的程度。具體而言，其指的是在具體溫度下溶質(zhì)在給定溶劑中的飽和程度。溶解度可以通過(guò)測(cè)定飽和點(diǎn)處的溶質(zhì)濃度來(lái)測(cè)量。例如，在將過(guò)量的溶質(zhì)加入到溶劑，然后攪拌并過(guò)濾溶液之后，可以使用UV分光光度計(jì)或HPLC測(cè)量濃度，但不限于此。為了將生理活性蛋白或肽用于治療，重要的是在溶劑中溶解其藥學(xué)上有效量，其為在測(cè)定重構(gòu)之后的凍干制劑的濃度或液體制劑的活性成分的濃度中應(yīng)當(dāng)被考慮的重要因素。已經(jīng)確認(rèn)了當(dāng)生理活性蛋白或肽與免疫球蛋白Fc片段綴合時(shí)，與不連接片段的生理活性蛋白或肽相比，其溶解度顯著地增加。以此為基礎(chǔ)，本發(fā)明的特征在于生理活性蛋白或肽在水溶液中的溶解度得以改善。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，當(dāng)胰島素或泌酸調(diào)節(jié)肽被用作代表性的生理活性肽并且免疫球蛋白Fc綴合至其時(shí)，胰島素或泌酸調(diào)節(jié)肽的溶解度顯著增加(圖2和4)。如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“水溶液”指的是意圖溶解生理活性蛋白或肽的溶液。水溶液是適合于將生理活性蛋白或肽施用至人體的溶液。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，水溶液可以具有中性或弱酸性pH，例如，5.0到7.0的pH。應(yīng)用于本發(fā)明的方法的水溶液不限于特定類型，但是其可以具有檸檬酸或醋酸緩沖液——其包含作為非離子型表面活性劑的聚山梨醇酯、作為糖醇的甘露醇和作為等滲劑的氯化鈉或甲硫氨酸。在根據(jù)本發(fā)明的方法中，免疫球蛋白Fc片段可以經(jīng)由非肽基聚合物連接至生理活性蛋白或肽。具體而言，免疫球蛋白Fc片段可以連接至與生理活性蛋白或肽連接的非肽基聚合物，或者免疫球蛋白Fc片段-非肽基聚合物可以連接至生理活性蛋白或肽。如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“非肽基聚合物”指的是生物相容性聚合物，其包含通過(guò)除了肽鍵之外的共價(jià)鍵彼此連接的一個(gè)或多個(gè)重復(fù)單位。可以在本發(fā)明中使用的非肽基聚合物可以選自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚氧乙烯化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯乙醚、生物可降解聚合物比如PLA(聚乳酸)和PLGA(聚乳酸-乙醇酸)、脂質(zhì)聚合物、幾丁質(zhì)、透明質(zhì)酸和其組合，并且優(yōu)選地，聚乙二醇，但不限于此。而且，在本領(lǐng)域中熟知的和在本領(lǐng)域的技能內(nèi)容易制備的其衍生物包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。可以非限制地使用任何非肽基聚合物，只要其是如此聚合物：該聚合物對(duì)體內(nèi)蛋白水解酶具有抗性，并且因而不容易被蛋白水解酶切割從而使得免疫球蛋白Fc片段起載體的功能。該非肽基聚合物的分子量在1kDa到100kDa，并且具體地1kDa到20kDa的范圍內(nèi)。而且，連接至免疫球蛋白Fc片段的本發(fā)明的非肽基聚合物可以是一種聚合物或者不同類型的聚合物的組合。該非肽基聚合物可以具有能夠結(jié)合至免疫球蛋白Fc片段和蛋白質(zhì)或肽藥物的反應(yīng)基團(tuán)，并且因而起連接體的功能以將免疫球蛋白Fc片段與蛋白質(zhì)或肽連接。使用非肽基聚合物作為連接體將生理活性蛋白或肽與免疫球蛋白Fc片段連接可以通過(guò)順序地執(zhí)行以下步驟實(shí)現(xiàn)：(1)使非肽基聚合物與生理活性蛋白或肽和免疫球蛋白Fc片段中的任一種反應(yīng)；和(2)使步驟(1)的反應(yīng)產(chǎn)物與生理活性蛋白或肽和免疫球蛋白Fc片段中的另一種反應(yīng)。但是，如果在步驟(1)中，免疫球蛋白Fc片段連接至在兩端具有反應(yīng)基團(tuán)的非肽基聚合物，則步驟(1)的部分產(chǎn)物可以是橋接(bridge)的形式，其中免疫球蛋白Fc片段的兩個(gè)N末端在特定的反應(yīng)條件下連接至非肽基聚合物的兩端。橋接形式的步驟(1)的產(chǎn)物可能阻止將生理活性蛋白或肽連接至其的二次耦聯(lián)反應(yīng)或者可能大大地降低耦聯(lián)產(chǎn)率。因此，在實(shí)施方式中，為了阻止免疫球蛋白Fc片段和免疫球蛋白Fc片段之間的橋接形成，順序地，可以首先將非肽基聚合物和生理活性蛋白或肽反應(yīng)，然后可以將非肽基聚合物連接的生理活性蛋白或肽與免疫球蛋白Fc片段反應(yīng)。但是，沒(méi)有必要以該順序執(zhí)行本發(fā)明的改善溶解度的方法。在步驟(1)中，用于將非肽基聚合物連接至生理活性蛋白或肽或免疫球蛋白Fc片段的化學(xué)反應(yīng)可以通過(guò)已知方法執(zhí)行。例如，在兩端具有反應(yīng)基團(tuán)的非肽基聚合物可以在0℃至25℃下與生理活性蛋白或肽或免疫球蛋白Fc片段反應(yīng)1小時(shí)至16小時(shí)。通過(guò)該反應(yīng)，生理活性蛋白或肽或免疫球蛋白Fc片段可以經(jīng)由反應(yīng)基團(tuán)共價(jià)地連接至一個(gè)非肽基聚合物。在步驟(1)中將生理活性蛋白或肽連接至非肽基聚合物的反應(yīng)可以在包含有機(jī)溶劑的反應(yīng)溶液中執(zhí)行。就此而言，有機(jī)溶劑可以是本領(lǐng)域中通常使用的任何有機(jī)溶劑，具體地伯醇、仲醇或叔醇、和具有1到10個(gè)碳原子的醇，但是不限于此。更具體地，醇可以是異丙醇、乙醇或甲醇。有機(jī)溶劑可以自由地選自適合于生理活性蛋白或肽的類型的有機(jī)溶劑。進(jìn)一步，有機(jī)溶劑可以用于生理活性蛋白或肽和非肽基聚合物之間的連接，基于反應(yīng)溶液的總量，具體地以10％到60％的量，更具體地以30％到55％的量，并且更具體地以45％到55％的量包含有機(jī)溶劑，但是不限于此。進(jìn)一步，反應(yīng)溶液的pH可以是，具體地4.5到7.0，并且更具體地5.0到6.5，但不限于此。進(jìn)一步，根據(jù)參與反應(yīng)的反應(yīng)基團(tuán)的類型，可以進(jìn)一步包括還原劑來(lái)執(zhí)行上述步驟。具體地，本發(fā)明的還原劑指的是本領(lǐng)域中已知的任何還原劑，其功能是還原由非肽基聚合物的醛基和多肽(生理活性蛋白或肽、免疫球蛋白Fc片段)的胺基之間的結(jié)合產(chǎn)生的可逆的亞胺雙鍵以形成共價(jià)鍵。關(guān)于本發(fā)明的目標(biāo)，為了使得非肽基聚合物與生理活性蛋白或肽或免疫球蛋白Fc片段之間共價(jià)結(jié)合，還原劑可以包含在反應(yīng)溶液中。本發(fā)明的還原劑可以是本領(lǐng)域中已知的任何還原劑，優(yōu)選地氰基硼氰化鈉、硼烷吡啶復(fù)合物、硼氫化鈉、硼烷二甲胺復(fù)合物、硼烷三甲胺復(fù)合物或三乙酰氧基硼氫化鈉，但不限于此。根據(jù)生理活性多肽或免疫球蛋白恒定區(qū)和反應(yīng)溶劑的種類，可以選擇適當(dāng)?shù)倪€原劑。進(jìn)一步，可以包含1mM到20mM的終濃度的還原劑，用于生理活性蛋白或肽與非肽基聚合物，或免疫球蛋白Fc片段與非肽基聚合物之間的連接反應(yīng)(步驟(1)的反應(yīng))；和1mM到100mM的終濃度的還原劑，用于耦聯(lián)反應(yīng)(步驟(2)的反應(yīng))。同時(shí)，非肽基聚合物可以在兩端具有反應(yīng)基團(tuán)，每個(gè)反應(yīng)基團(tuán)能夠結(jié)合至免疫球蛋白Fc片段和生理活性蛋白或肽，具體地，每個(gè)反應(yīng)基團(tuán)能夠結(jié)合至生理活性蛋白或肽的N末端或賴氨酸的胺基，或半胱氨酸的巰基；或結(jié)合至免疫球蛋白Fc片段。在兩端的反應(yīng)基團(tuán)具體地選自反應(yīng)醛基、丙醛基團(tuán)、丁醛基團(tuán)、馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)和琥珀酰亞胺衍生物。