本發(fā)明屬于藥物領(lǐng)域，涉及一種功能靶向性載體材料二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-苯基葡萄糖苷及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

4-氨基苯基-β-D-葡萄糖苷(4-Aminophenylβ-D-glucopyranoside，GLU)，又稱對氨基苯基葡萄糖苷，是一種葡萄糖衍生物。葡萄糖是生命活動中必不可少的物質(zhì)之一，能夠直接參與細(xì)胞的代謝活動，并提供細(xì)胞生長所需的能量。血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞上具有大量表達(dá)的葡糖糖轉(zhuǎn)運(yùn)體(GLUTs)，用以將腦部所必需的營養(yǎng)物質(zhì)葡萄糖從血液中主動攝取入腦。與此同時(shí)，腫瘤細(xì)胞中通常存在有一種特殊的糖代謝機(jī)制——它們比正常的組織需要更多的葡萄糖用于糖酵解，因此也相應(yīng)地高度表達(dá)協(xié)助葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體。腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中有顯著過度表達(dá)的GLUT 1葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體。最新實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，另一種葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體GLUT 3可作為腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的生物標(biāo)記物，其在腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中特異性的高表達(dá)能夠幫助腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞競爭葡萄糖，以適應(yīng)腦腫瘤區(qū)域葡萄糖缺乏的惡劣環(huán)境。

二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG₂₀₀₀)是一種用于長循環(huán)脂質(zhì)體制備的材料。1992年Maruyama等就報(bào)導(dǎo)了將DSPE-PEG₂₀₀₀材料用于大單層脂質(zhì)體的制備，可以顯著增加藥物在血液系統(tǒng)中循環(huán)時(shí)間的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。由于長鏈PEG的存在，修飾有二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇材料的脂質(zhì)體可以有效避免人體內(nèi)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)對脂質(zhì)體的清除，從而提高載藥系統(tǒng)在血液循環(huán)系統(tǒng)中的穩(wěn)定性，使其具有生物學(xué)穩(wěn)定的性質(zhì)，延長脂質(zhì)體在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間。并且，該種具有適當(dāng)粒徑的長循環(huán)脂質(zhì)體可以在腫瘤組織的非正常血管區(qū)域表現(xiàn)出滲透與滯留增強(qiáng)效應(yīng)(enhanced permeability and retention effect，EPR effect)，可以實(shí)現(xiàn)腫瘤部位的被動靶向，從而增加藥物在腫瘤部位的聚集。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種功能靶向性載體材料二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇-苯基葡萄糖苷及其制備方法與應(yīng)用。

本發(fā)明提供的式I所示化合物，也即DSPE-PEG₂₀₀₀-GLU，其結(jié)構(gòu)式如式I所示，

本發(fā)明提供的制備式I所示化合物的方法，包括如下步驟：

將式II所示化合物(也即4-氨基苯基-β-D-葡萄糖苷(4-Aminophenylβ-D-glucopyranoside，GLU))和式III所示化合物(也即二硬脂酰磷脂酰乙醇-聚乙二醇-N-琥珀酰亞胺(DSPE-PEG₂₀₀₀-NHS))于溶劑中進(jìn)行取代反應(yīng)，反應(yīng)完畢得到所述式I所示化合物；

上述方法中，所述溶劑選自DMF、DMSO和氯仿中的至少一種；

所述式II所示化合物和式III所示化合物的投料摩爾比為1:5-15，優(yōu)選為1:10，質(zhì)量比為1:1；

所述式II所示化合物與所述溶劑的用量比為3mg:0.1-2mL，優(yōu)選為3mg:0.5mL；

所述取代反應(yīng)步驟中，溫度通常為室溫，時(shí)間通常為24h-48h，優(yōu)選為48h；該取代反應(yīng)是由GLU分子上的氨基親核取代DSPE-PEG₂₀₀₀-NHS上的NHS基團(tuán)形成酰胺鍵而得式I；

所述取代反應(yīng)可在惰性氣氛中進(jìn)行；所述惰性氣氛具體為氬氣氣氛

所述方法還包括如下步驟：在所述反應(yīng)完畢后，將所得反應(yīng)體系置于截留分子量為2500Da左右的透析袋中用水進(jìn)行透析；

所述透析步驟中，時(shí)間通常為36h-72h，優(yōu)選為48h。

所述方法還包括如下步驟：在所述用水進(jìn)行透析步驟之后，將透析所得液體進(jìn)行凍干的步驟。經(jīng)過該凍干步驟，可得到干燥的呈現(xiàn)白色粉末狀的式I所示化合物。

另外，上述本發(fā)明提供的式I所示化合物在制備靶向性產(chǎn)品中的應(yīng)用，也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。其中，所述靶向性產(chǎn)品為靶向性藥物制劑，具體為靶向性脂質(zhì)體，更具體為靶向性柔紅霉素脂質(zhì)體、靶向性香豆素脂質(zhì)體或靶向性DiR脂質(zhì)體。

本發(fā)明還提供了一種制備GLU修飾的靶向性空白脂質(zhì)體的方法，為以卵磷脂、膽固醇、式I所示化合物和DSPE-PEG₂₀₀₀為原料制得；

該方法具體包括如下步驟：

1)將卵磷脂、膽固醇、式I所示化合物和DSPE-PEG₂₀₀₀于有機(jī)溶劑中溶解后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)減壓干燥除去所述有機(jī)溶劑，得到脂膜；

所述DSPE-PEG₂₀₀₀的結(jié)構(gòu)式如式IV所示：

2)向步驟1)所得脂膜中加入硫酸銨水溶液，進(jìn)行水浴超聲5min后，再在超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)進(jìn)行超聲，將超聲所得含有粗脂質(zhì)體的液體通過孔徑為400nm的聚碳酸酯膜3次后，再通過孔徑為200nm的聚碳酸酯膜3次后，于透析袋中透析，得到所述GLU修飾的靶向性空白脂質(zhì)體。

