專利名稱：一種蠅蛆甲殼素、殼聚糖的制備工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，一種蠅蛆甲殼素、殼聚糖的制備工藝及其在誘導(dǎo)深綠木酶T2菌株產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
甲殼素(Chitin)又名幾丁質(zhì)、甲殼質(zhì)、殼多糖、聚乙酰氨基葡萄糖等，化學(xué)名為1， 4-2-乙酰氨基-2-脫氧-β-D-葡聚糖，是N-乙?；?D-葡萄糖胺(GlcNAc)以β_1，4鍵結(jié)合而成的直鏈多聚物(C16H2601(lN2)n。廣泛存在于甲殼綱動物蝦、蟹的甲殼、昆蟲的甲殼、真菌(酵母，霉菌)、藻類及植物的細(xì)胞壁中。殼聚糖(Chitosan)則是甲殼素脫去C2乙?；漠a(chǎn)物，又名甲殼胺、脫乙酰甲殼素、可溶性甲殼素、聚葡萄糖胺等，化學(xué)名為聚(1，4)-2-氨基_2_脫氧-B-D-匍萄糖。
目前國內(nèi)甲殼素和殼聚糖的生產(chǎn)主要集中在沿海城市，大多以蝦、蟹殼為原料，以蠅蛆為原料獲取甲殼素和殼聚糖 的甚少。由于來源不同，蠅蛆甲殼素和殼聚糖的獲取在工藝條件上與蝦、蟹殼同類物質(zhì)的獲取是有差異的，而目前提取蠅蛆甲殼素和殼聚糖所用方法幾乎是完全的套用以蝦、蟹殼為原料的提取工藝。這種以濃酸濃堿制備甲殼素和殼聚糖的方法，不僅成本高、能耗大、產(chǎn)品品質(zhì)差，而且會造成嚴(yán)重的環(huán)境污染。
木霉菌(Trichoderma spp.)是最有開發(fā)利用潛力因而最受關(guān)注的一類植物病害生物防治微生物，產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶是其主要生防作用機(jī)制之一。木霉分泌產(chǎn)生的一系列細(xì)胞壁降解酶，如葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶、纖維素酶、蛋白酶等起著重要的作用，其中以幾丁質(zhì)酶尤為重要。目前以對哈茨木霉幾丁質(zhì)酶研究最為深入。據(jù)報道木霉幾丁質(zhì)酶在非誘導(dǎo)條件下表達(dá)量很少，而在誘導(dǎo)條件下大量產(chǎn)生，其中內(nèi)切幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生較多，并表現(xiàn)出極高的抑菌活性。關(guān)于不同營養(yǎng)條件對哈茨木霉、哈茨木霉TM菌株、哈茨木霉PI菌株幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生的誘導(dǎo)效果國內(nèi)外已有報道，而且誘導(dǎo)產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶粗提物對多種病原真菌均有顯著的拮抗活性。有關(guān)利用蠅蛆甲殼素(幾丁質(zhì))和蠅蛆殼聚糖(脫乙酰幾丁質(zhì)多糖)對深綠木霉 T2菌株產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶影響的研究尚未見報道。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提出一種蠅蛆甲殼素、殼聚糖的制備工藝，解決了以濃酸濃堿制備甲殼素和殼聚糖的傳統(tǒng)工藝中存在的成本高、能耗大、產(chǎn)品品質(zhì)差，而且會造成嚴(yán)重的環(huán)境污染的缺點(diǎn)。
本發(fā)明的另一個目的是提出一種蠅蛆甲殼素在誘導(dǎo)深綠木酶T2菌株產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶中的應(yīng)用。
實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下一種蠅蛆甲殼素的制備工藝，以蠅蛆為原料制成粉體，經(jīng)除鈣、除蛋白質(zhì)、氧化及還原處理后制得甲殼素，所述除鈣過程采用EDTA除鈣法。進(jìn)一步地，蠅蛆甲殼素的制備工藝，具體包括如下步驟
(1)原料預(yù)處理
將干蠅蛆粉碎,用水沖洗,洗去大量的蛋白質(zhì)成分,將剩余蛆皮過濾收集備用；
(2)EDTA 除鈣
稱取步驟(I)制得的清潔、干燥的蠅蛆蛆皮，用飽和EDTA溶液浸泡20 30h，除去鈣質(zhì),后過濾除去EDTA，并將蛆皮用水洗至中性；
(3)稀喊除蛋白質(zhì)
將步驟(2)處理過的蛆皮再用8 12% NaOH水溶液，沸水浴1. 5 3h，以水解蛋白質(zhì)，加熱期間不斷攪拌，且期間至少更換4次堿液，加熱結(jié)束，除去堿液，水洗至中性，得到甲殼素粗品；
(4)精制制得成品
將步驟(3)制得的甲殼素粗品，用O. 3 O. 8% KMnO4水溶液浸潰氧化20 60min，水洗除盡KMnO4后，再用O. 5 1. 5%草酸水溶液于60 70°C下，攪拌進(jìn)行脫色反應(yīng)待產(chǎn)物變白為止，將產(chǎn)物水洗至中性，陰干，得白色片狀甲殼素。采用上述制備工藝制得的蠅蛆甲殼素為原料來制備殼聚糖，其制備工藝包括如下步驟
(1)脫乙酰反應(yīng)
將精制的蠅蛆甲殼素與35 45%的NaOH-戊醇溶液混合均勻，置于700 900W微波爐中，以95%功率的微波條件進(jìn)行脫乙酰反應(yīng)，處理2次，每次2 3min，中途過濾更換NaOH-戊醇混合液一次；