就此而言，琥珀酰亞胺衍生物可以是琥珀酰亞胺基羧甲基(succinimidylcarboxymethyl)、戊酸琥珀酰亞胺酯、甲基丁酸琥珀酰亞胺酯、甲基丙酸琥珀酰亞胺酯、丁酸琥珀酰亞胺酯、丙酸琥珀酰亞胺酯、N-羥基琥珀酰亞胺或碳酸琥珀酰亞胺酯，但不限于此?？梢苑窍拗菩缘厥褂萌魏畏磻?yīng)基團(tuán)，只要其結(jié)合至免疫球蛋白Fc片段和生理活性蛋白或肽的氨基酸殘基的胺基或巰基。具體而言，當(dāng)非肽基聚合物在兩端具有反應(yīng)醛基時(shí)，在兩端以最小的非特異性反應(yīng)將生理活性蛋白或肽與免疫球蛋白連接是有效的。通過(guò)醛鍵的還原烷基化生成的最終產(chǎn)物比通過(guò)酰胺鍵連接時(shí)更穩(wěn)定得多。醛反應(yīng)基團(tuán)在低pH下選擇性地結(jié)合至N末端，并且可以在高pH下——例如，在9.0的pH下——結(jié)合至賴氨酸殘基(Lys)以形成共價(jià)鍵。作為非肽基聚合物的連接體的兩端的反應(yīng)基團(tuán)可以彼此相同或不同。例如，連接體可以在一端具有馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)，并且在另一端具有醛基、丙醛基團(tuán)或丁醛基團(tuán)。當(dāng)在其兩端具有反應(yīng)羥基的聚乙二醇被用作非肽基聚合物時(shí)，羥基可以通過(guò)已知的化學(xué)反應(yīng)被活化為不同的反應(yīng)基團(tuán)，或者具有修飾的反應(yīng)基團(tuán)的商業(yè)可得的聚乙二醇可以被用于制備本發(fā)明的長(zhǎng)效蛋白綴合物。進(jìn)一步，非肽基聚合物的反應(yīng)基團(tuán)可以分別結(jié)合至生理活性蛋白或肽和免疫球蛋白Fc片段的N末端胺基或賴氨酸殘基的側(cè)鏈胺基，但是不具體地限于此。就此而言，生理活性蛋白或肽和免疫球蛋白Fc片段上的賴氨酸殘基不限于具體的位置，并且該賴氨酸殘基的非限制性實(shí)例還包括非天然氨基酸和Lys衍生物——只要它們具有能夠結(jié)合至非肽基聚合物的反應(yīng)基團(tuán)的胺基——以及天然賴氨酸。同時(shí)，當(dāng)在步驟(1)中首先生理活性蛋白或肽與非肽基聚合物反應(yīng)時(shí)，生理活性蛋白或肽和非肽基聚合物以1∶1到1∶20的摩爾比反應(yīng)，并且在步驟(2)中，為步驟(1)的產(chǎn)物的生理活性蛋白或肽和非肽基聚合物的綴合物與免疫球蛋白Fc片段以1∶0.5到1∶10的摩爾比反應(yīng)，但不限于此。此外，本發(fā)明的方法可以包括在步驟(1)之后在步驟(2)之前分離和純化為步驟(1)的產(chǎn)物的生理活性多肽-非肽基聚合物綴合物或免疫球蛋白Fc片段-非肽基聚合物綴合物的過(guò)程。該過(guò)程可以使用本領(lǐng)域中已知的各種分離方法執(zhí)行，比如色譜法。在步驟(2)中，當(dāng)生理活性多肽-非肽基聚合物綴合物與免疫球蛋白Fc片段反應(yīng)時(shí)，pH條件為4.0到9.0的pH，但是不具體地限于此。同時(shí)，生理活性蛋白或肽和免疫球蛋白Fc片段可以以融合蛋白的形式彼此綴合。如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“融合蛋白”指的是通過(guò)最初編碼單獨(dú)蛋白的兩個(gè)或更多個(gè)基因的接合產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。融合蛋白可以通過(guò)重組DNA技術(shù)人工地制備。進(jìn)一步，融合蛋白可以是如此形式：其中生理活性蛋白或肽和免疫球蛋白Fc片段不經(jīng)由連接體或經(jīng)由肽基連接體彼此連接。在本文中，肽基連接體指的是連接組成融合蛋白的兩種蛋白質(zhì)的肽?？梢园幕B接體以便于獨(dú)立地折疊組成融合蛋白的兩種蛋白質(zhì)或者維持甚至處于融合蛋白形式的兩種蛋白質(zhì)的每種功能，但不限于此。如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“免疫球蛋白Fc片段”指的是免疫球蛋白的重鏈恒定區(qū)2(CH2)和重鏈恒定區(qū)3(CH3)，不包括重鏈和輕鏈的可變區(qū)、免疫球蛋白的重鏈恒定區(qū)1(CH1)和輕鏈恒定區(qū)1(CL1)，并且其可以包括在重鏈恒定區(qū)處的鉸鏈區(qū)。進(jìn)一步，本發(fā)明的免疫球蛋白Fc片段可以是擴(kuò)展的免疫球蛋白Fc片段，其包括重鏈恒定區(qū)1(CH1)和/或輕鏈恒定區(qū)1(CL1)的部分或全部，不包括免疫球蛋白的重鏈和輕鏈的可變區(qū)，只要其具有與天然蛋白相比基本上相似的或更好的效果。而且，其可以是在CH2和/或CH3的氨基酸序列的相對(duì)長(zhǎng)的部分中具有缺失的區(qū)域。即，本發(fā)明的免疫球蛋白Fc片段可以包括(1)CH1結(jié)構(gòu)域、CH2結(jié)構(gòu)域、CH3結(jié)構(gòu)域和CH4結(jié)構(gòu)域，(2)CH1結(jié)構(gòu)域和CH2結(jié)構(gòu)域，(3)CH1結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域，(4)CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域，(5)恒定區(qū)的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域和免疫球蛋白鉸鏈區(qū)(或鉸鏈區(qū)的一部分)的組合，和(6)重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)的每個(gè)結(jié)構(gòu)域的二聚體。關(guān)于本發(fā)明的目標(biāo)，免疫球蛋白Fc片段指的是具有增加結(jié)合至其的藥物——即，生理活性蛋白或肽——的溶解度的效果的物質(zhì)，并且其還可以指藥物載體。如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“載體”指的是與藥物結(jié)合在一起的物質(zhì)。一般而言，載體結(jié)合至藥物以增加或消除藥物的生理學(xué)活性。但是，關(guān)于本發(fā)明的目標(biāo)，本發(fā)明的載體指的是如此物質(zhì)：其通過(guò)在皮下施用之后延遲藥物從施用位點(diǎn)到血液的遞送，使藥物的生理學(xué)活性的降低最小化并且增加藥物的體內(nèi)穩(wěn)定性和效力的持續(xù)時(shí)間，并且同時(shí)還改善蛋白質(zhì)或肽的溶解度。作為藥物載體，已經(jīng)研究了多種物質(zhì)，比如脂質(zhì)、聚合物等，但是本發(fā)明提供了免疫球蛋白Fc片段作為載體，用于改善與載體連接的藥物的體內(nèi)持續(xù)時(shí)間，使體內(nèi)活性的降低最小化，并且還使溶解度最大化。進(jìn)一步，免疫球蛋白Fc片段是在體內(nèi)可以代謝的生物可降解的多肽，所以其可以安全地被用作藥物載體。由于該特性，在其中免疫球蛋白Fc片段連接至生理活性蛋白或肽的綴合物可以被指定為本發(fā)明的長(zhǎng)效綴合物。進(jìn)一步，本發(fā)明中用于改善生理活性蛋白或肽的溶解度的免疫球蛋白Fc片段可以經(jīng)由連接體或直接地連接至生理活性蛋白或肽。就此而言，生理活性蛋白或肽與免疫球蛋白Fc片段連接的位點(diǎn)沒(méi)有被具體地限制，并且在蛋白質(zhì)或肽內(nèi)或在N末端或C末端處的任何位點(diǎn)是可能的。但是，為了使得當(dāng)施用給人體時(shí)由本發(fā)明的方法制備的生理活性蛋白或肽和免疫球蛋白Fc片段的綴合物展示生理學(xué)活性，根據(jù)待被應(yīng)用的生理活性蛋白或肽的類型優(yōu)選地選擇不抑制生理學(xué)活性的位點(diǎn)，但是不限于此。此外，在綴合物的產(chǎn)生、純化和產(chǎn)率方面，與整個(gè)免疫球蛋白分子相比，由于免疫球蛋白Fc片段相對(duì)低的分子量，其是更有優(yōu)勢(shì)的。進(jìn)一步，由于其不含F(xiàn)ab——Fab由于一種抗體與另一種在氨基酸序列的差別展示高的非同質(zhì)性(non-homogeneity)，其被預(yù)期為顯著地增強(qiáng)同質(zhì)性并且降低誘導(dǎo)血液抗原性的可能性。