上述方法的步驟1)中，所述有機(jī)溶劑為氯仿、二氯甲烷或二氯甲烷與甲醇的混合溶劑；

所述卵磷脂、膽固醇、式I所示化合物和DSPE-PEG₂₀₀₀的投料摩爾比為60-65：30-35：0.5-5：0.5-5，具體為63：32.5：0.5：4；

所述步驟2)中，硫酸銨水溶液的濃度為200-300mM mM，具體為250mM；

所述水浴超聲步驟中，超聲的能量為100-200W；溫度為20-30℃；

所述在超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)進(jìn)行超聲的步驟中，超聲的能量為100-300W，具體為200W；溫度為20-40℃，具體為35℃；超聲工作時(shí)間為10s，間歇時(shí)間為10s，全程時(shí)間為10min；

所述透析步驟中，透析袋的截留分子量為10,000-12,000Da；透析的時(shí)間為12-48小時(shí)，具體為24小時(shí)；

透析所用試劑為HBS緩沖溶液；

所述HBS緩沖液的成分如下：151mMNaCl、25.2mMHepes，PBS pH值為7.4。

另外，按照上述方法得到的GLU修飾的靶向性空白脂質(zhì)體，也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明還提供了一種GLU修飾的靶向性柔紅霉素脂質(zhì)體，為以前述本發(fā)明提供的GLU修飾的靶向性空白脂質(zhì)體和柔紅霉素為原料制得。

上述GLU修飾的靶向性柔紅霉素脂質(zhì)體中，所述GLU修飾的靶向性柔紅霉素脂質(zhì)體的包封率大于90％。

本發(fā)明提供的制備所述GLU修飾的靶向性柔紅霉素脂質(zhì)體或靶向性香豆素脂質(zhì)體的方法，為以所述GLU修飾的靶向性空白脂質(zhì)體和鹽酸柔紅霉素的水溶液為原料制得；

該方法具體包括如下步驟：將所述GLU修飾的靶向性空白脂質(zhì)體和鹽酸柔紅霉素的水溶液于水浴中振蕩，得到所述GLU修飾的靶向性柔紅霉素脂質(zhì)體。

上述方法中，所述鹽酸柔紅霉素和所述GLU修飾的靶向性空白脂質(zhì)體脂材的質(zhì)量比為1:10-100，具體為1:20；

所述振蕩步驟中，溫度為35-70℃，具體為60℃；

時(shí)間為10-45min，具體為20min。

上述本發(fā)明提供的GLU修飾的靶向性柔紅霉素脂質(zhì)體在制備真核生物腫瘤細(xì)胞增殖的抑制劑、制備真核生物腫瘤細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑、制備真核生物腫瘤細(xì)胞內(nèi)caspase8和/或caspase 3活化誘導(dǎo)劑和提升真核生物腫瘤細(xì)胞的攝取中任意一種的應(yīng)用及所述GLU修飾的靶向性柔紅霉素脂質(zhì)體或靶向性香豆素脂質(zhì)體在制備預(yù)防和/或治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用，也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍；

其中，所述真核生物具體為哺乳動物；所述腫瘤細(xì)胞具體為癌細(xì)胞；所述癌細(xì)胞具體為腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞，更具體為鼠源C6細(xì)胞或腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞；

所述腫瘤具體為腦膠質(zhì)瘤，更具體為腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞。

本發(fā)明還提供了制備PEI和GLU共同修飾的功能靶向性空白脂質(zhì)體的方法，該方法為以卵磷脂、膽固醇、DSPE-PEG₂₀₀₀-PEI₆₀₀化合物和所述式I所示化合物為原料制得；

所述DSPE-PEG₂₀₀₀-PEI₆₀₀化合物為由重復(fù)結(jié)構(gòu)單元a、重復(fù)結(jié)構(gòu)單元b及端基-NH₂構(gòu)成的聚合物；

其中，所述重復(fù)結(jié)構(gòu)單元a為-NHCH₂CH₂-，總個(gè)數(shù)為x，x為0-15；

重復(fù)結(jié)構(gòu)單元b為-N(CH₂CH₂NH₂)CH₂CH₂-，總個(gè)數(shù)為y，y為1-10。

該方法具體包括如下步驟：

1)將卵磷脂、膽固醇、DSPE-PEG₂₀₀₀-PEI₆₀₀化合物和所述式I所示化合物于有機(jī)溶劑中溶解后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)減壓干燥除去所述有機(jī)溶劑，得到脂膜；

2)向步驟1)所得脂膜中加入硫酸銨水溶液，進(jìn)行水浴超聲5min后，再在超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)進(jìn)行超聲，將超聲所得含有粗脂質(zhì)體的液體通過孔徑為400nm的聚碳酸酯膜3次后，再通過孔徑為200nm的聚碳酸酯膜3次后，于透析袋中透析，得到所述PEI和GLU共同修飾的功能靶向性空白脂質(zhì)體。

上述方法的步驟1)中，所述有機(jī)溶劑為氯仿、二氯甲烷或二氯甲烷與甲醇的混合溶劑；

所述卵磷脂、膽固醇、式I1所示化合物和所述式I所示化合物的投料摩爾比為60-65：30-35：0.5-5：0.5-5，具體為63：32.5：0.5：4；

所述步驟2)中，硫酸銨水溶液的濃度為200-300mM，具體為250mM；

所述水浴超聲步驟中，超聲的能量為100-200W；溫度為20-30℃；

所述在超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)進(jìn)行超聲的步驟中，超聲的能量為100-300W，具體為200W；溫度為20-40℃，具體為35℃；超聲工作時(shí)間為10s，間歇時(shí)間為10s，全程時(shí)間為10min；

