本發(fā)明屬于生物有機(jī)肥料生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種有機(jī)肥發(fā)酵菌劑的制備及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

我國(guó)農(nóng)業(yè)由于化肥的長(zhǎng)期使用，已造成肥效下降，利用率不高，土壤板結(jié)、連作障礙嚴(yán)重等弊端，同時(shí)由于化肥的利用率只有35--40％，其余部分被土壤固定，或淋溶造成水體污染等環(huán)境問題。為了解決上述問題，專家們迫切呼吁減少化肥使用量，多使用新型生物肥，多施有機(jī)肥，廣大農(nóng)民也迫切需要一種新型肥料來滿足農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的需要。歐洲一些國(guó)家生物肥料的施用量已占農(nóng)業(yè)用肥總量的45％～60％，美國(guó)的施用量更高達(dá)60-70％。在我國(guó)，若生物肥能占到化肥使用量的10％，其市場(chǎng)容量將達(dá)到1400萬(wàn)噸?，F(xiàn)在我國(guó)生物有機(jī)肥料的年產(chǎn)量不足20萬(wàn)噸，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)需求。同時(shí)，隨著工農(nóng)業(yè)的發(fā)展，工業(yè)廢棄物、城市污泥、垃圾、畜禽糞便的產(chǎn)生量與日俱增。我國(guó)是中藥資源消耗大國(guó)，由此產(chǎn)生了大量的中藥藥渣，2007年全國(guó)中藥渣的年排放量達(dá)3000萬(wàn)噸，如江蘇省中藥渣的年排放量已達(dá)100萬(wàn)噸，僅南京六大中藥制藥廠年排放量達(dá)10萬(wàn)多噸；而2011年貴州百靈藥業(yè)股份有限公司年產(chǎn)中藥渣為3萬(wàn)噸；云南兩家生產(chǎn)三七皂苷藥廠每年就產(chǎn)生15萬(wàn)噸的藥渣。目前這些中藥渣主要當(dāng)作生活垃圾進(jìn)行填埋或者堆放，這不僅占用了大量的土地資源，污染了土地及地下水，而且還造成資源的浪費(fèi)。中藥大多是由植物的根、莖、葉、花、實(shí)、皮，以及禽獸的肢體、臟器、外殼組成，還有部分屬于礦物質(zhì)，它含有豐富的有機(jī)物和無機(jī)物質(zhì)。提取有效成分后的藥渣，一般含大量的粗纖維、粗脂肪、淀粉、粗多糖、粗蛋白、氨基酸、生物堿及微量元素等，因此，中藥渣是一種優(yōu)質(zhì)的有機(jī)肥料。

有機(jī)肥發(fā)酵生產(chǎn)需要通過微生物將植物殘?bào)w中的纖維素、半纖維素、木質(zhì)素、蛋白質(zhì)等大分子有機(jī)物快速分解，提高發(fā)酵堆體溫度，促進(jìn)有機(jī)物料的礦質(zhì)化，形成作物可直接吸收利用的速效養(yǎng)分。目前堆肥接種的微生物大都屬于中溫性的微生物菌劑，微生物的數(shù)量和種類對(duì)有機(jī)肥發(fā)酵過程起著非常重要和關(guān)鍵性的作用，發(fā)酵菌劑的選擇是生物有機(jī)肥生產(chǎn)的關(guān)鍵。目前應(yīng)用的微生物種類有地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、煙曲霉、酵母菌、木霉菌、熱性纖維素分解細(xì)菌、光合放線菌、細(xì)菌、乳酸菌等多種微生物。

地衣芽孢桿菌是一種極具潛力的益生菌，可產(chǎn)生內(nèi)生芽抱，耐熱抗逆性強(qiáng)，在土壤和植物表面普遍存在。地衣芽孢桿菌能產(chǎn)生各種活性酶，如纖維素酶、淀粉酶、蛋白質(zhì)酶等，能夠分解植物中的有機(jī)物，促進(jìn)植物有機(jī)物料的礦質(zhì)化；分泌活性物質(zhì)，促進(jìn)植物的生長(zhǎng)；產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，用于防治植物和動(dòng)物病害等。目前地衣芽孢桿菌被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)藥、食品、飼料加工、環(huán)境污染治理等各個(gè)行業(yè)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于：提供一種能將中藥渣發(fā)酵成有機(jī)肥的地衣芽孢桿菌Bacillus licheniformis KCDS-1(該菌株已于2015年9月16日包藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址為北京市朝陽(yáng) 區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏編號(hào)為CGMCC NO.11380)；提供一種地衣芽孢桿菌Bacillus licheniformis KCDS-1生產(chǎn)的微生物菌劑及其制備方法；提供了一種將牲畜糞便、秸稈、廚余垃圾發(fā)酵成有機(jī)肥的地衣芽孢桿菌Bacillus licheniformis KCDS-1。