進(jìn)一步，本發(fā)明的免疫球蛋白Fc片段不僅包括天然氨基酸序列而且包括其序列衍生物。氨基酸序列衍生物意思是其具有與野生型氨基酸序列不同的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，并且其可以天然發(fā)生或者可以人工地生成。免疫球蛋白Fc片段包括由于缺失、插入、保守或非保守置換、或其組合導(dǎo)致的衍生物。插入通常通過(guò)大約1到20個(gè)氨基酸的連續(xù)氨基酸序列的添加進(jìn)行，或者可以利用更長(zhǎng)的序列進(jìn)行。缺失通常在大約1到30個(gè)氨基酸殘基的范圍內(nèi)。制備免疫球蛋白Fc片段的序列衍生物的技術(shù)在國(guó)際專利公布號(hào)WO97/34631和WO96/32478中公開，其通過(guò)引用并入本文。通常不改變分子的活性的蛋白質(zhì)和肽中的氨基酸交換在本領(lǐng)域中是已知的(H.Neurath，R.L.Hill，TheProteins，AcademicPress，NewYork，1979)。最經(jīng)常發(fā)生的交換是雙向的Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thy/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly交換。此外，如果需要，免疫球蛋白Fc片段可以通過(guò)磷酸化、硫酸化、丙烯?；?acrylation)、糖基化、甲基化、法尼基化、乙酰化、酰胺化等進(jìn)行修飾。上述的免疫球蛋白Fc衍生物可以是如此衍生物：其與本發(fā)明的免疫球蛋白Fc片段具有相等的生物學(xué)活性，但是針對(duì)熱、pH等具有增加的免疫球蛋白Fc片段的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。進(jìn)一步，免疫球蛋白Fc片段可以從分離自人或動(dòng)物——比如，牛、山羊、家豬、小鼠、兔子、倉(cāng)鼠、大鼠、豚鼠等——的天然類型獲得，或者可以是從轉(zhuǎn)化的動(dòng)物細(xì)胞或微生物獲得的重組體或其衍生物。在本文中，它們可以通過(guò)利用蛋白水解酶從人或動(dòng)物有機(jī)體或其處理物(treatment)分離整個(gè)免疫球蛋白由天然免疫球蛋白獲得。木瓜蛋白酶將天然免疫球蛋白消化為Fab和Fc區(qū)域，并且胃蛋白酶處理導(dǎo)致產(chǎn)生pF’c和F(ab)2片段。例如，這些片段可以經(jīng)歷尺寸排阻色譜法以分離Fc或pF’c。具體地，根據(jù)本發(fā)明的免疫球蛋白Fc片段可以是從微生物獲得的重組的人源免疫球蛋白Fc片段。此外，本發(fā)明的免疫球蛋白Fc區(qū)域可以是具有天然糖鏈、與天然形式相比增加的糖鏈或與天然相比減少的糖鏈的形式，或者可以是去糖基化形式。免疫球蛋白Fc的增加的或減少的糖基化或去糖基化可以通過(guò)通常的方法實(shí)現(xiàn)，例如通過(guò)使用化學(xué)方法、酶法或使用微生物的基因工程方法。在本文中，當(dāng)去糖基化時(shí)，結(jié)合至免疫球蛋白Fc片段的補(bǔ)體(C1q)顯著減少并且抗體依賴性細(xì)胞毒性或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性降低或去除，從而在體內(nèi)不誘導(dǎo)不必要的免疫應(yīng)答。在該背景下，去糖基化的或無(wú)糖基化的免疫球蛋白Fc片段與藥物載體的目的更加一致。如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“去糖基化”指的是從免疫球蛋白Fc片段酶去除糖部分，并且術(shù)語(yǔ)“無(wú)糖基化”意思是免疫球蛋白Fc片段通過(guò)原核生物——具體地大腸桿菌(E.coli)——以未糖基化的形式產(chǎn)生。同時(shí)，免疫球蛋白Fc片段可以源自人或其它動(dòng)物，包括牛、山羊、豬、小鼠、兔子、倉(cāng)鼠、大鼠和豚鼠，并且優(yōu)選地是人。此外，免疫球蛋白Fc片段可以是源自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的Fc片段，或者可以是由其組合或其混合物制造的Fc片段。具體地，其源自IgG或IgM——其是人血液中最豐富的蛋白質(zhì)，和最具體地源自IgG——其已知增強(qiáng)配體結(jié)合蛋白的半衰期。同時(shí)，如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“組合”意思是編碼相同起源的單鏈免疫球蛋白Fc片段的多肽連接至不同起源的單鏈多肽以形成二聚體或多聚體。即，二聚體或多聚體可以由選自以下的兩個(gè)或更多個(gè)片段形成：IgGFc、IgAFc、IgMFc、IgDFc和IgEFc片段。如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“混合物”意思是編碼不同起源的兩個(gè)或更多個(gè)免疫球蛋白Fc片段的序列以單鏈免疫球蛋白Fc片段存在。在本發(fā)明中，各種類型的混合物是可能的。即，結(jié)構(gòu)域混合物可以由選自IgGFc、IgAFc、IgMFc、IgDFc和IgEFc的CH1、CH2、CH3和CH4的1到4個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，并且可以包括鉸鏈區(qū)。同時(shí)，IgG被分為IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亞類，并且本發(fā)明包括其組合和混合物。優(yōu)選的是IgG2和IgG4亞類，并且最優(yōu)選的是很少具有效應(yīng)子功能比如補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)的IgG4的Fc片段。本發(fā)明的免疫球蛋白Fc片段可以是重組體形式，其中鉸鏈區(qū)連接至其N末端。在這種情況下，表達(dá)為聚集體的免疫球蛋白Fc片段不引起活性的損失。而且，這些是不具有由起始密碼子編碼的起始甲硫氨酸殘基的活性二聚體或單體形式的Fc片段，并且因此，存在增溶和重折疊的優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明中的適合的免疫球蛋白Fc片段在韓國(guó)專利號(hào)755315、775343和824505中詳細(xì)描述，這些專利通過(guò)引用并入本文。即，根據(jù)本發(fā)明被用作具有胰島素和泌酸調(diào)節(jié)肽的融合蛋白的藥物載體的最優(yōu)選的免疫球蛋白Fc片段是人IgG4源非糖基化Fc區(qū)域。人源Fc片段與非人源Fc片段相比是更優(yōu)選的，非人源Fc片段可以擔(dān)當(dāng)人體內(nèi)的抗原并且引起不期望的免疫應(yīng)答，比如產(chǎn)生針對(duì)抗原的新抗體。如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“生理活性蛋白或肽”指的是調(diào)節(jié)基因表達(dá)或生理功能的蛋白質(zhì)或肽。關(guān)于本發(fā)明的目標(biāo)，可以非限制性地包含任何生理活性蛋白或肽，只要它增加溶解度。同時(shí)，根據(jù)IUPAC-IUB的命名法規(guī)則，本文提及的氨基酸采用如下縮寫：丙氨酸：Ala或A精氨酸：Arg或R天冬酰胺：Asn或N天冬氨酸：Asp或D半胱氨酸：Cys或C谷氨酸：Glu或E谷氨酰胺：Gin或Q甘氨酸：Gly或G組氨酸：His或H異亮氨酸：Ile或I亮氨酸：Leu或L賴氨酸：Lys或K甲硫氨酸：Met或M苯丙氨酸：Phe或F脯氨酸：Pro或P絲氨酸：Ser或S蘇氨酸：Thr或T色氨酸：Trp或W酪氨酸：Tyr或Y纈氨酸：Val或V進(jìn)一步，貫穿本說(shuō)明書，單字母密碼和三字母密碼可以被用于氨基酸。進(jìn)一步，生理活性蛋白或肽是除了天然生理活性蛋白或肽之外還包含所有其衍生物、變體和片段的概念。如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“衍生物”指的是在天然生理活性蛋白或肽的氨基酸序列中具有氨基酸殘基的一些基團(tuán)的化學(xué)置換(例如，α-甲基化、α-羥基化)、缺失(例如，脫氨基)或修飾(例如，N-甲基化)的肽。