所述透析步驟中，透析袋的截留分子量為10,000-12,000Da；透析的時(shí)間為12-48小時(shí)，具體為24小時(shí)；

透析所用試劑為HBS緩沖溶液；

所述HBS緩沖液的成分如下：151mMNaCl、25.2mMHepes(羥乙基哌嗪乙硫磺酸)，PBS pH值為7.4。

按照上述方法制備得到的PEI和GLU共同修飾的功能靶向性空白脂質(zhì)體，也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

另外，上述本發(fā)明提供的PEI和GLU共同修飾的功能靶向性空白脂質(zhì)體在制備真核生物腫瘤細(xì)胞增殖的抑制劑、制備真核生物腫瘤細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑、制備真核生物腫瘤細(xì)胞內(nèi)caspase 8和/或caspase 3活化誘導(dǎo)劑和提升真核生物腫瘤細(xì)胞的攝取中任意一種的應(yīng)用及所述PEI和GLU共同修飾的功能靶向性空白脂質(zhì)體在制備預(yù)防和/或治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用，也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍；

其中，所述真核生物具體為哺乳動物；所述腫瘤細(xì)胞具體為癌細(xì)胞；所述癌細(xì)胞具體為腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞，更具體為鼠源C6細(xì)胞或腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞；

所述腫瘤具體為腦膠質(zhì)瘤，更具體為腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞。

本發(fā)明提供的PEI和GLU雙重修飾的靶向性柔紅霉素脂質(zhì)體，為以所述PEI和GLU雙重修飾的靶向性空白脂質(zhì)體和柔紅霉素為原料制得。

上述PEI和GLU雙重修飾的靶向性柔紅霉素脂質(zhì)體中，所述PEI和GLU雙重修飾的靶向性柔紅霉素脂質(zhì)體的包封率大于90％。

本發(fā)明提供的制備所述PEI和GLU雙重修飾的靶向性柔紅霉素脂質(zhì)體的方法，該方法為以所述PEI和GLU雙重修飾的靶向性柔紅霉素脂質(zhì)體和鹽酸柔紅霉素的水溶液為原料制得；

該方法具體包括如下步驟：將所述PEI和GLU雙重修飾的靶向性柔紅霉素脂質(zhì)體和鹽酸柔紅霉素的水溶液于水浴中振蕩，得到所述PEI和GLU雙重修飾的靶向性柔紅霉素脂質(zhì)體。

上述方法中，所述鹽酸柔紅霉素和所述PEI和GLU雙重修飾的靶向性空白脂質(zhì)體的質(zhì)量比為1：10-100，具體為1：20；

所述振蕩步驟中，溫度為35-70℃，具體為60℃；

時(shí)間為10-45min，具體為20min。

另外，上述本發(fā)明提供的PEI和GLU雙重修飾的靶向性柔紅霉素脂質(zhì)體或靶向性香豆素脂質(zhì)體在制備真核生物腫瘤細(xì)胞增殖的抑制劑、制備真核生物腫瘤細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑、制備真核生物腫瘤細(xì)胞內(nèi)caspase 8和/或caspase 3活化誘導(dǎo)劑和提升真核生物腫瘤細(xì)胞的攝取中任意一種的應(yīng)用及所述PEI和GLU雙重修飾的靶向性柔紅霉素脂質(zhì)體在制備預(yù)防和/或治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用，也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍；

其中，所述真核生物具體為哺乳動物；所述腫瘤細(xì)胞具體為癌細(xì)胞；所述癌細(xì)胞具體為腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞，更具體為鼠源C6細(xì)胞或腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞；

所述腫瘤具體為腦膠質(zhì)瘤，更具體為腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞。

本發(fā)明中制備了一種脂質(zhì)-葡萄糖衍生物的功能性載體材料DSPE-PEG₂₀₀₀-GLU，并采用該種功能性載體材料修飾載藥脂質(zhì)體，使其能夠經(jīng)由葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)的方式跨越血腦屏障并靶向腫瘤細(xì)胞。

本發(fā)明將DSPE-PEG₂₀₀₀-GLU化合物作為靶向性分子修飾于載藥脂質(zhì)體表面，能夠使藥物有效通過血腦屏障，選擇性聚集于腫瘤細(xì)胞，產(chǎn)生靶向作用。比如，使C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞及腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞在低糖環(huán)境下對藥物的攝取比率顯著提高，使藥物對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞表現(xiàn)為更強(qiáng)的生長抑制作用，使藥物顯示出更強(qiáng)的跨越血腦屏障、殺傷腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的效應(yīng)，即雙重靶向性作用，可延長藥物在ICR小鼠體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間和在腫瘤組織中的聚集程度，從而延長生物的生存期。本發(fā)明的這些特性使得本發(fā)明較現(xiàn)有發(fā)明具有優(yōu)越性。

附圖說明

圖1為本發(fā)明DSPE-PEG₂₀₀₀-GLU化合物的合成路線。

圖2為GLU,DSPE-PEG₂₀₀₀-NHS和DSPE-PEG₂₀₀₀-GLU結(jié)合物的¹H NMR圖譜。

圖3為PEI₆₀₀、GLU雙重修飾的的柔紅霉素脂質(zhì)體的粒徑分布。

圖4為柔紅霉素從PEI₆₀₀、GLU雙重修飾的的柔紅霉素脂質(zhì)體、GLU修飾的靶向性柔紅霉素脂質(zhì)體和柔紅霉素脂質(zhì)體的體外釋放率結(jié)果。