地衣芽孢桿菌微生物菌劑的制備方法，包括如下步驟：

(1)菌種的活化：將低溫保存的KCDS-1菌株接種牛肉浸膏平板培養(yǎng)基上，并在26～30℃下培養(yǎng)15-20小時(shí)，然后挑取單菌落接種于LB斜面培養(yǎng)基上，并在26～30℃下培養(yǎng)15-20小時(shí)，再用無菌水洗滌培養(yǎng)基表面，其洗脫液作為接種液，其濃度為1.0～7.5×10⁶；

(2)種子液的制備：按照0.5～4％比例(體積百分比)向牛肉浸膏液體培養(yǎng)基中接入步驟(1)制備的接種液，并在26～32℃下震蕩培養(yǎng)15～21小時(shí)，得種子液，其濃度為1.0～7.5×106。

(3)發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟(2)所得種子液0.05～1％比例(體積百分比)接入玉米淀粉培養(yǎng)基中，再在26～32℃、搖床轉(zhuǎn)速為150～200rpm的條件下培養(yǎng)30～40小時(shí)。

其中玉米淀粉培養(yǎng)基中各成分的比例為：玉米淀粉0.2～0.4％、大豆蛋白粉1.0～2.0％、玉米漿2～4％、MnSO4 0.05～0.15％、K2HPO4 0.2～0.4％、KH2PO4 0.1～0.2％、MgSO4 0.02～0.10％、FeSO4 0.01～0.02％、CaCO30.01～0.02％、pH 6.0～7.0。

本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

實(shí)例1

微生物菌劑的制備，按照如下步驟進(jìn)行：

1、菌株分離

(1)樣品處理：將丹參大田土壤樣品混合均勻并碾碎后過60目篩，收集篩下樣品。

(2)在赫奇遜培養(yǎng)基平板上按一定間距放置滅菌后的濾紙條，用赫奇遜液體培養(yǎng)基將濾紙條潤(rùn)濕。

(3)在濾紙一端放過篩后的土壤樣品，樣品量約1～3g，樣品在濾紙上直徑不超過濾紙寬度。然后置于26～30℃培養(yǎng)箱中。

(4)2～4天后觀察濾紙的變化，直到濾紙有顏色變化或明顯被腐解時(shí)，將變色或腐爛濾紙取出。

(5)在無菌條件下將有顏色變化或被腐解的部分切下接于蛋白胨纖維素培養(yǎng)基平板上。

(6)等蛋白胨纖維素培養(yǎng)基平板上長(zhǎng)出細(xì)菌時(shí)用劃線法在羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基平板上劃線分離，將長(zhǎng)出真菌的菌塊同樣接種于羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基平板上。

(7)將純化的單菌落細(xì)菌或單一真菌接種于羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基斜面進(jìn)行保存。

2、實(shí)驗(yàn)菌株的纖維分解能力試驗(yàn)

(1)將試驗(yàn)細(xì)菌接種于NA培養(yǎng)基上26～30℃培養(yǎng)，將試驗(yàn)真菌接于PDA上23～27℃培養(yǎng)。

(2)在赫奇遜培養(yǎng)基平板上按一定間距放置滅菌后的濾紙條，用赫奇遜液體培養(yǎng)基將濾紙條潤(rùn)濕。

(3)在濾紙一端接種培養(yǎng)好的細(xì)菌或真菌菌塊，細(xì)菌置于26～30℃、真菌置于23～27℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

(4)2-4天后觀察濾紙的變化，觀察濾紙是否有顏色變化或明顯被腐解。

3、菌株活化

挑取在4℃冰箱里的NA斜面培養(yǎng)基上保存的菌種，接種到的NA斜面培養(yǎng)基上，在26～30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～20h。

4、種子準(zhǔn)備

分別在已經(jīng)活化的菌株的試管中加入無菌水3-7mL，振蕩制成菌懸液，接入各相應(yīng)已經(jīng)提前配置好的NA三角瓶液體培養(yǎng)基中。每菌株接種一個(gè)三角瓶，在26～30℃，150～200rpm搖床上振蕩培養(yǎng)16～20h。

5、發(fā)酵培養(yǎng)條件的研究

(1)最佳培養(yǎng)時(shí)間的測(cè)定

按3-8％的接種量將種子培養(yǎng)液接入到液體培養(yǎng)基中(150mL/500mLNA液體培養(yǎng)基)，26～30℃，150～200rpm搖床振蕩培養(yǎng)36h。分別在0h，12h，15h，18h，21h，24h，27h，30h，36h時(shí)從3個(gè)重復(fù)中取出適量菌液，用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定培養(yǎng)液中的總活菌數(shù)，結(jié)果表明當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為15～20h時(shí)，菌株KCDS-1菌所產(chǎn)生的菌量最大；然后隨著培養(yǎng)時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，菌體量呈下降趨勢(shì)。綜上確定菌株KCDS-1菌可能的最佳培養(yǎng)時(shí)間為15～20h。