衍生物可以包括保留天然生理活性肽的活性而與天然生理活性肽不具有序列同源性的肽模擬物。如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“肽模擬物(peptidemimetic)”指的是被設(shè)計(jì)為模擬肽的蛋白樣鏈。肽模擬物可以由包含D-氨基酸的D-肽模擬物示例，但是不限于此。肽模擬物可以容易地通過(guò)使用本領(lǐng)域中已知的制備肽模擬物的技術(shù)制備。如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“變體”指的是具有與天然蛋白質(zhì)或肽的氨基酸序列不同的一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列的蛋白質(zhì)或肽，并且指的是保留天然蛋白活性的肽。變體可以通過(guò)天然蛋白質(zhì)或肽的氨基酸序列的一部分的置換、添加、缺失和修飾中的任一種制備，或者通過(guò)其組合制備。在本文中，添加的氨基酸可以是非天然存在的氨基酸(例如，D型氨基酸)。如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“片段”指的是在天然蛋白質(zhì)或肽的N末端或C末端處具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失的片段，并且優(yōu)選地具有天然蛋白質(zhì)的活性的片段。生理活性蛋白或肽可以通過(guò)源自天然或重組起源的任何方法制備，并且例如，其可以是通過(guò)使用原核細(xì)胞比如大腸桿菌作為宿主細(xì)胞制備的重組蛋白，但不限于此。同時(shí)，生理活性蛋白或肽可以是泌酸調(diào)節(jié)肽、毒蜥外泌肽-4、胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)、GLP-2、促胰島素釋放肽比如糖依賴性胰島素釋放肽(GIP)、胰島素、胰高血糖素、甲狀旁腺激素(PTH)或降鈣素，但不限于此。如上所述，生理活性蛋白或肽是除了天然生理活性蛋白或肽之外還包含所有其衍生物、變體和片段的概念。如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“胰島素”指的是如此肽，其響應(yīng)于血液中升高的葡萄糖水平由胰腺分泌以處理(takeup)肝臟、肌肉或脂肪組織中的葡萄糖并將其轉(zhuǎn)化為糖原，并且停止脂肪作為能量來(lái)源，從而控制血糖水平。這種肽包括天然胰島素、基礎(chǔ)胰島素、胰島素激動(dòng)劑、其前體、其衍生物、其片段和其變體。如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“天然胰島素”指的是如此激素，其由胰腺分泌以促進(jìn)葡萄糖吸收并抑制脂肪分解，并且因而起到控制血糖水平的功能。胰島素由不具有調(diào)節(jié)血糖水平功能的前體——稱為胰島素原——通過(guò)加工形成。胰島素的氨基酸序列如下：A鏈：Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn(SEQIDNO：1)B鏈：Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr(SEQIDNO：2)如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“基礎(chǔ)胰島素(basalinsulin)”指的是管理正常日常血糖水平的肽，比如，地特胰島素(levemir)、甘精胰島素(lantus)、德谷胰島素(deglude)等。如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“胰島素激動(dòng)劑”指的是如此化合物：其結(jié)合至胰島素受體以顯示與胰島素相等的生物活性，其與胰島素的結(jié)構(gòu)不相關(guān)。術(shù)語(yǔ)“胰島素變體”指的是如此肽：其具有與天然胰島素的氨基酸序列不同的一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列，并且保留了控制體內(nèi)血糖水平的功能。術(shù)語(yǔ)“胰島素衍生物”指的是與天然胰島素具有至少80％氨基酸序列同源性的肽，其可以使得在氨基酸殘基上的一些基團(tuán)被化學(xué)地置換、缺失或修飾，并且具有調(diào)節(jié)體內(nèi)血糖水平的功能?！耙葝u素片段”指的是如此片段：其在胰島素的N末端或C末端具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失并且具有調(diào)節(jié)體內(nèi)血糖水平的功能。胰島素的激動(dòng)劑、衍生物、片段和變體的每種制備方法可以單獨(dú)或組合使用。例如，本發(fā)明包括如此肽：其具有與天然肽的氨基酸不同的一個(gè)或多個(gè)氨基酸并且N末端氨基酸殘基進(jìn)行脫氨基，并且具有調(diào)節(jié)體內(nèi)血糖水平的功能。本發(fā)明中使用的胰島素可以通過(guò)重組技術(shù)產(chǎn)生，并且還可以使用固相合成方法來(lái)合成。進(jìn)一步，本發(fā)明中使用的胰島素可以連接至非肽基聚合物。該非肽基聚合物可以被用作本發(fā)明的連接體。非肽基聚合物被用作連接體以連接免疫球蛋白Fc片段，從而維持胰島素的活性并且改善溶解度，而且還改善穩(wěn)定性。使用基因重組技術(shù)的肽連接體的應(yīng)用是可能的。進(jìn)一步。本發(fā)明的特征在于生理活性蛋白或肽與免疫球蛋白Fc片段綴合以改善蛋白質(zhì)或肽的溶解度。在結(jié)合位點(diǎn)方面沒(méi)有具體限制。但是，對(duì)胰島素A鏈的修飾可以降低活性和穩(wěn)定性，并且因而免疫球蛋白Fc片段可以經(jīng)由連接體或不經(jīng)由連接體連接至B鏈。具體而言，免疫球蛋白Fc片段可以經(jīng)由非肽基連接體或不經(jīng)由非肽基連接體連接至胰島素B鏈的N末端，但是不具體地限于此。如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“泌酸調(diào)節(jié)肽”指的是如此肽：其源自胰高血糖素前體——前胰高血糖素(pre-glucagon)，并且包括天然泌酸調(diào)節(jié)肽、其前體、其衍生物、其片段和其變體。具體地，泌酸調(diào)節(jié)肽具有如下氨基酸序列：HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA(SEQIDNO：3)。泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物包括肽、肽衍生物或肽模擬物，其通過(guò)泌酸調(diào)節(jié)肽序列的氨基酸的一部分的添加、缺失或置換制備，從而與天然泌酸調(diào)節(jié)肽相比以高水平活化GLP-1受體和胰高血糖素受體二者。在本發(fā)明中，泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物可以具有SEQIDNO：4到36中任一個(gè)氨基酸序列。進(jìn)一步，泌酸調(diào)節(jié)肽片段保留控制體內(nèi)血糖水平的功能。進(jìn)一步，泌酸調(diào)節(jié)肽變體是如此肽：其具有與天然泌酸調(diào)節(jié)肽的氨基酸序列的氨基酸殘基不同的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基并且具有活化GLP-1和胰高血糖素受體的功能。制備泌酸調(diào)節(jié)肽變體、衍生物和片段的方法可以單獨(dú)或組合使用。例如，本發(fā)明包括如此肽：其具有與天然肽的氨基酸不同的一個(gè)或多個(gè)氨基酸并且N末端氨基酸殘基進(jìn)行脫氨基，并且具有活化GLP-1受體和胰高血糖素受體二者的功能。在本發(fā)明中，泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物包含通過(guò)SEQIDNO：3的氨基酸序列的置換、添加、缺失或翻譯后修飾(例如，甲基化、酰化、泛素化、分子內(nèi)共價(jià)結(jié)合)而制備從而活化胰高血糖素和GLP-1受體二者的任何肽。