(2)稀酸溶解
步驟(I)的反應(yīng)結(jié)束后，用熱水洗滌產(chǎn)物至中性，再用甲醇浸泡洗滌后，將濕品溶于4 6%醋酸溶液中，過濾除去不溶物；
(3)制得成品
將步驟(2)制得的產(chǎn)物再用8 12%的NaOH溶液中和，析出膠體物，離心洗滌至中性，真空干燥，研細(xì)，得到白色殼聚糖粉末。本發(fā)明還提供了蠅蛆甲殼素在誘導(dǎo)深綠木酶T2菌株產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶中的應(yīng)用，以蠅蛆甲殼素為碳源，最佳產(chǎn)酶時間為120h。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果
(I)在蠅蛆甲殼素的制備工藝中，將傳統(tǒng)的鹽酸除鈣工藝改為EDTA除鈣，減少了廢酸排放的環(huán)境污染，避免了濃酸對甲殼素分子鏈的破壞，獲得了高品質(zhì)的甲殼素產(chǎn)品。(2)在蠅蛆殼聚糖的制備工藝中，將高溫濃堿回流4h的傳統(tǒng)工藝改為氫氧化鈉-戊醇反應(yīng)體系，并采用微波加熱處理兩次，提高了堿液利用率，極大的縮短了反應(yīng)時間，節(jié)約了能源消耗。獲得了含水量低，脫乙酰度較高的白色粉末狀殼聚糖產(chǎn)品。(3)本發(fā)明的蠅蛆甲殼素、殼聚糖的優(yōu)化制備工藝及蠅蛆甲殼素在誘導(dǎo)深綠木霉T2菌株產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶中的應(yīng)用，可以通過下述試驗(yàn)得到進(jìn)一步的說明。I材料方法1.1蠅蛆甲殼素和殼聚糖優(yōu)化后的制備工藝流程
權(quán)利要求
1.一種利用蠅蛆甲殼素制備殼聚糖的工藝，其中，所述蠅蛆甲殼素的制備是以蠅蛆為原料制成粉體，經(jīng)EDTA除鈣、除蛋白質(zhì)、氧化及還原處理后制得甲殼素，具體包括如下步驟(1)原料預(yù)處理將干蠅蛆粉碎，用水沖洗，洗去大量的蛋白質(zhì)成分，將剩余蛆皮過濾收集備用；(2) EDTA除鈣稱取步驟(I)制得的清潔、干燥的蠅蛆蛆皮，用飽和EDTA溶液浸泡 20 30h，除去鈣質(zhì)，后過濾除去EDTA，并將蛆皮用水洗至中性；(3)稀堿除蛋白質(zhì)將步驟 (2)處理過的蛆皮再用8 12% NaOH水溶液，沸水浴1. 5 3h，以水解蛋白質(zhì)，加熱期間不斷攪拌，且期間至少更換4次堿液，加熱結(jié)束，除去堿液，水洗至中性，得到甲殼素粗品；(4) 精制制得成品將步驟(3)制得的甲殼素粗品，用O. 3 O. 8% KMnO4水溶液浸潰氧化20 60min,水洗除盡KMnO4后，再用O. 5 1. 5%草酸水溶液于60 70°C下，攪拌進(jìn)行脫色反應(yīng)待產(chǎn)物變白為止，將產(chǎn)物水洗至中性，陰干，得白色片狀甲殼素；其特征在于，包括如下步驟(1)脫乙酰反應(yīng)將精制的蠅蛆甲殼素與35 45%的NaOH-戊醇溶液混合均勻，置于700 900W微波爐中，以95%功率的微波條件進(jìn)行脫乙酰反應(yīng)，處理2次，每次2 3min，中途過濾更換 NaOH-戊醇混合液一次；(2)稀酸溶解步驟(I)的反應(yīng)結(jié)束后，用熱水洗滌產(chǎn)物至中性，再用甲醇浸泡洗滌后，將濕品溶于 4 6%醋酸溶液中，過濾除去不溶物；(3)制得成品將步驟(2)制得的產(chǎn)物再用8 12%的NaOH溶液中和，析出膠體物，離心洗滌至中性， 真空干燥，研細(xì)，得到白色殼聚糖粉末。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蠅蛆甲殼素、殼聚糖的制備工藝及蠅蛆甲殼素在誘導(dǎo)深綠木霉T2菌株產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶中的應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。其中蠅蛆甲殼素的制備工藝主要是將傳統(tǒng)的鹽酸除鈣工藝改為EDTA除鈣，減少了廢酸排放的環(huán)境污染，避免了濃酸對甲殼素分子鏈的破壞，獲得了高品質(zhì)的甲殼素產(chǎn)品；在蠅蛆殼聚糖的制備工藝中，將高溫濃堿回流4h的傳統(tǒng)工藝改為氫氧化鈉-戊醇反應(yīng)體系，并采用微波加熱處理兩次，提高了堿液利用率，極大的縮短了反應(yīng)時間，節(jié)約了能源消耗，獲得了含水量低，脫乙酰度較高的白色粉末狀殼聚糖產(chǎn)品。本發(fā)明的蠅蛆甲殼素還可以作為碳源，誘導(dǎo)深綠木霉T2菌株產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶，其誘導(dǎo)效果顯著。
文檔編號C08B37/08GK102993334SQ20121050240
公開日2013年3月27日 申請日期2010年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月30日
發(fā)明者梁巧蘭, 徐秉良, 師桂英, 魏列新, 薛應(yīng)鈺, 楊順義, 宋文勇 申請人:甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)