(2)菌株最佳培養(yǎng)溫度的測(cè)定

按5％的接種量將種子培養(yǎng)液接入到液體培養(yǎng)培養(yǎng)基中(150mL/500mLNA液體培養(yǎng)基)，在150～200rpm搖床振蕩培養(yǎng)15～20h。設(shè)置的溫度梯度為26℃，28℃，30℃，32℃。在培養(yǎng)終點(diǎn)用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定培養(yǎng)液中的總活菌數(shù)。結(jié)果表明在發(fā)酵時(shí)間為15h，同時(shí)其他條件恒定的情況下，在所設(shè)定的溫度范圍內(nèi)(28℃，30℃，32℃，34℃，36℃)菌株KCDS-1菌可能的最佳的發(fā)酵溫度為31～33℃。

(3)初始pH對(duì)菌株液體培養(yǎng)的影響

將NA液體培養(yǎng)基的初始pH分別調(diào)節(jié)為5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，按5％的接種量將的種子培養(yǎng)液接入到初始pH不同的各液體培養(yǎng)基中(150mL/500mLNA液體培養(yǎng)基)，在26～30℃，150～200rpm搖床振蕩培養(yǎng)15-20h。測(cè)定培養(yǎng)終點(diǎn)pH，用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定菌液的總活菌數(shù)。結(jié)果表明初始pH為6.0～7.0，菌株KCDS-1菌都較多。

(4)搖瓶不同裝液量對(duì)菌株液體培養(yǎng)的影響

在500mL三角瓶中分別裝入50mL，100mL，150mL，200mLNA液體培養(yǎng)基，按5％的接種量將KCDS-1菌的種 子培養(yǎng)液接入到液體培養(yǎng)基中，在26～30℃，150～200rpm搖床振蕩培養(yǎng)15～20h。在液體培養(yǎng)終點(diǎn)用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定菌液的總活菌數(shù)。結(jié)果表明在150～200rpm的搖床轉(zhuǎn)速下，150～200mL/500mL的裝液量能夠較好的滿足菌體生長(zhǎng)過程中對(duì)氧的需求，作為最佳的裝液量標(biāo)準(zhǔn)。

(5)搖床轉(zhuǎn)速對(duì)菌株液體培養(yǎng)的影響

按5％的接種量將KCDS-1菌的種子培養(yǎng)液接入到液體培養(yǎng)基中(200mL/500mLNA液體培養(yǎng)基)，在26～30℃搖床上振蕩培養(yǎng)15-20h。設(shè)置的搖床轉(zhuǎn)速為靜置(0rpm)，100rpm，150rpm，200rpm，250rpm轉(zhuǎn)速。在液體培養(yǎng)終點(diǎn)用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定培養(yǎng)液中的總活菌數(shù)。結(jié)果表明當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為100～150rpm時(shí)，菌株的產(chǎn)量最高，因此確定最佳搖床轉(zhuǎn)速為100～150rpm。

(6)接種量對(duì)菌株液體培養(yǎng)的影響

將培養(yǎng)好的KCDS-1種子液按0.5％、1％、2％、4％、8％的接種量接種到NA培養(yǎng)基中，在26～30℃，100～150rpm搖床上振蕩培養(yǎng)15h。在液體培養(yǎng)終點(diǎn)用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定培養(yǎng)液中的總活菌數(shù)。結(jié)果表明其中以4％接種量下所產(chǎn)生的菌量最多，高接種量或低接種量都不利于菌體的形成。

實(shí)例2

應(yīng)用地衣桿菌將苦參渣發(fā)酵成有機(jī)肥，其步驟如下：

(1)將發(fā)酵液分別按吸附比例(發(fā)酵液∶吸附劑＝1∶1～1.5)進(jìn)行吸附、干燥，得到固體物質(zhì)，吸附劑為麥麩∶稻糠為1∶1～1.5。

(2)將步驟(1)得到的固體物質(zhì)與尿素、魚粉進(jìn)行混合，混合比例為菌劑固體物∶尿素∶魚粉為60～70∶7∶25。

(3)將300公斤～500公斤的藥渣攤平(藥渣的濕度為55％～60％)，撒上步驟(2)得到的菌劑，弄工具將藥渣和菌劑拌勻。拌好后將藥渣堆成圓錐形，寬1～2米，高1～2米，不能低于0.8米，上面蓋上塑料薄膜，發(fā)酵時(shí)間10～20天，當(dāng)藥渣原料為變成褐色或黑褐色，濕時(shí)用手握之柔軟有彈性，干時(shí)很脆容易破碎，完成發(fā)酵。發(fā)酵后的藥渣，經(jīng)過干燥、粉碎處理，成為實(shí)用的中藥渣有機(jī)肥。。