對(duì)于氨基酸的置換或添加，可以使用通常在人蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的20種氨基酸中的任一種以及非典型的或非天然存在的氨基酸。非典型的氨基酸的商業(yè)來(lái)源包括Sigma-Aldrich、ChemPepInc.和GenzymePharmaceuticals。包含這些氨基酸和非典型的肽序列的肽可以合成和從供應(yīng)商購(gòu)買，例如，AmericanPeptideCompany(USA)、Bachem(USA)或Anygen(韓國(guó))。在具體實(shí)施方式中，本發(fā)明的泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物是包含下面式1的氨基酸序列的新型肽：R1-X1-X2-GTFTSD-X3-X4-X5-X6-X7-Xg-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-X24-R2(式1)其中R1是組氨酸、脫氨基-組氨?；?、二甲基-組氨?；?N-二甲基-組氨酰基)、β-羥基咪唑丙酰基、4-咪唑乙酰基、β-羧基咪唑丙酰基或酪氨酸。X1是AIB(氨基異丁酸)、D-丙氨酸、甘氨酸、Sar(N-甲基甘氨酸)、絲氨酸或D-絲氨酸；X2是谷氨酸或谷氨酰胺；X3是亮氨酸或酪氨酸；X4是絲氨酸或丙氨酸；X5是賴氨酸或精氨酸；X6是谷氨酰胺或酪氨酸；X7是亮氨酸或甲硫氨酸；X8是天冬氨酸或谷氨酸；X9是谷氨酸、絲氨酸、α-甲基-谷氨酸或缺失；X10是谷氨酰胺、谷氨酸、賴氨酸、精氨酸、絲氨酸或缺失；X11是丙氨酸、精氨酸、纈氨酸或缺失；X12是丙氨酸、精氨酸、絲氨酸、纈氨酸或缺失；X13是賴氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、α-甲基-谷氨酸或缺失；X14是天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸或缺失；X15是苯丙氨酸或缺失；X16是異亮氨酸、纈氨酸或缺失；X17是丙氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、賴氨酸、谷氨酰胺、α-甲基-谷氨酸或缺失；X18是色氨酸或缺失；X19是丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、絲氨酸、纈氨酸或缺失；X20是丙氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、精氨酸或缺失；X21是天冬酰胺或缺失；X22是丙氨酸、甘氨酸、蘇氨酸或缺失；X23是半胱氨酸、賴氨酸或缺失；X24是具有由丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸的組合組成的2到10個(gè)氨基酸的肽，或缺失；和R2是KRNRNNIA(SEQIDNO：37)、GPSSGAPPPS(SEQIDNO：38)、GPSSGAPPPSK(SEQIDNO：39)、HSQGTFTSDYSKYLD(SEQIDNO：40)、HSQGTFTSDYSRYLDK(SEQIDNO：41)、HGEGTFTSDLSKQMEEEAVK(SEQIDNO：42)或缺失(排除式1的氨基酸序列等同于SEQIDNO：3的氨基酸序列的情況)。為了加強(qiáng)野生型泌酸調(diào)節(jié)肽對(duì)胰高血糖素受體和GLP-1受體的活性，本發(fā)明的泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物可以用4-咪唑乙?；?、脫氨基-組氨?；?、二甲基-組氨酰基(N-二甲基-組氨?；?、β-羥基咪唑丙?；颚?羧基咪唑丙酰基置換，在4-咪唑乙?；那闆r中由SEQIDNO：3表示的氨基酸序列的1位處的組氨酸的α-C缺失，在脫氨基-組氨?；那闆r中N末端氨基缺失，在二甲基-組氨?；?N-二甲基-組氨?；?的情況中N末端氨基用兩個(gè)甲基修飾，在β-羥基咪唑丙酰基的情況中N末端氨基用羥基置換，在β-羧基咪唑丙?；那闆r中N末端氨基用羧基置換。此外，GLP-1受體結(jié)合區(qū)域可以用加強(qiáng)疏水鍵和離子鍵或其組合的氨基酸置換。泌酸調(diào)節(jié)肽序列的部分可以用GLP-1或毒蜥外泌肽-4的氨基酸序列置換以加強(qiáng)對(duì)GLP-1受體的活性。進(jìn)一步，泌酸調(diào)節(jié)肽序列的部分可以用穩(wěn)定α螺旋的序列置換。例如，在式1的氨基酸序列的10、14、16、20、24和28位處的氨基酸可以用由已知穩(wěn)定α螺旋的Tyr(4-Me)、Phe、Phe(4-Me)、Phe(4-Cl)、Phe(4-CN)、Phe(4-NO2)、Phe(4-NH2)、Phg、Pal、Nal、Ala(2-噻吩基)和Ala(苯并噻吩基)組成的氨基酸或氨基酸衍生物置換。在本文中，Tyr(4-Me)是酪氨酸衍生物，其中酪氨酸的羥基中的氫用甲基置換；Phe(4-Me)是苯丙氨酸衍生物，其中苯丙氨酸的對(duì)位用甲基置換；Phe(4-Cl)是苯丙氨酸衍生物，其中苯基的對(duì)位用氯置換；Phe(4-CN)是苯丙氨酸衍生物，其中苯基的對(duì)位用氰基置換；Phe(4-NO2)是苯丙氨酸衍生物，其中苯基的對(duì)位用硝基置換；和Phe(4-NH2)是苯丙氨酸衍生物，其中苯基的對(duì)位用胺基置換。進(jìn)一步，Phg表示苯基甘氨酸；Pal是丙氨酸衍生物，其中丙氨酸的β-甲基用吡啶基置換；Nal是丙氨酸衍生物，其中丙氨酸的β-甲基用萘基置換；Ala(2-噻吩基)是丙氨酸衍生物，其中丙氨酸的β-甲基用2-噻吩基置換；和Ala(苯并噻吩基)是丙氨酸衍生物，其中丙氨酸的β-甲基用苯丙噻吩基置換。待被插入的α螺旋-穩(wěn)定氨基酸或氨基酸衍生物的類型和數(shù)目方面沒(méi)有限制。在具體實(shí)施方式中，分子內(nèi)的環(huán)可以在氨基酸殘基之間形成。例如，分子內(nèi)的環(huán)可以在10和14、12和16、16和20、20和24以及24和28位處形成，并且在這種情況下，相應(yīng)位置可以被谷氨酸和賴氨酸對(duì)取代。在溶解度可以通過(guò)本發(fā)明的方法改善的泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物中形成的分子內(nèi)的環(huán)的數(shù)目方面沒(méi)有特別限制。在實(shí)施方式中，泌酸調(diào)節(jié)肽——其溶解度通過(guò)本發(fā)明的方法改善——或其衍生物可以是具有選自以下式2到6的氨基酸序列的泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物。在具體實(shí)施方式中，本發(fā)明的泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物是具有以下式2的氨基酸序列的肽，其中泌酸調(diào)節(jié)肽的氨基酸序列用毒蜥外泌肽或GLP-1的序列置換：R1-A’-R3(式2)在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，本發(fā)明的泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物是具有以下式3的氨基酸序列的肽，其中泌酸調(diào)節(jié)肽的氨基酸序列的部分使用適合的氨基酸連接體與毒蜥外泌肽或GLP-1的序列連接：R1-B’-C’-R4(式3)在仍另一個(gè)具體實(shí)施方式中，本發(fā)明的泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物是如此肽：其中泌酸調(diào)節(jié)肽的氨基酸序列的部分用能夠加強(qiáng)對(duì)GLP-1受體的結(jié)合親和力的氨基酸置換。例如，26位處的Leu——其通過(guò)疏水作用與GLP-1受體結(jié)合——用疏水殘基Ile或Val置換，從而加強(qiáng)對(duì)GLP-1受體的結(jié)合親和力。