圖5為腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞在低糖環(huán)境下對GLU修飾的靶向性柔紅霉素脂質(zhì)體的攝取情況。

圖6為PEI₆₀₀、GLU雙重修飾的的靶向性香豆素脂質(zhì)體和GLU修飾的靶向性香豆素脂質(zhì)體與腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體GLUT 1的靶向性效應(yīng)。

圖7為柔紅霉素脂質(zhì)體、GLU修飾的靶向性柔紅霉素脂質(zhì)體和PEI₆₀₀、GLU雙重修飾的的靶向性柔紅霉素脂質(zhì)體對腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的抑制作用。

圖8(A)為BMVEC/腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞共培養(yǎng)模型；(B)為柔紅霉素脂質(zhì)體、GLU修飾的靶向性柔紅霉素脂質(zhì)體和PEI₆₀₀、GLU雙重修飾的靶向性柔紅霉素脂質(zhì)體在跨越血腦屏障后對腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的生長抑制情況。(a)柔紅霉素脂質(zhì)體；(b)PEI修飾的靶向性柔紅霉素脂質(zhì)體；(c)GLU修飾的靶向性柔紅霉素脂質(zhì)體；(d)功能靶向性柔紅霉素脂質(zhì)體。

圖9柔紅霉素脂質(zhì)體、GLU修飾的靶向性柔紅霉素脂質(zhì)體和PEI₆₀₀、GLU雙重修飾的的靶向性柔紅霉素脂質(zhì)體對細(xì)胞內(nèi)凋亡蛋白Caspase 3、Caspase 8、Bax和Mcl 1的表達(dá)情況進(jìn)行測定的熒光圖譜。(A)腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞內(nèi)Caspase 3,Caspase 8和Bax在高內(nèi)涵系統(tǒng)下的表達(dá)情況的熒光圖像。(B)Caspase 3的活性比率；(C)Caspase 8的活性比率；(D)Bax的活性比率；(E)Mcl 1的活性比率.(1)空白培養(yǎng)基；(2)柔紅霉素脂質(zhì)體；(3)PEI修飾的靶向性柔紅霉素脂質(zhì)體；(4)GLU修飾的靶向性柔紅霉素脂質(zhì)體；(5)功能靶向性柔紅霉素脂質(zhì)體。

圖10(A)為DiR標(biāo)記的GLU修飾的靶向性脂質(zhì)體和PEI₆₀₀、GLU雙重修飾的的靶向性脂質(zhì)體在腦膠質(zhì)瘤荷瘤ICR小鼠體內(nèi)的分布和腫瘤蓄積能力；(B)為尾靜脈注射游離DiR、DiR脂質(zhì)體、GLU修飾的靶向性DiR脂質(zhì)體和PEI₆₀₀、GLU雙重修飾的的靶向性DiR脂質(zhì)體在ICR小鼠體內(nèi)48h后，解剖出心、肝、脾、肺、腎和荷瘤腦組織的體外成像結(jié)果。(a)DiR脂質(zhì)體；(b)PEI修飾的靶向性DiR脂質(zhì)體；(c)GLU修飾的靶向性DiR脂質(zhì)體；(d)PEI₆₀₀、GLU雙重修飾的DiR脂質(zhì)體；(e)游離DiR。

圖11腦膠質(zhì)瘤荷瘤小鼠在腫瘤接種并接受各個(gè)制劑組治療后的卡普蘭-邁耶生存曲線。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。所述方法如無特別說明均為常規(guī)方法。所述原材料如無特別說明均能從公開商業(yè)途徑獲得。

二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇-N-琥珀酰亞胺(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphatidylethanolamine-polyethyleneglycol₂₀₀₀-N-hydroxysuccin-imide，DSPE-PEG₂₀₀₀-NHS)，購自日本油脂株式會社(日本NOF公司)，產(chǎn)品目錄號為M139522。

4-氨基苯基-β-D-葡萄糖苷(4-Aminophenylβ-D-glucopyranoside，GLU)，購自美國Sigma-Aldrich公司，產(chǎn)品目錄號為012M4005V。

二甲基甲酰胺(Dimethylformamide，DMF)，購自美國Acros Organics公司，產(chǎn)品目錄號為1339870。

蛋黃卵磷脂(EPC)購自日本油脂株式會社，產(chǎn)品目錄號為108057-3。

膽固醇購自北京市海淀區(qū)微生物培養(yǎng)基制品廠，批號20020106。

DSPE-PEG₂₀₀₀購自日本油脂株式會社，產(chǎn)品目錄號M86563。

下述實(shí)施例所用DSPE-PEG₂₀₀₀-PEI₆₀₀化合物中，重復(fù)結(jié)構(gòu)單元a和b的連接方式不固定，可為各種連接方式。

具體的，所述DSPE-PEG₂₀₀₀-PEI₆₀₀化合物，可為依次由重復(fù)結(jié)構(gòu)單元a、重復(fù)結(jié)構(gòu)單元b及端基-NH₂連接而成的聚合物。

該化合物的制備方法包括如下步驟：將20μmolPEI₆₀₀(x為0-15，y為1-10)和20μmol式III所示化合物DSPE-PEG₂₀₀₀-NHS溶解在4ml無水DMF中，將反應(yīng)液混合物在室溫、氬氣保護(hù)下用磁力攪拌器輕輕攪拌24h進(jìn)行取代反應(yīng)，反應(yīng)完畢得到粗產(chǎn)物，繼而將粗產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到再生纖維素透析袋(截留分子量2500)，在去離子水中透析48h，除去未反應(yīng)的PEI和DMF溶劑。接下來將反應(yīng)液凍干，得到干燥白色粉末，在-20℃條件下保存。