通過上述步驟獲得的苦參渣有機(jī)肥營(yíng)養(yǎng)成分為：全氮為33.0(g/kg)、全磷為10.46(g/kg)、全鉀為10.46(g/kg)、全銅為15.03(mg/kg)、全鋅為65.87(mg/kg)、全鐵為2237.5(mg/kg)、全錳為166.57(mg/kg)、全鈣為5.38(g/kg)全鎂為2.69(g/kg)、有機(jī)質(zhì)為88.6(％)。

實(shí)例3

應(yīng)用地衣桿菌將生脈飲渣發(fā)酵成有機(jī)肥，其步驟如下：

(1)將發(fā)酵液分別按吸附比例(發(fā)酵液∶吸附劑＝1∶1)進(jìn)行吸附、干燥，得到固體物質(zhì)，吸附劑為麥麩∶稻糠為1∶1。

(2)將步驟(1)得到的固體物質(zhì)與尿素、魚粉進(jìn)行混合，混合比例為菌劑固體物∶尿素∶魚粉為 60～70∶7∶25。

(3)將300公斤～500公斤的藥渣攤平(藥渣的濕度為55％～60％)，撒上步驟(2)得到的菌劑，弄工具將藥渣和菌劑拌勻。拌好后將藥渣堆成圓錐形，寬1-～2米，高1～2米，不能低于0.8米，上面蓋上塑料薄膜，發(fā)酵時(shí)間10～20天，當(dāng)藥渣原料為變成褐色或黑褐色，濕時(shí)用手握之柔軟有彈性，干時(shí)很脆容易破碎，完成發(fā)酵。發(fā)酵后的藥渣，經(jīng)過干燥、粉碎處理，成為實(shí)用的中藥渣有機(jī)肥。

通過上述步驟獲得的苦參渣有機(jī)肥營(yíng)養(yǎng)成分為：全氮為32.6(g/kg)、全磷為2.81(g/kg)、全鉀為11.45(g/kg)、全銅為17.78(mg/kg)、全鋅為74.77(mg/kg)、全鐵為1438.2(mg/kg)、全錳為182.64(mg/kg)、全鈣為6.32(g/kg)、全鎂為2.67(g/kg)、有機(jī)質(zhì)為77.0(％)。

實(shí)例4

應(yīng)用地衣桿菌將秸稈發(fā)酵成有機(jī)肥，其步驟如下：

(1)將發(fā)酵液分別按吸附比例(發(fā)酵液∶吸附劑＝1∶1～2)進(jìn)行吸附、干燥，得到固體物質(zhì)，吸附劑為麥麩∶稻糠為1∶1～2。

(2)將步驟(1)得到的固體物質(zhì)與尿素、魚粉進(jìn)行混合，混合比例為菌劑固體物∶尿素∶魚粉為60～70∶7∶25。

(3)將300公斤～500公斤的秸稈粉碎后攤平(秸稈的濕度為55％～60％)，撒上步驟(2)得到的菌劑，弄工具將秸稈和菌劑拌勻。拌好后將藥渣堆成圓錐形，寬1～2米，高1～2米，不能低于0.8米，上面蓋上塑料薄膜，發(fā)酵時(shí)間10～20天，當(dāng)藥渣原料為變成褐色或黑褐色，濕時(shí)用手握之柔軟有彈性，干時(shí)很脆容易破碎，完成發(fā)酵。發(fā)酵后的藥渣，經(jīng)過干燥、粉碎處理，成為實(shí)用的秸稈有機(jī)肥。。

通過上述步驟獲得的秸稈有機(jī)肥營(yíng)養(yǎng)成分為：全氮為83.6(g/kg)、全磷為5.65(g/kg)、全鉀為14.25(g/kg)、全銅為3.98(mg/kg)、全鋅為64.26(mg/kg)、全鐵為376.4(mg/kg)、全錳為47.34(mg/kg)、全鈣為18.32(g/kg)、全鎂為12.67(g/kg)、有機(jī)質(zhì)為80.19(％)。

附圖說明

圖1是時(shí)間對(duì)培養(yǎng)液含菌量的影響

圖2是溫度對(duì)培養(yǎng)液含菌量的影響

圖3是初始pH對(duì)培養(yǎng)液含菌量的影響

圖4是裝液量對(duì)培養(yǎng)液含菌量的影響

圖5是轉(zhuǎn)速對(duì)培養(yǎng)液含菌量的影響

圖6是接種量對(duì)培養(yǎng)液含菌量的影響。