更具體地，以下式4是包含具有改善的受體結(jié)合親和力的泌酸調(diào)節(jié)肽的肽(D6置換的)：R1-SQGTFTSDYSKYLD-D1-D2-D3-D4-D5-LFVQW-D6-D7-N-D8-R3(式4)在仍另一個(gè)具體實(shí)施方式中，本發(fā)明的泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物是包含以下式5的肽，在該肽中氨基酸序列的一部分缺失、添加或者用另一個(gè)氨基酸置換，以便加強(qiáng)天然泌酸調(diào)節(jié)肽對(duì)GLP-1受體和胰高血糖素受體的活性：R1-E1-QGTFTSDYSKYLD-E2-E3-RA-E4-E5-Fv-E6-WLMNT-E7-R5(式5)在式2到5中，R1與式1中描述的相同；A’選自SQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT(SEQIDNO：43)、SQGTFTSDYSKYLDEEAVRLFIEWLMNT(SEQIDNO：44)、SQGTFTSDYSKYLDERRAQDFVAWLKNT(SEQIDNO：45)、GQGTFTSDYSRYLEEEAVRLFIEWLKNG(SEQIDNO：46)、GQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLKNG(SEQIDNO：47)、GEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEWAA(SEQIDNO：48)和SQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLMNG(SEQIDNO：49)；B’選自SQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT(SEQIDNO：43)、SQGTFTSDYSKYLDEEAVRLFIEWLMNT(SEQIDNO：44)、SQGTFTSDYSKYLDERRAQDFVAWLKNT(SEQIDNO：45)、GQGTFTSDYSRYLEEEAVRLFIEWLKNG(SEQIDNO：46)、GQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLKNG(SEQIDNO：47)、GEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEW/AA(SEQIDNO：48)、SQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLMNG(SEQIDNO：49)、GEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEW(SEQIDNO：50)和SQGTFTSDYSRYLD(SEQIDNO：51)；C’是具有由丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸的組合組成的2到10個(gè)氨基酸的肽；D1是絲氨酸、谷氨酸或精氨酸；D2是精氨酸、谷氨酸或絲氨酸；D3是精氨酸、丙氨酸或纈氨酸；D4是精氨酸、纈氨酸或絲氨酸；D5是谷氨酰胺、精氨酸或賴氨酸；D6是異亮氨酸、纈氨酸或絲氨酸；D7是甲硫氨酸、精氨酸或谷氨酰胺；D8是蘇氨酸、甘氨酸或丙氨酸；E1是絲氨酸、AIB、Sar、D-丙氨酸或D-絲氨酸；E2是絲氨酸或谷氨酸；E3是精氨酸或賴氨酸；E4是谷氨酰胺或賴氨酸；E5是天冬氨酸或谷氨酸；E6是谷氨酰胺、半胱氨酸或賴氨酸；E7是半胱氨酸、賴氨酸或缺失；R3是KRNRNNIA(SEQIDNO：37)、GPSSGAPPPS(SEQIDNO：38)或GPSSGAPPPSK(SEQIDNO：39)；R4是HSQGTFTSDYSKYLD(SEQIDNO：40)、HSQGTFTSDYSRYLDK(SEQIDNO：41)或HGEGTFTSDLSKQMEEEAVK(SEQIDNO：42)；和R5是KRNRNNIA(SEQIDNO：37)、GPSSGAPPPS(SEQIDNO：38)、GPSSGAPPPSK(SEQIDNO：39)或缺失(排除式2到5的氨基酸序列等同于SEQIDNO：3的氨基酸序列時(shí)的情況)。具體地，本發(fā)明的泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物可以是以下式6的肽：R1-X1-X2-GTFTSD-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-X24-R2(式6)其中R1是組氨酸、脫氨基-組氨?；?、4-咪唑乙酰基或酪氨酸；X1是AIB(氨基異丁酸)、甘氨酸、絲氨酸或D-絲氨酸；X2是谷氨酸或谷氨酰胺；X3是亮氨酸或酪氨酸；X4是絲氨酸或丙氨酸；X5是賴氨酸或精氨酸；X6是谷氨酰胺或酪氨酸；X7是亮氨酸或甲硫氨酸；X8是天冬氨酸或谷氨酸；X9是谷氨酸、α-甲基-谷氨酸或缺失；X10是谷氨酰胺、谷氨酸、賴氨酸、精氨酸或缺失；X11是丙氨酸、精氨酸或缺失；X12是丙氨酸、纈氨酸或缺失；X13是賴氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、α-甲基-谷氨酸或缺失；X14是天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸或缺失；X15是苯丙氨酸或缺失；X16是異亮氨酸、纈氨酸或缺失；X17是丙氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、α-甲基-谷氨酸或缺失；X18是色氨酸或缺失；X19是丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸或缺失；X20是丙氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、精氨酸或缺失；X21是天冬酰胺或缺失；X22是蘇氨酸或缺失；X23是半胱氨酸、賴氨酸或缺失；X24是具有由甘氨酸組成的2到10個(gè)氨基酸的肽或者缺失；并且R2是KRNRNNIA(SEQIDNO：37)、GPSSGAPPPS(SEQIDNO：38)、GPSSGAPPPSK(SEQIDNO：39)、HSQGTFTSDYSKYLD(SEQIDNO：40)、HSQGTFTSDYSRYLDK(SEQIDNO：41)、HGEGTFTSDLSKQMEEEAVK(SEQIDNO：42)或缺失(排除式6的氨基酸序列等同于SEQIDNO：3的氨基酸序列時(shí)的情況)。更具體地，本發(fā)明的泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物可以選自SEQIDNO：4到36的肽。泌酸調(diào)節(jié)肽具有兩種肽——GLP-1和胰高血糖素——的活性。GLP-1降低血糖，減少食物攝取并抑制胃排空，而胰高血糖素升高血糖，促進(jìn)脂解作用，并通過(guò)增加能量代謝降低體重。如果具有不同生物效應(yīng)的兩種肽存在于一個(gè)肽中并且這兩種肽中的一種與另一種相比展示更強(qiáng)的顯性效應(yīng)，則可以產(chǎn)生不期望的作用。如果胰高血糖素與GLP-1相比展示更強(qiáng)的顯性效應(yīng)，則可以升高血糖。如果GLP-1與胰高血糖素相比展示更強(qiáng)的顯性效應(yīng)，則可以引起副作用比如惡心和嘔吐。整體效力可以根據(jù)兩種肽的活性比而改變。如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“促胰島素釋放肽”指的是具有促胰島素功能的肽，并且促胰島素釋放肽促進(jìn)胰腺β細(xì)胞中胰島素的合成和表達(dá)。促胰島素釋放肽的例子可以是胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)、胰高血糖素樣肽-2(GLP-2)、毒蜥外泌肽-3、毒蜥外泌肽-4、咪唑乙酰基(CA)毒蜥外泌肽-4或葡萄糖依賴性促胰島素釋放肽(GIP)，但是不限于此——只要它具有促胰島素功能。在本發(fā)明中使用的促胰島素釋放肽除了天然促胰島素釋放肽之外還包括所有其衍生物、變體和片段。其一般描述與上面的描述相同。GLP-1、毒蜥外泌肽-3或毒蜥外泌肽-4、和其衍生物的描述包含在關(guān)于泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物的韓國(guó)專利公布號(hào)10-2012-0137271(或W02012-169798)和關(guān)于促胰島素釋放肽衍生物的韓國(guó)專利公布號(hào)10-2009-0008151(或W02009-011544)中，其通過(guò)引用并入本文，但是不限于此。