實(shí)施例1、式I所示化合物功能靶向性載體材料DSPE-PEG₂₀₀₀-GLU的合成與表征

將3mg式II所示化合物GLU和3mg式III所示化合物DSPE-PEG₂₀₀₀-NHS溶解在0.5ml無水DMF中，將反應(yīng)液混合物在室溫、避光、氬氣保護(hù)下用磁力攪拌器輕輕攪拌進(jìn)行取代反應(yīng)48h，反應(yīng)完畢得到粗產(chǎn)物，繼而將粗產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到再生纖維素透析袋(截留分子量2000)，在去離子水中透析48h，除去未反應(yīng)的GLU和DMF溶劑。接下來將反應(yīng)液凍干，得到干燥白色粉末式I所示產(chǎn)物，在-20℃條件下保存。

該產(chǎn)物的合成路線如圖1所示。

反應(yīng)產(chǎn)物采用核磁共振氫譜(¹H NMR)進(jìn)行檢測驗(yàn)證反應(yīng)目標(biāo)產(chǎn)物的存在。¹H NMR使用氘代二甲基亞砜(DMSO)為溶劑，使用4-甲基硅烷(TMS，δ＝0ppm)進(jìn)行定標(biāo)。圖2為GLU、DSPE-PEG₂₀₀₀-NHS和DSPE-PEG₂₀₀₀-GLU分子的¹H NMR譜圖。如圖所示，GLU及DSPE-PEG₂₀₀₀-NHS分子的特征峰都可在反應(yīng)產(chǎn)物DSPE-PEG₂₀₀₀-GLU的¹H NMR譜圖中找到?？梢?，所得產(chǎn)物結(jié)構(gòu)正確，為目標(biāo)產(chǎn)物。

實(shí)施例2、脂質(zhì)體的制備與表征

1)GLU修飾的靶向性空白脂質(zhì)體的制備

a、精密稱取卵磷脂(EPC)、膽固醇(CHOL)、DSPE-PEG₂₀₀₀-GLU、DSPE-PEG₂₀₀₀按摩爾比63:32.5:4:0.5于茄形瓶中，加入適量氯仿溶解，然后在40℃水浴、40rpm轉(zhuǎn)速下通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)減壓干燥除去有機(jī)試劑，在茄形瓶底部及內(nèi)壁形成一層薄薄的均勻脂膜；

b、向步驟1)所得脂膜中加入適量250mM硫酸銨溶液水化：先在水浴中超聲5min，超聲能量為100W，至形成乳白色均勻的粗脂質(zhì)體后轉(zhuǎn)移到JY92-IID型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)中進(jìn)一步超聲(設(shè)置超聲工作時(shí)間為10s，間歇時(shí)間為10s，全程時(shí)間為10min，保護(hù)溫度為35℃，功率為200W)。超聲結(jié)束后粗脂質(zhì)體逐漸形成帶有微弱藍(lán)色熒光的半透明液體，然后將其依次擠壓通過孔徑為400nm，200nm的聚碳酸酯膜各3次。擠壓后，將脂質(zhì)體混懸液裝入透析袋(截留分子量10,000-12,000Da)，在HBS緩沖溶液中(151mM NaCl,25.2mM Hepes,PBS pH 7.4)透析24小時(shí)，每8小時(shí)更換一次透析液，共三次，得到GLU修飾的靶向性空白脂質(zhì)體。

2)GLU修飾的靶向性柔紅霉素脂質(zhì)體的制備

采用硫酸銨梯度法，將柔紅霉素包載入功能靶向性空白脂質(zhì)體的內(nèi)水相中制得柔紅霉素脂質(zhì)體。具體步驟包括：

將鹽酸柔紅霉素以一定的濃度溶解在蒸餾水中，將該鹽酸柔紅霉素的水溶液與步驟1)所得GLU修飾的的靶向性空白脂質(zhì)體分別在60℃水浴中預(yù)熱，然后按照藥脂比(也即鹽酸柔紅霉素和GLU修飾的靶向性空白脂質(zhì)體的質(zhì)量比)1：20，將該鹽酸柔紅霉素的水溶液加入到步驟1)所得GLU修飾的靶向性空白脂質(zhì)體的水溶液中，在60℃空氣浴恒溫培養(yǎng)振蕩器里振搖20min，得到本發(fā)明提供的GLU修飾的靶向性柔紅霉素脂質(zhì)體。

3)PEI₆₀₀、GLU雙重修飾的靶向性空白脂質(zhì)體的制備

a、精密稱取卵磷脂(EPC)、膽固醇(CHOL)、實(shí)施例1所得化合物DSPE-PEG₂₀₀₀-GLU、式I1所示化合物DSPE-PEG₂₀₀₀-PEI₆₀₀按摩爾比63：32.5：4：0.5于茄形瓶中，加入適量氯仿溶解，然后在40℃水浴、40rpm轉(zhuǎn)速下通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)減壓干燥除去有機(jī)試劑，在茄形瓶底部及內(nèi)壁形成一層薄薄的均勻脂膜；

b、向步驟1)所得脂膜中加入適量250mM硫酸銨溶液水化：先在水浴中超聲5min，至形成乳白色均勻的粗脂質(zhì)體后轉(zhuǎn)移到JY92-IID型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)中進(jìn)一步超聲(設(shè)置超聲工作時(shí)間為10s，間歇時(shí)間為10s，全程時(shí)間為10min，保護(hù)溫度為35℃，功率為200W)。超聲結(jié)束后粗脂質(zhì)體逐漸形成帶有微弱藍(lán)色熒光的半透明液體，然后將其通過孔徑為400nm的聚碳酸酯膜3次后，再通過孔徑為200nm的聚碳酸酯膜3次后，