如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“胰高血糖素”指的是升高血糖水平的肽激素。胰高血糖素的功能是在肝臟中將糖原降解為葡萄糖以升高血糖水平。同時(shí)，天然胰高血糖素可以具有如下序列。His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr(SEQIDNO：52)進(jìn)一步，在本發(fā)明中使用的胰高血糖素除了天然胰高血糖素之外還包括所有其衍生物、變體和片段。其一般描述與上面的描述相同。如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“甲狀旁腺激素(PTH)”指的是由甲狀旁腺釋放的激素，并且作用是增加血液中的鈣濃度。關(guān)于甲狀旁腺激素的氨基酸序列的信息可以從已知的數(shù)據(jù)庫(kù)，比如美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究所的基因庫(kù)(GenBankoftheUSNationalInstituteofHealth)獲得。甲狀旁腺激素除了天然甲狀旁腺激素之外還包括所有其衍生物、變體和片段。如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“降鈣素”是調(diào)節(jié)血液中的鈣濃度的甲狀腺激素，并且其功能是降低血液中的鈣濃度。關(guān)于降鈣素的氨基酸序列的信息可以從已知的數(shù)據(jù)庫(kù)，比如美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究所的基因庫(kù)獲得。降鈣素除了天然降鈣素之外還包括其所有衍生物、變體和片段。本發(fā)明的方法用于在不使用表面活性劑的情況下有效地增加生理活性蛋白或肽的溶解度。但是，為了進(jìn)一步增加溶解度，可以使用表面活性劑。即，將表面活性劑加入到水溶液，并將生理活性蛋白或肽和免疫球蛋白Fc片段的長(zhǎng)效綴合物封裝在膠團(tuán)中，從而進(jìn)一步增加綴合物的溶解度。進(jìn)一步，本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及用于改善生理活性蛋白或肽的溶解度的組合物，其中該組合物包括免疫球蛋白Fc片段并因而與不包含免疫球蛋白Fc片段的組合物的溶解度相比展示改善的溶解度。在本文中，組合物包括生理活性蛋白或肽和免疫球蛋白Fc片段的綴合物，其中生理活性蛋白或肽作為活性成分經(jīng)由肽連接體或非肽基連接體連接至免疫球蛋白Fc片段。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，檢查了通過(guò)將代表性的生理活性肽、胰島素或泌酸調(diào)節(jié)肽與免疫球蛋白Fc綴合，在弱酸性pH下是否增加胰島素或泌酸調(diào)節(jié)肽的溶解度。結(jié)果，與非綴合的形式相比，免疫球蛋白Fc片段綴合的形式顯著地增加了胰島素或泌酸調(diào)節(jié)肽的溶解度(表2和3、圖2；以及表5和6、圖4)。該結(jié)果建議，本發(fā)明的方法可以被用于改善肽或蛋白質(zhì)的溶解度，并且具體而言，被用于顯著地改善如此肽或蛋白質(zhì)的溶解度：該肽或蛋白質(zhì)在中性或弱酸性條件下具有非常低的溶解度并且因而包含其藥學(xué)上有效濃度的制劑是困難的。在下文中，將參照下面的實(shí)施例更加詳細(xì)地描述本發(fā)明。但是，這些實(shí)施例僅出于說(shuō)明的目的，并且本發(fā)明不意欲由這些實(shí)施例限制。實(shí)施例1：胰島素和長(zhǎng)效胰島素綴合物的溶解度的評(píng)估(1)長(zhǎng)效胰島素綴合物的制備將胰島素粉末溶于10mMHCl，然后與3.4K3-戊酮(propion)-ALD2PEG(具有兩個(gè)丙醛基團(tuán)的PEG，NOF，日本)在4℃下以1∶2的胰島素：PEG的摩爾比和5mg/mL的胰島素濃度反應(yīng)大約2小時(shí)以PEG化(PEGlate)胰島素B鏈的N末端。該反應(yīng)在50mM檸檬酸鈉(pH5.0)和45％異丙醇中進(jìn)行，并且將2mM至20mM的氰基硼氰化鈉作為還原劑加入至反應(yīng)中。反應(yīng)溶液用SPHP(GEHealthcare)柱使用包含檸檬酸鈉(pH3.0)的緩沖液和KCl濃度梯度進(jìn)行純化。為了制備胰島素-PEG-免疫球蛋白Fc片段綴合物，以大約1∶1.2的摩爾比——具有20mg/mL的總蛋白濃度——在室溫下使單-PEG化胰島素和免疫球蛋白Fc片段反應(yīng)大約13小時(shí)。就此而言，反應(yīng)溶液為pH8.2的100mMHEPES和22mM磷酸鉀，并且將20mM氰基硼氰化鈉作為還原劑加入到反應(yīng)中。在反應(yīng)完成之后，將反應(yīng)溶液首先穿過(guò)使用Tris-HCl(pH7.5)緩沖液和NaCl濃度梯度的Q瓊脂糖HP(GEHealthcare)柱，然后穿過(guò)使用Tris-HCl(pH7.5)緩沖液和硫酸銨濃度梯度的Source15ISO(GEHealthcare)柱，從而最終純化胰島素-PEG-免疫球蛋白Fc綴合物。(2)胰島素和長(zhǎng)效胰島素綴合物的溶解度的測(cè)試為了檢查胰島素和長(zhǎng)效胰島素綴合物的溶解度，根據(jù)下面表1中的組合物分別制備胰島素和長(zhǎng)效胰島素綴合物的標(biāo)準(zhǔn)和測(cè)試材料。胰島素和長(zhǎng)效胰島素綴合物的測(cè)試材料具有pH6.0的醋酸緩沖溶液、作為非離子型表面活性劑的聚山梨醇酯、作為糖醇的甘露醇和作為等滲劑的氯化鈉的組合物。根據(jù)表2和3中的定量值，在室溫下溶解測(cè)試材料，將不完全溶解的胰島素測(cè)試材料離心，并且僅上清液被收集并被用于溶解度測(cè)試。就此而言，作為胰島素測(cè)試材料的理論定量值中的最大定量值，大約10mg/mL被測(cè)定，其是通過(guò)將100mg/mL的長(zhǎng)效胰島素綴合物轉(zhuǎn)化為胰島素獲得的定量值。以最大定量值溶解的胰島素測(cè)試材料被連續(xù)地稀釋，并且胰島素被完全溶解而無(wú)雜質(zhì)或沉淀物的點(diǎn)(0.008mg/mL)被測(cè)定為最小定量值。胰島素和長(zhǎng)效胰島素綴合物的各自的校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)曲線首先通過(guò)反相高效液相色譜法(RP-HPLC)確認(rèn)，如圖1所示。通過(guò)將由反向色譜法確認(rèn)的胰島素和長(zhǎng)效胰島素綴合物測(cè)試材料的峰面積分別放入校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)計(jì)算胰島素和長(zhǎng)效胰島素綴合物的定量值。結(jié)果在表2和3以及圖2中給出。[表1]材料溶解條件胰島素標(biāo)準(zhǔn)溶解在HCl中，然后調(diào)節(jié)至pH5.0胰島素測(cè)試材料pH6.0長(zhǎng)效胰島素綴合物的標(biāo)準(zhǔn)和測(cè)試材料pH6.0[表2][表3]如表2和3中所示，溶于長(zhǎng)效胰島素綴合物制劑緩沖液的長(zhǎng)效胰島素綴合物測(cè)試材料的定量值在理論值和測(cè)量值之間展示了微小差別，而溶于長(zhǎng)效胰島素綴合物制劑緩沖液的胰島素測(cè)試材料的定量值在理論值和測(cè)量值之間展示了大的差別(多達(dá)大約16倍)。進(jìn)一步，當(dāng)胰島素測(cè)試材料溶于長(zhǎng)效胰島素綴合物制劑緩沖液時(shí)，在除了0.008mg/mL之外的所有情況下，在離心后觀察到了沉淀物。如結(jié)果中所示，通過(guò)被用作長(zhǎng)效胰島素綴合物的載體的免疫球蛋白Fc片段改善了溶解度。實(shí)施例2：泌酸調(diào)節(jié)肽和長(zhǎng)效泌酸調(diào)節(jié)肽綴合物的溶解度的評(píng)估(1)長(zhǎng)效泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物綴合物的制備將泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物與MAL-10K-ALDPEG(NOF，日本)在4℃下以1∶1的摩爾比和3mg/mL的泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物濃度反應(yīng)大約1小時(shí)以在SEQIDNO：27——其是泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物的氨基酸序列——的30位的半胱氨酸殘基處PEG化MAL-10K-ALDPEG。該反應(yīng)在50mMTris(pH7.5)和60％異丙醇中進(jìn)行。在反應(yīng)完成之后，將反應(yīng)溶液施加至使用檸檬酸鈉(pH3.0)緩沖液和KCl濃度梯度的SPHP(GEhealthcare，瑞典)柱以純化在半胱氨酸處單-PEG化的泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物。然后，將如此純化的單-PEG化的泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物和免疫球蛋白Fc以1∶4的摩爾比——具有20mg/mL的總蛋白水平——在4℃下反應(yīng)大約16小時(shí)。就此而言，反應(yīng)溶液為pH6.0的100mM磷酸鉀，并且將20mMSCB鈉作為還原劑加入到反應(yīng)溶液。在反應(yīng)完成之后，首先將反應(yīng)溶液穿過(guò)使用Bis-Tris緩沖液和NaCl濃度梯度的丁基瓊脂糖FF(GEHealthcare，瑞典)柱，然后穿過(guò)使用檸檬酸鈉緩沖液和硫酸銨濃度梯度的SourceISO(GEHealthcare，瑞典)柱，從而最終純化泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物-PEG-免疫球蛋白Fc綴合物。(2)泌酸調(diào)節(jié)肽和長(zhǎng)效泌酸調(diào)節(jié)肽綴合物的溶解度的測(cè)試為了檢查SEQIDNO：27的泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物和長(zhǎng)效泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物綴合物的溶解度，根據(jù)下面表4中的組合物分別制備泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物和長(zhǎng)效泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物綴合物的標(biāo)準(zhǔn)和測(cè)試材料。泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物和長(zhǎng)效泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物綴合物的測(cè)試材料具有pH5.6的檸檬酸鹽緩沖溶液、作為非離子型表面活性劑的聚山梨醇酯、作為糖醇的甘露醇和甲硫氨酸的組合物。根據(jù)表5和6中的定量值，在室溫下溶解測(cè)試材料，將不完全溶解的泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物測(cè)試材料離心，并且僅上清液被收集并被用于溶解度測(cè)試。就此而言，作為泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物測(cè)試材料的理論定量值中的最大定量值，大約5mg/mL被測(cè)定，其是通過(guò)將80mg/mL的長(zhǎng)效泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物綴合物轉(zhuǎn)化為泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物獲得的定量值。以最大定量值溶解的泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物測(cè)試材料被連續(xù)地稀釋，并且胰島素被完全溶解而無(wú)雜質(zhì)或沉淀物的點(diǎn)(0.008mg/mL)被測(cè)定為最小定量值。泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物和長(zhǎng)效泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物綴合物的各自的校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)曲線首先通過(guò)反相色譜法確認(rèn)，如圖3所示。通過(guò)將由反向色譜法確認(rèn)的泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物和長(zhǎng)效泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物綴合物測(cè)試材料的峰面積分別放入校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)計(jì)算泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物和長(zhǎng)效泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物綴合物的定量值。[表4]材料溶解條件泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物標(biāo)準(zhǔn)pH7.5，60％異丙醇泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物測(cè)試材料pH5.6長(zhǎng)效泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物綴合物的標(biāo)準(zhǔn)和測(cè)試材料pH5.6[表5][表6]如表5和6以及圖4中所示，溶于長(zhǎng)效泌酸調(diào)節(jié)肽綴合物制劑緩沖液的長(zhǎng)效泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物綴合物測(cè)試材料的定量值在理論值和測(cè)量值之間展示了微小差別，而溶于長(zhǎng)效泌酸調(diào)節(jié)肽綴合物制劑緩沖液的泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物測(cè)試材料的定量值在理論值和測(cè)量值之間展示了大的差別(多達(dá)大約27倍)。進(jìn)一步，當(dāng)泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物測(cè)試材料溶于長(zhǎng)效泌酸調(diào)節(jié)肽綴合物制劑緩沖液時(shí)，在除了0.008mg/mL之外的所有情況下，在離心后觀察到了沉淀物。如結(jié)果中所示，通過(guò)被用作長(zhǎng)效泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物綴合物的載體的免疫球蛋白Fc片段改善了泌酸調(diào)節(jié)肽衍生物的溶解度。這些結(jié)果表明被用作本發(fā)明的生理活性蛋白或肽的載體的免疫球蛋白Fc片段能夠有效地改善蛋白質(zhì)或肽的溶解度?；谏鲜雒枋觯绢I(lǐng)域技術(shù)人員將理解，本發(fā)明可以以不同的具體形式實(shí)施而不改變其技術(shù)精神或本質(zhì)特征。因此，應(yīng)當(dāng)理解，上述實(shí)施方式在所有方面都不是限制性的，而是說(shuō)明性的。本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求書限定而不是由說(shuō)明書限定，并且因此落入權(quán)利要求書的邊界和界限，或這些邊界或界限的等價(jià)物內(nèi)的所有改變或修改意欲由權(quán)利要求書包括。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3