將脂質(zhì)體混懸液裝入透析袋(截留分子量10,000-12,000Da)，在HBS緩沖溶液中(151mM NaCl,25.2mM Hepes,PBS pH 7.4)透析24小時(shí)，每8小時(shí)更換一次透析液，共三次，得到PEI₆₀₀、GLU雙重修飾的靶向性空白脂質(zhì)體。

4)PEI₆₀₀、GLU雙重修飾的靶向性柔紅霉素脂質(zhì)體的制備

采用硫酸銨梯度法，將柔紅霉素包載入PEI₆₀₀、GLU雙重修飾的靶向性空白脂質(zhì)體的內(nèi)水相中制得柔紅霉素脂質(zhì)體。具體步驟包括：

將鹽酸柔紅霉素以一定的濃度溶解在蒸餾水中，將該鹽酸柔紅霉素的水溶液與步驟3)所得PEI₆₀₀、GLU雙重修飾的靶向性空白脂質(zhì)體分別在60℃水浴中預(yù)熱，然后按照藥脂比(也即鹽酸柔紅霉素和步驟3)所得PEI₆₀₀、GLU雙重修飾的靶向性空白脂質(zhì)體的質(zhì)量比)1：20，將該鹽酸柔紅霉素的水溶液加入到步驟3)所得PEI₆₀₀、GLU雙重修飾的靶向性空白脂質(zhì)體的水溶液中，在60℃空氣浴恒溫培養(yǎng)振蕩器里振搖20min，得到本發(fā)明提供的PEI₆₀₀、GLU雙重修飾的靶向性柔紅霉素脂質(zhì)體。

5)脂質(zhì)體的表征

取步驟3)所得PEI₆₀₀、GLU雙重修飾的靶向性空白脂質(zhì)體500μl通過SephadexG-50葡聚糖凝膠柱，以HBS緩沖溶液(151mM NaCl,25.2mM Hepes,PBS pH 7.4)為流動相預(yù)飽和葡聚糖凝膠柱。

之后取載藥脂質(zhì)體(柔紅霉素脂質(zhì)體、GLU修飾的靶向性柔紅霉素脂質(zhì)體和PEI₆₀₀、GLU雙重修飾的靶向性柔紅霉素脂質(zhì)體)500μl通過Sephadex G-50葡聚糖凝膠柱，以HBS緩沖溶液為流動相分離未包進(jìn)脂質(zhì)體的游離柔紅霉素，收集分離后的脂質(zhì)體，加入九倍體積甲醇破壞，并用流動相稀釋后，用上述高效液相色譜法(HPLC)進(jìn)行測定。

取未過凝膠柱的載藥脂質(zhì)體(柔紅霉素脂質(zhì)體、GLU修飾的靶向性柔紅霉素脂質(zhì)體和PEI₆₀₀、GLU雙重修飾的靶向性柔紅霉素脂質(zhì)體)原液，加入九倍體積甲醇破壞，并用流動相稀釋相同倍數(shù)后，用上述高效液相色譜法進(jìn)行測定。采用下面的公式對柔紅霉素的包封率進(jìn)行計(jì)算：包封率(％)＝過凝膠柱分離后脂質(zhì)體中的藥物含量/未過凝膠柱脂質(zhì)體中的藥物含量×100％。藥物濃度用對照品法(比較一點(diǎn)法)計(jì)算，即得。

分別取新制得的脂質(zhì)體加入PBS稀釋載藥脂質(zhì)體至1ml，混合均勻后，使用Nano Series Zen 4003ZetaSizer(Malvern instruments,Ltd,UK)測定脂質(zhì)體的粒徑、多分散度和Zeta電位。

將柔紅霉素脂質(zhì)體、GLU修飾的靶向性柔紅霉素脂質(zhì)體和PEI₆₀₀、GLU雙重修飾的靶向性柔紅霉素脂質(zhì)體在含血清蛋白的釋放介質(zhì)(含10％胎牛血清的PBS緩沖液)中進(jìn)行體外釋放實(shí)驗(yàn)。取2ml脂質(zhì)體，加入2ml釋放介質(zhì)混勻后放入透析袋(分子截留量為10,000-12,000Da)內(nèi)，兩端扎緊后將透析袋置于10.0ml釋放介質(zhì)中，在37℃、100rpm的條件下在搖床上振蕩。分別于0，0.25，0.5，1，2，4，6和24h時(shí)取出0.2ml釋放介質(zhì)，并每次取樣后立即補(bǔ)入同等體積的新釋放介質(zhì)。取出的各份樣品用九倍體積甲醇進(jìn)行破壞稀釋，使蛋白溶解，高速離心，再用濾膜過膜，除去大分子蛋白，用HPLC進(jìn)行檢測，測定各樣品中各樣品的峰面積，用其線性回歸曲線換算得到相應(yīng)濃度。然后計(jì)算出各個(gè)樣品在不同時(shí)刻的釋放量，進(jìn)而得到其在某一時(shí)刻的累積釋放量。

各種脂質(zhì)體的體外釋放率分別用下列公式計(jì)算：體外釋放率(％)＝第i時(shí)間點(diǎn)釋放液中藥物的量/與透析體積相同的透析前脂質(zhì)體溶液中藥物的量×100％。

6)脂質(zhì)體的表征結(jié)果

柔紅霉素脂質(zhì)體、GLU修飾的靶向性柔紅霉素脂質(zhì)體和PEI₆₀₀、GLU雙重修飾的靶向性柔紅霉素脂質(zhì)體的藥物包封率、粒徑、多分散系數(shù)和Zeta電位的表征結(jié)果如表1所示。

表1脂質(zhì)體的包封率、粒徑及Zeta電位表征

數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式(n＝3)。

結(jié)果顯示，上述脂質(zhì)體的平均粒徑在100nm左右，分布均一。柔紅霉素在三種脂質(zhì)體中的包封率均大于94％。三種脂質(zhì)體的Zeta電位均呈負(fù)電性。

圖3為PEI₆₀₀、GLU雙重修飾的靶向性柔紅霉素脂質(zhì)體的粒徑分布情況，可見該脂質(zhì)體粒徑100nm左右，粒徑均一，分散度良好。

圖4為柔紅霉素從PEI₆₀₀、GLU雙重修飾的靶向性柔紅霉素脂質(zhì)體、GLU修飾的靶向性柔紅霉素脂質(zhì)體和柔紅霉素脂質(zhì)體的體外釋放率結(jié)果。選擇含10％胎牛血清的PBS緩沖液作為釋放介質(zhì)是為了模擬動物體內(nèi)的血液環(huán)境，更加客觀地模擬載藥脂質(zhì)體經(jīng)靜脈注射后在血液循環(huán)過程中的釋放。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，柔紅霉素從各種脂質(zhì)體中的釋放率，在最初的2h內(nèi)，釋放率均低于5％，在第24h，PEI₆₀₀、GLU雙重修飾的靶向性柔紅霉素脂質(zhì)體、GLU修飾的靶向性柔紅霉素脂質(zhì)體和柔紅霉素脂質(zhì)體的體外累積釋放率分別為9.98±3.37％、6.49±0.73％及9.87±3.04％。

實(shí)施例3、脂質(zhì)體的體內(nèi)外藥效實(shí)驗(yàn)

(1)細(xì)胞攝取情況

圖5腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞在低糖環(huán)境下對GLU修飾的靶向性柔紅霉素脂質(zhì)體的攝取情況。流式細(xì)胞儀測定結(jié)果以柱狀圖表示，相對于在低葡萄糖濃度(1g/L)的環(huán)境下，腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞在低糖環(huán)境及正常葡萄糖濃度(4.5g/L)環(huán)境下對GLU修飾的靶向性柔紅霉素脂質(zhì)體的攝取率分別為1.00±0.01和1.27±0.02，即在低糖環(huán)境下，腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞對GLU修飾的靶向性柔紅霉素脂質(zhì)體的攝取量顯著高于正常葡萄糖濃度環(huán)境。

(2)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體GLUT 1靶向性效應(yīng)

圖6為各制劑組在腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中的亞細(xì)胞共定位激光共聚焦顯微圖象。如圖所示，在共聚焦顯微鏡下，各含香豆素?zé)晒馓结樀闹苿┙M呈綠色熒光，由抗體染色后的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體GLUT 1呈紅色熒光，細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光。在熒光疊加的圖中，黃色熒光為綠色和紅色熒光的組合，表示制劑與葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體GLUT 1的共定位。結(jié)果顯示，在GLU修飾的靶向性香豆素脂質(zhì)體組和PEI₆₀₀、GLU雙重修飾的靶向性香豆素脂質(zhì)體組中，可以觀察到最明顯的黃色熒光，而香豆素脂質(zhì)體組中則沒有顯示黃色熒光。

(3)對腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的抑制效應(yīng)

圖7所示為柔紅霉素脂質(zhì)體、GLU修飾的靶向性柔紅霉素脂質(zhì)體和PEI₆₀₀、GLU雙重修飾的靶向性柔紅霉素脂質(zhì)體對腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的抑制作用。PEI₆₀₀、GLU雙重修飾的靶向性柔紅霉素脂質(zhì)體和GLU修飾的靶向性柔紅霉素脂質(zhì)體與柔紅霉素脂質(zhì)體相比，均對腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞表現(xiàn)為更強(qiáng)的生長抑制作用。

(4)體外跨越血腦屏障后對腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的殺傷效應(yīng)

建立BMVEC/腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞共培養(yǎng)模型，如圖8A所示，并用于GLU修飾的靶向性柔紅霉素脂質(zhì)體和PEI₆₀₀、GLU雙重修飾的靶向性柔紅霉素脂質(zhì)體的體外跨越血腦屏障后對腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的殺傷效應(yīng)(雙重靶向性效應(yīng))評價(jià)。柔紅霉素脂質(zhì)體、GLU修飾的靶向性柔紅霉素脂質(zhì)體和PEI₆₀₀、GLU雙重修飾的靶向性柔紅霉素脂質(zhì)體在跨越血腦屏障后對腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的生長抑制情況見圖8B。結(jié)果顯示，腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的存活率分別為：PEI₆₀₀、GLU雙重修飾的靶向性柔紅霉素脂質(zhì)體(45.85±0.51％)，GLU修飾的柔紅霉素脂質(zhì)體(67.04±1.72％)，以及柔紅霉素脂質(zhì)體(72.96±2.78％)。PEI₆₀₀、GLU雙重修飾的靶向性柔紅霉素脂質(zhì)體和GLU修飾的靶向性柔紅霉素脂質(zhì)體，與柔紅霉素脂質(zhì)體制劑組相比，顯示出更強(qiáng)的跨越血腦屏障、殺傷腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的效應(yīng)，即雙重靶向性作用。

(5)對腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡效應(yīng)與機(jī)制

圖9A所示為腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞在給以柔紅霉素脂質(zhì)體、GLU修飾的靶向性柔紅霉素脂質(zhì)體和PEI₆₀₀、GLU雙重修飾的靶向性柔紅霉素脂質(zhì)體6小時(shí)后，采用高內(nèi)涵篩選系統(tǒng)對細(xì)胞內(nèi)凋亡蛋白Caspase 3、Caspase 8和Bax的表達(dá)情況進(jìn)行測定的熒光圖譜。圖中綠色熒光的強(qiáng)度代表細(xì)胞內(nèi)凋亡蛋白表達(dá)的量，結(jié)果顯示，凋亡蛋白酶Caspase 3、Caspase 8和促凋亡蛋白Bax均在給藥孵育后而呈現(xiàn)表達(dá)量提高的趨勢，其中GLU修飾的靶向性柔紅霉素脂質(zhì)體制劑組和PEI₆₀₀、GLU雙重修飾的靶向性柔紅霉素脂質(zhì)體制劑組較柔紅霉素脂質(zhì)體呈現(xiàn)更高的表達(dá)量。

腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞在給以柔紅霉素脂質(zhì)體、GLU修飾的靶向性柔紅霉素脂質(zhì)體和PEI₆₀₀、GLU雙重修飾的靶向性柔紅霉素脂質(zhì)體6小時(shí)后，采用高內(nèi)涵篩選系統(tǒng)對細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)信號通路的蛋白Caspase 3、Caspase 8、Bax和Mcl 1的表達(dá)情況進(jìn)行測定，相應(yīng)的蛋白活性比率的數(shù)值以柱形圖的形式體現(xiàn)。如圖9B、C、D&E所示，空白培養(yǎng)基、柔紅霉素脂質(zhì)體、GLU修飾的靶向性柔紅霉素脂質(zhì)體和PEI₆₀₀、GLU雙重修飾的靶向性柔紅霉素脂質(zhì)體給藥后，腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中凋亡蛋白酶Caspase 8的活性比率分別為1.00±0.03，1.01±0.04，1.08±0.04，1.18±0.03(圖9B)；凋亡蛋白酶Caspase 3的活性比率分別為1.00±0.01，1.07±0.01，1.14±0.01，1.24±0.01(圖9C)；促凋亡蛋白Bax的活性比率分別為1.00±0.01，1.01±0.02，1.02±0.04，1.09±0.03(圖9D)；抗凋亡蛋白Mcl 1的活性比率分別為1.00±0.01，0.97±0.01，0.94±0.02，0.92±0.02(圖9E)。

(6)在荷瘤小鼠體內(nèi)的分布情況

DiR標(biāo)記的GLU修飾的靶向性脂質(zhì)體和DiR標(biāo)記的PEI₆₀₀、GLU雙重修飾的靶向性脂質(zhì)體在腦膠質(zhì)瘤荷瘤ICR小鼠體內(nèi)的分布和腫瘤蓄積能力如圖10所示。圖10(A)為尾靜脈注射游離DiR、DiR脂質(zhì)體、GLU修飾的靶向性DiR脂質(zhì)體和PEI₆₀₀、GLU雙重修飾的靶向性DiR脂質(zhì)體后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)下ICR小鼠體內(nèi)的熒光分布；圖10(B)為尾靜脈注射游離DiR、DiR脂質(zhì)體、GLU修飾的靶向性DiR脂質(zhì)體和PEI₆₀₀、GLU雙重修飾的靶向性DiR脂質(zhì)體在ICR小鼠體內(nèi)48h后，解剖出心、肝、脾、肺、腎和荷瘤腦組織的體外成像結(jié)果。

從圖10(A)中可以看出，尾靜脈注射GLU修飾的靶向性DiR脂質(zhì)體和PEI₆₀₀、GLU雙重修飾的靶向性DiR脂質(zhì)體后1h時(shí)，可以在ICR小鼠體內(nèi)觀察到強(qiáng)烈的DiR熒光信號，而且在腫瘤組織48h仍可觀察到強(qiáng)烈的熒光信號。相反，尾靜脈注射游離DiR熒光染料后，在ICR小鼠體內(nèi)觀察到的DiR熒光信號較弱且持續(xù)時(shí)間較短，腦組織沒有觀察到明顯的熒光信號，且熒光信號主要蓄積于肝臟和腎臟內(nèi)。離體組織研究結(jié)果圖10(B)表明，兩種靶向性脂質(zhì)體均在腦腫瘤組織部位有明顯的聚集。結(jié)果表明，尾靜脈注射GLU修飾的靶向性DiR脂質(zhì)體和PEI₆₀₀、GLU雙重修飾的靶向性DiR脂質(zhì)體可延長藥物在ICR小鼠體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間和在腫瘤組織中的聚集程度，可在腫瘤組織觀察到最強(qiáng)的熒光信號。

(7)在荷瘤小鼠體內(nèi)的分布情況

圖11為腦膠質(zhì)瘤荷瘤小鼠在腫瘤接種并接受各個(gè)制劑組治療后的卡普蘭-邁耶生存曲線。從腫瘤接種后第14天開始給藥，柔紅霉素按4.5mg/kg體重給藥量，每3-4天給藥1次，連續(xù)給藥四次，每組7只考察生存曲線。觀察腦膠質(zhì)瘤荷瘤小鼠模型的行為狀態(tài)，記錄小鼠活動狀況、癥狀、死亡日期，繪制卡普蘭-邁耶生存曲線。結(jié)果如圖所示，腦膠質(zhì)瘤荷瘤小鼠在接受生理鹽水、柔紅霉素脂質(zhì)體、GLU修飾的靶向性柔紅霉素脂質(zhì)體、PEI₆₀₀、GLU雙重修飾的靶向性柔紅霉素脂質(zhì)體和柔紅霉素游離藥的治療后，中位生存期分別為29、32、36、56和27天。結(jié)果表明，與對照制劑相比，GLU修飾的靶向性柔紅霉素脂質(zhì)體和PEI₆₀₀、GLU雙重修飾的靶向性柔紅霉素脂質(zhì)體能夠顯著性提高對腦膠質(zhì)瘤荷瘤小鼠腦腫瘤的治療作用。